CN109666700B - 一种电荷遮蔽的还原环境响应性基因载体及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种电荷遮蔽的还原环境响应性基因载体及其制备方法，涉及纳米基因转运体制备领域，基因载体包括电中性或电负性的水溶性多糖、阳离子聚合物、带负电的基因和交联剂；电中性或电负性水溶性多糖与阳离子聚合物构成多糖基接枝交联聚合物，多糖基接枝交联聚合物与带负电的基因通过静电作用形成多层级自组装的基因载体，带负电的基因负载于基因载体内部，电中性或电负性水溶性多糖位于基因载体表面；本发明提供的制备方法绿色、无污染、产量高，合成高效便捷，得到的纳米粒子粒径均一，在50nm‑300nm之间，在肿瘤的基因编辑和免疫治疗应用方面具有广阔的前景。

Description

一种电荷遮蔽的还原环境响应性基因载体及其制备方法
技术领域
本发明涉及纳米基因转运体制备领域，尤其涉及一种电荷遮蔽的还原环境响应性基因载体及其制备方法。
背景技术
基因载体作为基因治疗的有力工具，一直是人们研究的热点。尤其在肿瘤治疗领域，纳米颗粒由于其纳米尺度，可基于EPR效应被靶向定位到肿瘤位置，因此是肿瘤治疗基因载体的首选。纳米粒子容易通过细胞膜进入细胞，能够有效负载和保护抗肿瘤治疗基因进入细胞并在细胞内释放，提高运送效率和生物利用度。
目前的基因载体可分为病毒载体和非病毒载体，其中主要的非病毒基因载体有阳离子脂质体、阳离子聚合物等。常见的阳离子聚合物基因载体如聚乙烯亚胺(PEI)和聚赖氨酸(PLL)等，它们的工作原理是通过静电作用将带负电的基因压缩并形成纳米颗粒，然后通过细胞内吞机制将基因运输到细胞内。然而阳离子聚合物由于其表面携带的正电荷，在体循环过程中会与带负电的血细胞结合而增加凝血风险，同时阳离子载体在体循环中还很容易被网状内皮系统清除，从而限制了其临床应用。因此，如何屏蔽基因载体表面的正电荷是提高阳离子聚合物基因载体安全性的重要手段之一。另一方面，基因载体内部的阳离子聚合物和基因静电凝聚体对基因的有效包封及可控释放对于实现基因在细胞内部的释放和有效表达非常关键，研究表明，相比正常组织，肿瘤细胞内还原性物质积聚，如谷胱甘肽(glutathione，GSH)的浓度最高可达2-20mM。因此，设计一种在正常生理环境中保持稳定，而在细胞内还原环境下降解，从而实现基因在细胞内部的释放和有效表达的基因载体对于其实际应用具有重要意义。
因此，本领域的技术人员致力于开发一种电荷遮蔽的还原环境响应性基因载体。
发明内容
有鉴于现有技术的上述缺陷，本发明所要解决的技术问题是现有阳离子聚合物基因载体由于其携带的正电荷而导致的细胞毒性及不稳定性，并且不能在细胞内还原环境的影响下分解从而释放出包封在内部的基因。
为实现上述目的，本发明提供了一种基因载体，其实现了对阳离子聚合物正电荷的遮蔽，同时该基因载体内部存在还原环境敏感的二硫键的交联，能够在还原环境下降解，使得基因在细胞内部释放和有效表达，在肿瘤的基因编辑和免疫治疗应用方面具有广阔的前景。
在一个具体实施方式中，基因载体包括多糖、阳离子聚合物、基因和交联剂；多糖为电中性或电负性的水溶性多糖，所述电中性或电负性水溶性多糖与所述阳离子聚合物构成多糖基接枝交联聚合物，所述多糖基接枝交联聚合物与所述基因通过静电作用形成基因载体，所述基因负载于基因载体内部，所述电中性或电负性水溶性多糖位于基因载体表面。
进一步地，交联剂具有还原环境响应性的二硫键。
另一方面，本发明还提供了一种制备上述基因载体的方法，在一个具体实施方式中，包括以下步骤：
(1)制备电中性或电负性水溶性多糖的水溶液，惰性气体保护下加入引发剂，搅拌混匀；
(2)加入阳离子单体或溶于溶剂的阳离子单体，搅拌混匀；
(3)加入还原环境敏感的交联剂，惰性气体保护下进行聚合及交联反应；
(4)透析处理，冷冻干燥得到接枝交联聚合物；
(5)得到的接枝交联聚合物与基因混合，通过静电作用力形成静电凝聚体，即基因载体。
进一步地，步骤(1)中的引发剂为硝酸铈铵。
