CN109652561A

CN109652561A - 一种基于timeout基因鉴定二化螟水稻种群和茭白种群的方法

Info

Publication number: CN109652561A
Application number: CN201811503647.0A
Authority: CN
Inventors: 王小平; 刘�文; 郭霜; 田忠; 朱莉
Original assignee: Huazhong Agricultural University
Current assignee: Huazhong Agricultural University
Priority date: 2018-12-10
Filing date: 2018-12-10
Publication date: 2019-04-19
Anticipated expiration: 2038-12-10
Also published as: CN109652561B

Abstract

本发明提供了一种基于timeout基因鉴定二化螟水稻种群和茭白种群的方法，包括：提取二化螟水稻种群和茭白种群总RNA，根据目标基因timeout设计引物进行PCR扩增；琼脂糖凝胶电泳，回收timeout扩增片段，测序；序列比对、分析，鉴定记录单核苷酸多态性位点；其中，本发明中所提供的目标基因timeout在二化螟寄主种群中有7个SNP位点，其中7个SNP位点分别位于109bp、121bp、128bp、196bp、214bp、269bp、293bp处。该方法能对二化螟水稻种群和茭白种群进行快速准确分类和鉴定，克服了依靠形态特征鉴定的困难，可用于二化螟虫源性质分析。

Description

一种基于timeout基因鉴定二化螟水稻种群和茭白种群的方法

技术领域

本发明涉及种群鉴定技术领域，尤其涉及一种基于timeout基因鉴定二化螟水稻种群和茭白种群的方法。

背景技术

二化螟Chilo suppressalis是一种重要的农业害虫，其寄主植物多样，主要危害水稻和茭白等禾本科植物。国内外研究表明，二化螟已分化为水稻种群和茭白种群，且这两个种群在体长、体重等形态指标存在一定差异。然而，寄主植物的内外形态结构、营养物质可能会影响二化螟的个体大小，个体大小并不总能稳定地显示两种群间的遗传分化。因此，二化螟水稻种群和茭白种群的个体大小不完全代表种群特征，难于用于种群来源的鉴定。

目前主要通过观察二化螟水稻种群和茭白种群成虫的交配节律进行两种群的鉴定；对比文件1：申请号为“CN201710054836.3”，名称为“一种鉴定二化螟水稻种群和茭白种群的方法”公开了一种鉴定二化螟水稻种群和茭白种群的方法：取待鉴别二化螟幼虫，切取头部，经前期处理后用扫描电子显微镜观察、拍照，统计头部触角和口器上的各类感器数目和长度，按照以下规则鉴定二化螟的种群：(1)茭白种群触角鞭节具1个栓锥感器和2个锥形感器，水稻种群触角鞭节具1个栓锥感器和1个锥形感器；(2)茭白种群下颚须具5个锥形感器和3个柱形感器，而水稻种群下颚须具4个锥形感器和4个柱形感器。该对比文件可在较短时间内通过简单的触角口器的感器数量统计即可鉴定区别二化螟的不同种群。然而，该对比文件的方法以及目前使用的通过交配节律的方法都不能全面快速地进行种类鉴别，不能对防治措施的有效制定提供基本信息及数据。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术之缺陷，提供了一种基于timeout基因鉴定二化螟水稻种群和茭白种群的方法，该方法能对二化螟水稻种群和茭白种群进行分类和鉴定，克服了形态鉴定的困难，缩短了鉴定的周期，对使用的仪器设备要求较低，一般的分子生物学实验室均可进行，无需复杂的技术步骤，可用于二化螟虫源性质分析。

本发明的目的在于提供一种基于timeout基因鉴定二化螟水稻种群和茭白种群的方法，所述方法包括如下步骤：

步骤1、提取二化螟水稻种群和茭白种群总RNA，根据目标基因timeout设计引物进行PCR扩增；

步骤2、琼脂糖凝胶电泳，回收timeout扩增片段，测序；

步骤3、序列比对、分析，鉴定记录单核苷酸多态性位点；其中，所述目标基因timeout在二化螟寄主种群中有7个SNP位点，其中7个SNP位点分别位于109bp、121bp、128bp、196bp、214bp、269bp、293bp处。

所述步骤1中正向引物如序列表中SEQ ID NO：1所示；反向引物如序列表中SEQ IDNO：2所示。

所述二化螟水稻种群timeout基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。

所述二化螟茭白种群timeout基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。

优选地，所述步骤1中的PCR反应条件如下：循环前95℃预变性5min，每个循环包括95℃变性30s，56.5℃退火30s，72℃延伸2min，共设34个循环，循环结束后于72℃延伸10min。

具体地，所述目标基因timeout通过高通量转录组测序对种群进行筛选得到。所述高通量转录组测序的方法包括：提取样本总RNA，用Oligo(dT)的磁珠富集分离mRNA，合成双链cDNA，构建转录组测序文库，在测序仪上进行高通量测序，使用软件对测序片段进行拼接，从而得到目标基因序列。

本发明的有益效果：

1、本发明提供的一种基于timeout基因鉴定二化螟水稻种群和茭白种群的方法，能对二化螟水稻种群和茭白种群进行分类和鉴定，克服了形态鉴定的困难，缩短了鉴定的周期。

2、本发明提供的一种基于timeout基因鉴定二化螟水稻种群和茭白种群的方法，对使用的仪器设备要求较低，一般的分子生物学实验室均可进行，无需复杂的技术步骤，比观察交配节律进行分类和鉴定更准确可靠，又可节省时间。

