CN109668868B - 一种植物组织硅分布的固相荧光显微检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于植物组织检测技术领域，公开了一种植物组织硅分布的固相荧光显微检测方法。其主要技术特征为：该方法包括制取片状试材、浓硫酸软化处理片状试材、纯水清洗浓硫酸、制备氯化锌溶液、氯化锌溶液浸泡处理片状试材、氯化钡覆盖处理片状试材、荧光显微镜观察片状试材几个步骤。本发明所提供的一种植物组织硅分布的固相荧光显微检测方法，将硅酸锌的荧光特性应用于硅的组织化学定位，将氯化钡的物理化学特性用于灰化过程中的灰相固定。该方法对实验条件、药剂浓度、处理时间的要求都不严格，适于具有倒置荧光显微镜和马弗炉基础条件的实验室开展工作。
Description
技术领域
本发明属于植物组织检测技术领域，尤其涉及一种植物组织硅分布的固相荧光显微检测方法。
背景技术
植物生长过程中需要的16种必须元素中，没有硅元素。但是，在地壳中，硅是仅次于氧的第二丰富的元素，构成地壳总质量的26.4%。
硅不参与生命代谢。但作为高丰度元素，植物普遍含硅。植物在蒸腾作用下，将土壤中溶解的硅以单硅酸形式吸收，随水分蒸腾，留下硅在体内以二氧化硅的形式沉积到细胞内和细胞壁上。依据植物的硅含量，可将植物分为喜硅、中硅和低硅植物，禾本科作物如水稻、小麦、玉米、甘蔗、高粱等，是最重要的全球性粮食作物，而作为肉类主要来源的饲草，也大部分属于禾本科饲草。禾本科的一个特性是硅含量高。多年研究认为，硅作为细胞壁的主要成分之一，可使之生长健壮，抗逆性强，生长迅速，喜硅作物对硅吸收选择性小，吸硅量可作为耗水量评估指标。南方部分稻田缺硅造成减产，北方温室蒸腾量低造成植物缺硅，施用硅肥可以有效减少硅缺乏症状。
硅的含量和分布是农业领域重要的测试指标。基于湿化学法的硅含量提取（碱溶解法）和测定（如钼蓝比色法）已经广泛应用于研究领域，如品种间比较、生育期比较和不同器官的比较等，但是，在组织细胞水平，研究硅分布和含量比较，目前还没有成熟、可靠的方法。
已报道的硅的组织定位方法有如下缺陷：
1、整体性不好。目前常采用干灰化法观察硅的显微结构，灰的重要成分为硅（二氧化硅）和一些金属氧化物，通过烧尽有机物，可以在显微镜下观察到大小、形态不同的灰白色硅植体，但在燃烧过程中，植物组织排列形态很难保持，此方法仅能观察硅细胞的结晶形态，不易观察硅的分布特点，仅可用于石细胞类的形态观察，对含量不高的组织无法进行硅定位。
2、专一性差。在不破坏分布结构的情况下，硅与细胞壁的纤维素、半纤维素、木质素相互吸附，难以区分，显色方法专一性差。
2.1硅的铬酸胺银显色法。材料经湿灰化（硫酸处理），除去部分有机物覆盖物，暴露出的携带羟基的硅酸盐固体可吸附银胺复合物的铵（氨），脱铵的的铬酸银（暗红色）可覆盖到硅酸盐表面，使硅显现暗红色，而其余部分显黄色。如果湿灰化完全，则组织结构难以维持，如果湿灰化程度太小，硅酸盐在有其他物质包裹的情况下显色不完全，有羟基的纤维素等也会有干扰。另外，本实验室的实验表明，在上述条件优化的情况下，因铬酸银颗粒较大，无法精细显示硅酸盐的分布。
2.2 硅的偏光显微镜观察：利用硅酸盐具有双折射的原理，可在不破坏组织结构的前提下观察到硅的分布，含纤维状物质（如细胞壁）、淀粉等与硅伴生的具有双折射物质，对观测有干扰。
2.3荧光探针法：