进一步地，步骤(1)中的电中性或电负性水溶性多糖为葡聚糖、海藻酸、水溶性淀粉、羧甲基葡聚糖、羧甲基纤维素、透明质酸、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素和普鲁兰多糖中的一种或多种。
进一步地，步骤(2)中的阳离子单体为甲基丙烯酸二乙氨基乙酯(cas:924-99-2)、甲基丙烯酸二乙基氨基乙酯(cas:105-16-8)、甲基丙烯酸二甲氨乙酯(cas:2867-47-2)、丙烯酸二甲氨基乙酯(cas:2439-35-2)、丙烯酸N,N-二乙基氨基乙酯(cas:2426-54-2)、2-甲基-2-丙烯酸2-(4-吗啉基)乙基酯(cas:2997-88-8)、丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵(cas:44992-01-0)、甲基丙烯酸2-氨基乙基酯盐酸盐(cas:2420-94-2)、甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵(cas:5039-78-1)中的一种或多种。
进一步地，步骤(3)中的还原环境敏感的交联剂为二烯丙基二硫、L-胱氨酸双丙烯酰胺、双丙烯酰胱胺或双(2-甲基丙烯酰氧基乙基)二硫醚中的一种或多种。
进一步地，步骤(5)中的基因为质粒、siRNA、microRNA、piRNA、circleRNA和lncRNA中的一种或多种。
进一步地，惰性气体为氮气。
另一方面，本发明还提供了一种对上述基因载体进行功能修饰的方法，在一个具体实施方式中，通过共价键或非共价键将蛋白或多肽或功能化合物结合到接枝交联聚合物上，或结合到水溶性多糖的羧基上，再进一步聚合形成接枝交联聚合物。
进一步地，功能修饰使用的化学偶联基团为EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)、NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)、SPDP(3-(2-吡啶二巯基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯)和SMCC(琥珀酰亚胺-4-(N-马来酰亚胺)环已烷-1-1羟酸酯)中的一种或多种。
本发明一方面为了同时实现可利用静电力包封基因、并使用中性生物大分子对载体内部电荷进行屏蔽以降低生物毒性的双重目的，提供了由电中性或电负性的多糖与阳离子聚合单体合成高分子接枝链组成的多糖基接枝交联共聚物，该多糖基接枝交联共聚物通过各单体的自由基接枝共聚合实现；另一方面为了实现负载基因后载体的结构稳定性和细胞内微环境敏感性，进一步在阳离子聚合物接枝链上进行了含二硫键双官能团交联剂的共聚。当多糖基接枝交联共聚物与带负电的基因混合时，由于基因与阳离子接枝链的静电相互作用，实现了静电驱动诱导的自组装，形成静电凝聚体，即电荷遮蔽的还原环境响应性基因载体。该电荷遮蔽的还原环境响应性基因载体为多层级结构，具体表现为基因与阳离子聚合物接枝链形成静电凝聚体的内核结构，电中性或电负性且亲水的多糖在凝聚体的表面形成多层级组装体的外壳结构；并且这一多层级组装体内部存在二硫键的交联，使其具有环境敏感性的特点，能够在还原环境下降解，使得基因在细胞内部释放和有效表达。本发明提供的制备方法绿色、无污染、产量高，合成高效便捷，得到的纳米粒子粒径均匀，在50nm-300nm之间，在肿瘤的基因编辑和免疫治疗应用方面具有广阔的前景。
以下将结合附图及具体实施例对本发明的构思、具体结构及产生的技术效果作进一步说明，以充分地了解本发明的目的、特征和效果。
附图说明
图1是本发明的一个实施例提供的一种电荷遮蔽的还原环境响应性基因载体的结构示意图；
图2是本发明的一个实施例提供的一种电荷遮蔽的还原环境响应性基因载体的制备流程示意图；
图3是本发明一个较佳实施例的电荷遮蔽的还原环境响应性基因载体细胞转染荧光显微镜镜检结果图。
其中：1-基因，2-阳离子聚合物，3-多糖。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的技术内容做进一步的说明：下述实施例是说明性的，不是限定性的，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下面实施例中涉及的质粒、基因来源和/或功能说明如下：