PDMPO（2-(4-pyridyl)-5-{(4-(2-dimethylaminoethylaminocarbamoyl)-methoxy)phenyl}oxazole）是为一款pH探针，多聚硅酸的羟基使PDMPO结构发生变化，在pH3-7范围内，在338nm波长激发下，发出蓝色荧光，可用于硅酸盐的细胞检测。其缺点是试剂昂贵，且供货不稳定。
2.4 甲基红法。用甲基红的苯饱和溶液，可将经乙醇脱水并转苯的试材染色，染色液本底呈橙黄色，硅呈现亮红色至绿色。
硅酸锌是自然界的一种矿物，在紫外线照射下可发出黄色荧光。通过添加不同金属，会产生不同颜色的荧光，人工合成的硅酸锌在早期应用于荧光灯和显示器的荧光粉。
发明内容
本发明要解决的技术问题就是提供一种植物组织硅分布的固相荧光显微检测方法。
为解决上述问题，本发明采用的技术方案包括下列步骤：一种植物组织硅分布的固相荧光显微检测方法，其特征在于，该方法包括下列步骤：
第一步，制取片状试材
采集叶片或茎秆，叶片或茎秆的表面进行擦拭或水洗，去掉叶片或茎秆表面可干扰实验的灰尘，将叶片或茎秆徒手横切片或纵切段，做成厚度小于1毫米、长宽小于石英载玻片长宽的片状试材；
第二步，浓硫酸软化处理片状试材
将片状试材设置在石英载玻片上，向片状试材滴加浓硫酸，浓硫酸均布在片状试材上后，室温下平放石英载玻片4-24小时，至片状试材基本透明，以消化有机物，减少灰化时气体的扰动；
第三步，纯水清洗浓硫酸
趁纤维未完全消失，将石英载玻片稍微倾斜，使石英载玻片一端高一端低，用塑料滴管在石英载玻片高端滴加纯水，纯水稀释石英载玻片上的浓硫酸后形成液体，在石英载玻片低端吸走液体，重复滴加纯水至液体呈中性，消除盐类结晶对观察视野的影响；
第四步，制备氯化锌溶液
在通风橱中，将40毫升-60毫升浓盐酸置塑料烧杯中，将剪成细条状的锌片放入浓盐酸，注意通风和降温，不断加入锌片，至不再产生气泡，且部分锌片不再溶解为止，制成氯化锌溶液；
第五步，氯化锌溶液浸泡处理片状试材
平放石英载玻片，将氯化锌溶液用塑料滴管滴加在经浓硫酸软化处理的片状试材上，保持1-2小时；用吸水纸蘸尽多余液体，盖上另外一片石英载玻片，70-80℃温度下干燥23-25小时；
第六步，氯化钡覆盖处理片状试材
取出石英载玻片，小心将两片石英载玻片分开，将粉状氯化钡覆盖到粘有片状试材的石英载玻片上，材料较大较厚时，加一片石英载玻片压住，以防片状试材卷曲；将粘有片状试材的石英载玻片设置在马弗炉中，以120℃温度下1-2小时、200℃温度下1-2小时、300℃温度下1-2小时、500℃温度下1-2小时、720℃温度下3-4小时程序升温，然后自然冷却；
第七步，荧光显微镜观察片状试材
将粘有片状试材的石英载玻片由马弗炉取出，使石英载玻片粘有片状试材的一面向上，放置到倒置的荧光显微镜上，用绿色荧光模块观察植物组织硅分布。
本发明所提供的一种植物组织硅分布的固相荧光显微检测方法，是在借鉴已有方法的优缺点和工业荧光粉制造原理的基础上，经过多年实验对比，以稳定、简便、专一性强为目标，筛选出了硫酸软化-氯化锌浸泡-干燥-氯化钡覆盖-干灰化-荧光观察的实验流程，重点之一是将硅酸锌的荧光特性应用于硅的组织化学定位，工业上用硅+氯化锌+硫酸锰做荧光粉，本发明用这个方法做硅织定位；重点之二是将氯化钡的物理化学特性用于灰化过程中的灰相固定。氯化钡覆盖经化学处理的试材，可防止灰化过程中因二氧化碳、水的溢出造成组织形态破坏，而保持原形态，氯化钡的筛选是经多种物质的物理化学性状对比和实验验证找出来的，如热温定性、熔点、沸点、分解温度、是否有干扰、比重大小、粒度、是否有荧光等。该方法对实验条件、药剂浓度、处理时间的要求都不严格，适于具有倒置荧光显微镜和马弗炉基础条件的实验室开展工作。
本发明所提供的一种植物组织硅分布的固相荧光显微检测方法，基于氯化锌可与硅酸高温固相合成具有荧光的硅酸锌的化学反应，用于植物组织硅的显微定位；利用氯化钡的易吸水、高熔点、比重高、与硅反应的产物硅酸钡无色无荧光无结晶、粉末细等物理化学特性，做为覆盖物，将灰化过程中产生的水、二氧化碳等气体导出，不扰动灰化组织，达到保护灰化相的目的。因灰化过程需要的温度高于普通玻璃溶解温度，普通载玻片有少量的荧光干扰，选择石英载玻片为自然做法。过程中提及的用浓硫酸消化部分有机物、用载玻片夹住材料低温烘干的过程，是尽量降低高温过程中溢出气体对灰相的扰动，为自然做法，如果材料体积很小，可以省略。因为材料含硅部分发荧光，所以使用荧光显微镜。荧光显微镜可安装多个荧光模块，而绿色荧光模块观察效果最佳，所以用绿色荧光模块。因为载玻片上的材料有氯化钡粉末覆盖，不能翻转，否则粉末就散落了，所以，只能从载玻片底部用荧光显微镜通过载玻片观察，因此倒置荧光显微镜。
本发明所提供的一种植物组织硅分布的固相荧光显微检测方法，采用绿色荧光模块，硅显现十分明亮的黄色荧光，可用于低分辨率大范围观察，如果氯化锌中溶入了少量锰盐，则硅显示绿色，亮度有所降低，但分布边界更加清晰，可用于高分辨率观察。氯化锌可以溶解硫酸未消化完的纤维素，暴露出硅酸盐，并与硅酸盐在高温下发生固态反应，产生具有荧光的硅酸锌，添加少量硫酸锰粉末可使荧光由黄变绿，硫酸锰添加量为氯化锌液体重量的0.1-1%，但硫酸锰为非必须添加的物质。检测过程中 不能及时处理的材料可在95%乙醇中保存。乙醇可促进组织脱水，有利于溶解态硅的沉积。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明一种植物组织硅分布的固相荧光显微检测方法做进一步详细说明。
实施例1
本发明提供的一种植物组织硅分布的固相荧光显微检测方法，包括下列步骤：
第一步，制取片状试材
采集叶片或茎秆，叶片或茎秆的表面进行擦拭或水洗，去掉叶片或茎秆表面可干扰实验的灰尘，将叶片或茎秆徒手横切片或纵切段，做成厚度小于1毫米、长宽小于石英载玻片长宽的片状试材；
第二步，浓硫酸软化处理片状试材
将片状试材设置在石英载玻片上，向片状试材滴加浓硫酸，浓硫酸均布在片状试材上后，室温下平放石英载玻片4小时，至片状试材基本透明，以消化有机物，减少灰化时气体的扰动；
第三步，纯水清洗浓硫酸
趁纤维未完全消失，将石英载玻片稍微倾斜，使石英载玻片一端高一端低，用塑料滴管在石英载玻片高端滴加纯水，纯水稀释石英载玻片上的浓硫酸后形成液体，在石英载玻片低端吸走液体，重复滴加纯水至液体呈中性，消除盐类结晶对观察视野的影响；
第四步，制备氯化锌溶液
在通风橱中，将40毫升浓盐酸置塑料烧杯中，将剪成细条状的锌片放入浓盐酸，注意通风和降温，不断加入锌片，至不再产生气泡，且部分锌片不再溶解为止，制成氯化锌溶液；
第五步，氯化锌溶液浸泡处理片状试材
平放石英载玻片，将氯化锌溶液用塑料滴管滴加在经浓硫酸软化处理的片状试材上，保持1小时；用吸水纸蘸尽多余液体，盖上另外一片石英载玻片，70-80℃温度下干燥23小时；