pEGFP-C1质粒：购自Clontech，带有绿色荧光蛋白基因，用于转染成功的阳性细胞筛选；
PX458质粒：购自addgene，带有荧光蛋白基因，用于转染成功的阳性细胞筛选；
PX459质粒：购自addgene，带有嘌呤霉素抗性基因，用于转染成功的阳性细胞筛选；
Fam-siRNA：购自上海吉玛制药技术有限公司，Fam是一种绿色荧光基团，由蓝光激发，激发波长480nm，发射波长520nm，用于荧光显微镜下观察阳性转染细胞；
siRNA-MDR1：购自上海吉玛制药技术有限公司，编码多耐药基因(MDR1)的小干扰RNA，可通过检测阳性转染细胞MDR1的表达水平验证其转染及表达效率。
下面实施例中使用到的细胞来源说明如下：
293T细胞购自ATCC；人肺癌细胞A549细胞购自ATCC；人肺癌细胞A549紫杉醇耐药细胞购自江苏凯基生物技术股份有限公司；人乳腺癌MCF-7阿霉素耐药细胞购自江苏凯基生物技术股份有限公司；人卵巢癌OVCar-3紫杉醇耐药细胞由复旦大学附属金山医院许国雄课题组构建，专利号为：ZL201410708515.7。
以下实施例展示的电荷遮蔽的还原环境响应性基因载体的制备流程如图2所示，多糖、聚合单体及交联剂聚合形成阳离子聚合物，当该阳离子聚合物与基因混合时，由于基因与阳离子聚合物的静电相互作用，形成电荷遮蔽的还原环境响应性基因载体。形成的电荷遮蔽的还原环境响应性基因载体结构模式如图1所示，基因1与阳离子聚合物2形基因载体的内核结构，多糖3在基因载体的表面形成外壳结构，多糖为电中性或电负性的水溶性多糖，对内部的阳离子聚合物起到了电荷遮蔽的作用；此外，交联剂所具有的二硫键(图中未显示)使得该基因载体具有还原环境响应性。
实施例1
将5g葡聚糖溶于100mL超纯水中，90℃下搅拌2小时使其充分溶解，恢复至30℃，氮气保护下均匀搅拌1小时，加入0.58g硝酸铈铵(CAN，溶于0.63mL 0.1N稀硝酸)，搅拌5分钟后加入0.51mL反应单体甲基丙烯酸二乙氨基乙酯(DEAEMA)，搅拌30分钟后再加入95uL二烯丙基二硫(溶于0.5mL二甲亚砜)，30℃氮气保护下继续反应4小时，反应结束后，转入截留分子量为14,000Da的透析袋中，在高纯水中透析3天，经冷冻干燥得到全亲水接枝交联聚合物(Dex-PDEAEMA)。
实施例2
将5g葡聚糖溶于100mL超纯水中，90℃下搅拌2小时使其充分溶解，恢复至30℃，氮气保护下均匀搅拌1小时，加入0.58g硝酸铈铵(CAN，溶于0.63mL 0.1N稀硝酸)，搅拌5分钟后加入0.41mL反应单体丙烯酸二甲氨基乙酯(DMAEA)，搅拌30分钟后再加入95uL二烯丙基二硫(溶于0.5mL二甲亚砜)，30℃氮气保护下继续反应4小时，反应结束后，转入截留分子量为14,000Da的透析袋中，在高纯水中透析3天，经冷冻干燥得到全亲水接枝交联聚合物(Dex-PDMAEA)。
实施例3
将5g葡聚糖溶于100mL超纯水中，90℃下搅拌2小时使其充分溶解，恢复至30℃，氮气保护下均匀搅拌1小时，加入0.58g硝酸铈铵(CAN，溶于0.63mL 0.1N稀硝酸)，搅拌5分钟后加入0.46mL反应单体甲基丙烯酸二甲氨基乙酯(DMAEMA)，搅拌30分钟后再加入95uL二烯丙基二硫(溶于0.5mL二甲亚砜)，30℃氮气保护下继续反应4小时，反应结束后，转入截留分子量为14,000Da的透析袋中，在高纯水中透析3天，经冷冻干燥得到全亲水接枝交联聚合物(Dex-PDMAEMA)。
实施例4
将5g壳聚糖溶于100mL的1％醋酸水溶液中，30℃，氮气保护下均匀搅拌1小时，加入0.58g硝酸铈铵(CAN，溶于0.63mL 0.1N稀硝酸)，搅拌5分钟后加入0.51mL反应单体甲基丙烯酸二乙氨基乙酯(DEAEMA)，搅拌30分钟后再加入95uL二烯丙基二硫(溶于0.5mL二甲亚砜)，30℃氮气保护下继续反应4小时，反应结束后，转入截留分子量为14,000Da的透析袋中，在高纯水中透析3天，经冷冻干燥得到全亲水接枝交联聚合物(CTS-PDEAEMA)。
实施例5
将5g壳聚糖溶于100mL的1％醋酸水溶液中，30℃，氮气保护下均匀搅拌1小时，加入0.58g硝酸铈铵(CAN，溶于0.63mL 0.1N稀硝酸)，搅拌5分钟后加入0.41mL反应单体丙烯酸二甲氨基乙酯(DMAEA)，搅拌30分钟后再加入95uL二烯丙基二硫(溶于0.5mL二甲亚砜)，30℃氮气保护下继续反应4小时，反应结束后，转入截留分子量为14,000Da的透析袋中，在高纯水中透析3天，经冷冻干燥得到全亲水接枝交联聚合物(CTS-PDMAEA)。
实施例6
将5g壳聚糖溶于100mL的1％醋酸水溶液中，30℃，氮气保护下均匀搅拌1小时，加入0.58g硝酸铈铵(CAN，溶于0.63mL 0.1N稀硝酸)，搅拌5分钟后加入0.46mL反应单体甲基丙烯酸二甲氨基乙酯(DMAEMA)，搅拌30分钟后再加入95uL二烯丙基二硫(溶于0.5mL二甲亚砜)，30℃氮气保护下继续反应4小时，反应结束后，转入截留分子量为14,000Da的透析袋中，在高纯水中透析3天，经冷冻干燥得到全亲水接枝交联聚合物(CTS-PDMAEMA)。
实施例7
pEGFP-C1质粒(DNA)和实施例1中制备的Dex-PDEAEMA分别溶解在超纯水中，浓度均为1mg/mL，二者按质量比1：8混合，室温涡旋振荡30分钟，得到电荷遮蔽的还原环境响应性基因载体。
实施例8
PX458质粒(DNA)和实施例3中制备的Dex-PDMAEMA分别溶解在超纯水中，浓度均为1mg/mL，二者按质量比1：10混合，室温涡旋振荡30分钟，得到电荷遮蔽的还原环境响应性基因载体。
实施例9
PX459质粒(DNA)和实施例1中制备的Dex-PDEAEMA分别溶解在超纯水中，浓度均为1mg/mL，二者按质量比1：12混合，室温涡旋振荡30分钟，得到电荷遮蔽的还原环境响应性基因载体。
实施例10
pEGFP-C1质粒(DNA)和实施例4中制备的CTS-PDEAEMA分别溶解在超纯水中，浓度均为1mg/mL，二者按质量比1：8混合，室温涡旋振荡30分钟，得到电荷遮蔽的还原环境响应性基因载体。
实施例11
PX458质粒(DNA)和实施例6中制备的CTS-PDMAEMA分别溶解在超纯水中，浓度均为1mg/mL，二者按质量比1：10混合，室温涡旋振荡30分钟，得到电荷遮蔽的还原环境响应性基因载体。
实施例12
PX459质粒(DNA)和实施例4中制备的CTS-PDEAEMA分别溶解在超纯水中，浓度均为1mg/mL，二者按质量比1：12混合，室温涡旋振荡30分钟，得到电荷遮蔽的还原环境响应性基因载体。
实施例13
Fam-siRNA和实施例1中制备的Dex-PDEAEMA分别溶解在去除RNA酶的超纯水中，浓度均为1mg/mL，二者按质量比1：12混合，室温涡旋振荡30分钟，得到电荷遮蔽的还原环境响应性基因载体。
实施例14
siRNA-MDR1和实施例1中制备的Dex-PDEAEMA分别溶解在去除RNA酶的超纯水中，浓度均为1mg/mL，二者按质量比1：12混合，室温涡旋振荡30分钟，得到电荷遮蔽的还原环境响应性基因载体。
实施例15：
将293T细胞接种到24孔板中，每孔加入0.5mL含10％血清的DMEM培养基，待细胞汇合度达到60-80％时，去除培养基，将含0.5ug pEGFP-C1质粒的电荷遮蔽的还原环境响应性基因载体(实施例7制备所得)与0.5mL无血清DMEM培养基混合，加入24孔板中，4小时后换含10％血清的DMEM培养基，继续培养48小时，荧光显微镜观察。pEGFP-C1质粒能够在细胞内表达绿色荧光蛋白，观察结果如图3所示，灰色亮点即为荧光蛋白表达区域，结果显示1％-10％的细胞转染成功。
实施例16：
将293T细胞接种到24孔板中，每孔加入0.5mL含10％血清的DMEM培养基，待细胞汇合度达到60-80％时，去除培养基，将含0.5ug PX458质粒的电荷遮蔽的还原环境响应性基因载体(实施例8制备所得)与0.5mL无血清DMEM培养基混合，加入培养皿中，4小时后换含10％血清的DMEM培养基，继续培养48小时，荧光显微镜观察。PX458质粒能够在细胞内表达荧光蛋白，结果显示1％-10％的细胞转染成功。