第六步，氯化钡覆盖处理片状试材
取出石英载玻片，小心将两片石英载玻片分开，将粉状氯化钡覆盖到粘有片状试材的石英载玻片上，材料较大较厚时，加一片石英载玻片压住，以防片状试材卷曲；将粘有片状试材的石英载玻片设置在马弗炉中，以120℃温度下1小时、200℃温度下1小时、300℃温度下1小时、500℃温度下1小时、720℃温度下3小时程序升温，然后自然冷却；
第七步，荧光显微镜观察片状试材
将粘有片状试材的石英载玻片由马弗炉取出，使石英载玻片粘有片状试材的一面向上，放置到倒置的荧光显微镜上，用绿色荧光模块观察植物组织硅分布。
实施例2
本发明提供的一种植物组织硅分布的固相荧光显微检测方法，包括下列步骤：
第一步，制取片状试材
采集叶片或茎秆，叶片或茎秆的表面进行擦拭或水洗，去掉叶片或茎秆表面可干扰实验的灰尘，将叶片或茎秆徒手横切片或纵切段，做成厚度小于1毫米、长宽小于石英载玻片长宽的片状试材；
第二步，浓硫酸软化处理片状试材
将片状试材设置在石英载玻片上，向片状试材滴加浓硫酸，浓硫酸均布在片状试材上后，室温下平放石英载玻片14小时，至片状试材基本透明，以消化有机物，减少灰化时气体的扰动；
第三步，纯水清洗浓硫酸
趁纤维未完全消失，将石英载玻片稍微倾斜，使石英载玻片一端高一端低，用塑料滴管在石英载玻片高端滴加纯水，纯水稀释石英载玻片上的浓硫酸后形成液体，在石英载玻片低端吸走液体，重复滴加纯水至液体呈中性，消除盐类结晶对观察视野的影响；
第四步，制备氯化锌溶液
在通风橱中，将50毫升浓盐酸置塑料烧杯中，将剪成细条状的锌片放入浓盐酸，注意通风和降温，不断加入锌片，至不再产生气泡，且部分锌片不再溶解为止，制成氯化锌溶液；
第五步，氯化锌溶液浸泡处理片状试材
平放石英载玻片，将氯化锌溶液用塑料滴管滴加在经浓硫酸软化处理的片状试材上，保持1.5小时；用吸水纸蘸尽多余液体，盖上另外一片石英载玻片，70-80℃温度下干燥24小时；
第六步，氯化钡覆盖处理片状试材
取出石英载玻片，小心将两片石英载玻片分开，将粉状氯化钡覆盖到粘有片状试材的石英载玻片上，材料较大较厚时，加一片石英载玻片压住，以防片状试材卷曲；将粘有片状试材的石英载玻片设置在马弗炉中，以120℃温度下1.5小时、200℃温度下1.5小时、300℃温度下1.5小时、500℃温度下1.5小时、720℃温度下3.5小时程序升温，然后自然冷却；
第七步，荧光显微镜观察片状试材
将粘有片状试材的石英载玻片由马弗炉取出，使石英载玻片粘有片状试材的一面向上，放置到倒置的荧光显微镜上，用绿色荧光模块观察植物组织硅分布。
实施例3
本发明提供的一种植物组织硅分布的固相荧光显微检测方法，包括下列步骤：
第一步，制取片状试材
采集叶片或茎秆，叶片或茎秆的表面进行擦拭或水洗，去掉叶片或茎秆表面可干扰实验的灰尘，将叶片或茎秆徒手横切片或纵切段，做成厚度小于1毫米、长宽小于石英载玻片长宽的片状试材；
第二步，浓硫酸软化处理片状试材
将片状试材设置在石英载玻片上，向片状试材滴加浓硫酸，浓硫酸均布在片状试材上后，室温下平放石英载玻片24小时，至片状试材基本透明，以消化有机物，减少灰化时气体的扰动；
第三步，纯水清洗浓硫酸
趁纤维未完全消失，将石英载玻片稍微倾斜，使石英载玻片一端高一端低，用塑料滴管在石英载玻片高端滴加纯水，纯水稀释石英载玻片上的浓硫酸后形成液体，在石英载玻片低端吸走液体，重复滴加纯水至液体呈中性，消除盐类结晶对观察视野的影响；