实施例17：
将293T细胞接种到24孔板中，每孔加入0.5mL含10％血清的DMEM培养基，待细胞汇合度达到60-80％时，去除培养基，将含0.5ug PX459质粒的电荷遮蔽的还原环境响应性基因载体(实施例9制备所得)与0.5mL无血清DMEM培养基混合，加入培养皿中，4小时后换含10％血清的DMEM培养基，继续培养48小时，PX459质粒带有嘌呤霉素抗性基因，用0.2ug/ml的嘌呤霉素进行筛选和富集具有抗性的细胞，获得了转染成功的细胞。
实施例18
人肺癌细胞A549细胞接种到6孔板中，每孔加入2mL含10％血清的RPMI-1640培养基，待细胞汇合度达到60-80％时，去除培养基，将含2ug PX459质粒的电荷遮蔽的还原环境响应性基因载体(实施例9制备所得)与2mL Opti-MEM培养基混合，加入培养皿中，4小时后换含10％血清的RPMI-1640培养基，继续培养48小时，用0.2ug/ml的嘌呤霉素进行筛选和富集转染具有抗性的细胞，获得了转染成功的细胞。
实施例19
293T细胞接种到6孔板中，每孔加入2mL含10％血清的RPMI-1640培养基，待细胞汇合度达到60-80％时，去除培养基，将含2.5ug Fam-siRNA的电荷遮蔽的还原环境响应性基因载体(实施例13制备所得)与2mL Opti-MEM培养基混合，加入6孔板中，4小时后，多聚甲醛固定，DAPI染色，荧光显微镜观察siRNA转染效率，果显示siRNA的转染效率在90％以上。
实施例20
人肺癌细胞A549紫杉醇耐药细胞接种到6孔板中，每孔加入2mL含10％血清的RPMI-1640培养基，待细胞汇合度达到60-80％时，去除培养基，将含2.5ug siRNA-MDR1的电荷遮蔽的还原环境响应性基因载体(实施例14制备所得)与2mL Opti-MEM培养基混合，加入6孔板中，4小时后换含10％血清的RPMI-1640培养基，继续培养48小时，分别用蛋白质印迹法(Western blot)和荧光定量PCR(Q-PCR)检测耐药基因MDR1的表达水平，结果显示MDR1的表达水平降低50％以上。
实施例21
人乳腺癌MCF-7阿霉素耐药细胞接种到6孔板中，每孔加入2mL含10％血清的RPMI-1640培养基，待细胞汇合度达到60-80％时，去除培养基，将含2.5ug siRNA-MDR1的电荷遮蔽的还原环境响应性基因载体(实施例14制备所得)与2mL Opti-MEM培养基混合，加入6孔板中，4小时后换含10％血清的RPMI-1640培养基，继续培养48小时，分别用蛋白质印迹法(Western blot)和荧光定量PCR(Q-PCR)检测耐药基因MDR1的表达水平，结果显示MDR1的表达水平降低50％以上。
实施例22
人卵巢癌OVCar-3紫杉醇耐药细胞接种到6孔板中，每孔加入2mL含10％血清的RPMI-1640培养基，待细胞汇合度达到60-80％时，去除培养基，将含2.5ug siRNA-MDR1的电荷遮蔽的还原环境响应性基因载体(实施例14制备所得)与2mL Opti-MEM培养基混合，加入培养皿中，4小时后换含10％血清的RPMI-1640培养基，继续培养48小时，分别用蛋白质印迹法(Western blot)和荧光定量PCR(Q-PCR)检测耐药基因MDR1的表达水平，结果显示MDR1的表达水平降低50％以上。
实施例23
将由实施例4-6制备得到的接枝交联聚合物溶于超纯水中，得到浓度为10mg/mL的水溶液，将靶向多肽、或穿膜肽、或核定位信号多肽、或协同治疗的一些细胞因子配成2mg/mL的水溶液，按多肽(或蛋白)中所含羧基的摩尔量1：1加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)，5-10分钟后加入等摩尔量的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，然后与接枝交联聚合物水溶液混合，37℃振荡，反应4小时。实验结果显示，对上述接枝交联聚合物进一步的不同功能修饰能够相应提高其靶向性、转染效率以及基因治疗效果。