第四步，制备氯化锌溶液
在通风橱中，将60毫升浓盐酸置塑料烧杯中，将剪成细条状的锌片放入浓盐酸，注意通风和降温，不断加入锌片，至不再产生气泡，且部分锌片不再溶解为止，制成氯化锌溶液；
第五步，氯化锌溶液浸泡处理片状试材
平放石英载玻片，将氯化锌溶液用塑料滴管滴加在经浓硫酸软化处理的片状试材上，保持2小时；用吸水纸蘸尽多余液体，盖上另外一片石英载玻片，70-80℃温度下干燥25小时；
第六步，氯化钡覆盖处理片状试材
取出石英载玻片，小心将两片石英载玻片分开，将粉状氯化钡覆盖到粘有片状试材的石英载玻片上，材料较大较厚时，加一片石英载玻片压住，以防片状试材卷曲；将粘有片状试材的石英载玻片设置在马弗炉中，以120℃温度下2小时、200℃温度下2小时、300℃温度下2小时、500℃温度下2小时、720℃温度下4小时程序升温，然后自然冷却；
第七步，荧光显微镜观察片状试材
将粘有片状试材的石英载玻片由马弗炉取出，使石英载玻片粘有片状试材的一面向上，放置到倒置的荧光显微镜上，用绿色荧光模块观察植物组织硅分布。
本发明所提供的一种植物组织硅分布的固相荧光显微检测方法，不仅限于上述实施例，凡在本发明基础上所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (1)
1.一种植物组织硅分布的固相荧光显微检测方法，其特征在于，该方法包括下列步骤：
第一步，制取片状试材
采集叶片或茎秆，叶片或茎秆的表面进行擦拭或水洗，去掉叶片或茎秆表面可干扰实验的灰尘，将叶片或茎秆徒手横切片或纵切段，做成厚度小于1毫米、长宽小于石英载玻片长宽的片状试材；
第二步，浓硫酸软化处理片状试材
将片状试材设置在石英载玻片上，向片状试材滴加浓硫酸，浓硫酸均布在片状试材上后，室温下平放石英载玻片4-24小时，至片状试材透明，以消化有机物，减少灰化时气体的扰动；
第三步，纯水清洗浓硫酸
趁纤维未完全消失，将石英载玻片稍微倾斜，使石英载玻片一端高一端低，用塑料滴管在石英载玻片高端滴加纯水，纯水稀释石英载玻片上的浓硫酸后形成液体，在石英载玻片低端吸走液体，重复滴加纯水至液体呈中性，消除盐类结晶对观察视野的影响；
第四步，制备氯化锌溶液
在通风橱中，将40毫升-60毫升浓盐酸置塑料烧杯中，将剪成细条状的锌片放入浓盐酸，注意通风和降温，不断加入锌片，至不再产生气泡，且部分锌片不再溶解为止，制成氯化锌溶液；
第五步，氯化锌溶液浸泡处理片状试材
平放石英载玻片，将氯化锌溶液用塑料滴管滴加在经浓硫酸软化处理的片状试材上，保持1-2小时；用吸水纸蘸尽多余液体，盖上另外一片石英载玻片，70-80℃温度下干燥23-25小时；
第六步，氯化钡覆盖处理片状试材
取出石英载玻片，小心将两片石英载玻片分开，将粉状氯化钡覆盖到粘有片状试材的石英载玻片上，材料较大较厚时，加一片石英载玻片压住，以防片状试材卷曲；将粘有片状试材的石英载玻片设置在马弗炉中，以120℃温度下1-2小时、200℃温度下1-2小时、300℃温度下1-2小时、500℃温度下1-2小时、720℃温度下3-4小时程序升温，然后自然冷却；
第七步，荧光显微镜观察片状试材
将粘有片状试材的石英载玻片由马弗炉取出，使石英载玻片粘有片状试材的一面向上，放置到倒置的荧光显微镜上，用绿色荧光模块观察植物组织硅分布。
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