以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。

Claims (2)

1.一种基因载体的制备方法，其特征在于，所述基因载体包括多糖、阳离子聚合物、基因和交联剂；所述多糖为电中性或电负性的水溶性多糖，所述电中性或电负性水溶性多糖与所述阳离子聚合物构成多糖基接枝交联聚合物，所述多糖基接枝交联聚合物与所述基因通过静电作用形成基因载体，所述基因负载于基因载体内部，所述电中性或电负性水溶性多糖位于基因载体表面；包括以下步骤：
（1）制备电中性或电负性水溶性多糖的水溶液，惰性气体保护下加入引发剂，搅拌混匀；所述电中性或电负性水溶性多糖为葡聚糖、海藻酸、水溶性淀粉、羧甲基葡聚糖、羧甲基纤维素、透明质酸、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素和普鲁兰多糖中的一种或多种；所述引发剂为硝酸铈铵；
（2）加入阳离子单体或溶于溶剂的阳离子单体，搅拌混匀；所述阳离子单体为甲基丙烯酸二乙氨基乙酯、甲基丙烯酸二乙基氨基乙酯、甲基丙烯酸二甲氨乙酯、丙烯酸二甲氨基乙酯、丙烯酸N,N-二乙基氨基乙酯、2-甲基-2-丙烯酸2-(4-吗啉基)乙基酯、丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵、甲基丙烯酸 2-氨基乙基酯盐酸盐和甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵中的一种或多种；
（3）加入还原环境敏感的交联剂，惰性气体保护下进行聚合及交联反应；所述还原环境敏感的交联剂为二烯丙基二硫、L-胱氨酸双丙烯酰胺、双丙烯酰胱胺或双（2-甲基丙烯酰氧基乙基）二硫醚中的一种或多种；
（4）透析处理，冷冻干燥得到接枝交联聚合物；
（5）得到的接枝交联聚合物与基因混合，通过静电作用力形成静电凝聚体，即基因载体；所述基因为质粒、siRNA、microRNA、piRNA、circleRNA和lncRNA中的一种或多种。
2.如权利要求1所述的方法制备的基因载体，其特征在于，所述基因载体包括多糖、阳离子聚合物、基因和交联剂；所述多糖为电中性或电负性的水溶性多糖，所述电中性或电负性水溶性多糖与所述阳离子聚合物构成多糖基接枝交联聚合物，所述多糖基接枝交联聚合物与所述基因通过静电作用形成基因载体，所述基因负载于基因载体内部，所述电中性或电负性水溶性多糖位于基因载体表面；所述交联剂具有还原环境响应性的二硫键；含所述二硫键双官能团交联剂在所述阳离子聚合物的接枝链上共聚；所述基因载体为多层级结构，包括内核结构和外壳结构，所述内核结构为所述基因与所述阳离子聚合物接枝链形成静电凝聚体，所述外壳结构为所述电中性或电负性的水溶性多糖在所述凝聚体的表面形成的；并且所述多层级结构内部存在所述二硫键的交联；所述电中性或电负性的水溶性多糖为葡聚糖、海藻酸、水溶性淀粉、羧甲基葡聚糖、羧甲基纤维素、透明质酸、羟丙基甲基纤维素的一种或多种；所述基因为质粒、siRNA、microRNA、piRNA、circleRNA和lncRNA中的一种或多种；所述阳离子聚合物是由阳离子单体聚合，所述阳离子单体为甲基丙烯酸二乙氨基乙酯、甲基丙烯酸二乙基氨基乙酯、甲基丙烯酸二甲氨乙酯、丙烯酸二甲氨基乙酯、丙烯酸N,N-二乙基氨基乙酯、2-甲基-2-丙烯酸2-(4-吗啉基)乙基酯、丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵、甲基丙烯酸 2-氨基乙基酯盐酸盐和甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵中的一种或多种；所述交联剂为二烯丙基二硫、L-胱氨酸双丙烯酰胺、双丙烯酰胱胺或双（2-甲基丙烯酰氧基乙基）二硫醚中的一种或多种。
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