附图说明

图1为本发明所鉴定的二化螟的timeout基因扩增结果示意图；

图2为二化螟水稻种群和茭白种群timeout基因序列比对图；图中存在7个SNP位点分别位于109bp、121bp、128bp、196bp、214bp、269bp、293bp处。

具体实施方式

1、通量转录组测序对种群进行筛选得到目标基因timeout。

高通量测序的步骤是：提取样本总RNA，用Oligo(dT)的磁珠富集分离mRNA，合成双链cDNA，构建转录组测序文库，在illumina HiSeq2000测序仪上进行高通量测序，使用Trinity软件对测序片段进行分析，从而得到目标基因序列。对得到的转录组数据进行行筛选，去除多拷贝及重复基因，找到目标基因timeout。

2、按照RNAiso Plus(Takara)说明书提取二化螟水稻种群和茭白种群总RNA，具体步骤如下：

(1)分别选取多组二化螟水稻种群和茭白种群成虫样品；用液氮冷冻研钵、研棒，将材料倒入盛有液氮的研钵中，用力磨成粉末，在研磨过程中注意不要让材料反复冻融。虫体粉碎后，加入1mL Trizol，粉末体积不超过Trizol体积的10％。室温放置5min。

(2)加入1/5上清液体积的氯仿，剧烈震荡15s后，室温放置5min，于4℃，12000rpm，离心15min，移取保留最上层清液280μL，置于新的无酶离心管中。加入等上清体积的预冷异丙醇，上下颠倒轻柔混匀，于室温静置10min后，于4℃，12000rpm，离心10min，弃上清，并加入1mL预冷75％乙醇(无水乙醇：DEPC水＝3:1)洗涤沉淀后，于4℃，12000rpm，离心5min，弃上清，留沉淀于超净台中室温干燥2-5min。

(3)加入适量DEPC水溶解沉淀。

(4)取少量RNA溶液用DEPC水稀释10倍，并取1μL RNA稀释液于Nanodrop 2000测定RNA浓度及A260/A280值，A260/A280比值在1.90至2.05之间，均符合实验要求。并将剩余RNA稀释液进行1％琼脂糖凝胶电泳检测样品RNA完整性。

3、将上述RNA反转录成cDNA均按照PrimeScript^TMRT reagent Kit with gDNAEraser(Perfect Real Time)(Takara，RR047A)说明书进行。具体步骤如下：

(1)去除基因组gDNA反应，按如下成分于冰上配制反应混合液：

反应条件：于PCR仪进行反应。42℃2min，4℃。

(2)反转录成cDNA反应，反应液的配制在冰上进行，反应体系如下：

在PCR仪上按下列条件进行反转录反应，反应条件：于PCR仪进行反应，程序为：37℃，15min；85℃，5s。cDNA合成后保存于-20℃。

4、根据目标基因设计引物，引物的序列为：

Cs-timeout-F：5'-AGAAGCCGAAGGTTACGACC-3'(SEQ ID NO：1所示)

Cs-timeout-R：5'-CTTTTATCACGCCTCGTCGG-3'(SEQ ID NO：2所示)

5、PCR扩增

PCR反应体系为25μL，其中10×PCRbuffer 2.5μL，dNTP 2μL，正反向引物各0.5μL(10μM)，Taq酶0.25μL，DNA模板(10倍稀释)1μL；

反应条件如下：循环前95℃预变性5min，每个循环包括95℃变性30s，56.5℃退火30s，72℃延伸2min，共设34个循环，循环结束后于72℃延伸10min。

6、PCR产物纯化

上述PCR产物用上海生工生物DNA凝胶回收试剂盒进行纯化，具体步骤如下：首先从琼脂糖凝胶上切下含目的片段的凝胶，放入1.5mL离心管，加入400μL溶胶液，50-60℃水浴至胶彻底融化，加热融胶时，每2min混匀一次，冷却至室温；将离心柱放入收集管中，把混合液移至离心柱，室温放置2min；8000×g离心30s，此时DNA被吸附到柱上；倒掉收集管中废液，将离心柱放入同一个收集管中，加入500μl Wash Solution，9000×g离心30s；倒掉收集管中的废液，重复上述步骤；空吸附柱于9000×g离心1min；将离心柱放入一预先准备好的灭菌1.5mL离心管中，加入20μL洗脱液或双蒸水(pH＞7.0)，室温或37℃放置1min；离心1min，离心管中的液体即为回收的DNA片段。

7、测序

送去上海生工测序；并分析测序结果。所述二化螟水稻种群timeout基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。所述二化螟茭白种群timeout基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。

8、序列比对和分析

所得的序列用Mega软件进行比对排列，经比对，两端切齐后长度699bp，峰型清晰，无杂峰。可以通过测序峰形清晰鉴定SNP。

表1-二化螟水稻种群和茭白种群timeout基因的SNP位点

需要说明的是，本发明人通过选取大量的样本(二化螟水稻种群和茭白种群)，对5个采样地点共采集二化螟800头左右；所有的二化螟水稻种群timeout基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示；所有的二化螟茭白种群timeout基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示；具有显著的统计学差异。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 华中农业大学

<120> 一种基于timeout基因鉴定二化螟水稻种群和茭白种群的方法

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

agaagccgaa ggttacgacc 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

cttttatcac gcctcgtcgg 20

<210> 3

<211> 699

<212> DNA

<213> 二化螟(水稻Chilo suppressalis)

<400> 3

agaagccgaa ggttacgacc caaccgcaga aggaacaccc cttgtgccta tttcaagcga 60

atccgtcgac gctatggaag acgaattatt ccagcgtgta ctgaaaggag taggagtcgc 120

accgccctgc gatgaacaag aatcatattg gaggataccc agcgacttgc atttcaatac 180

catcagaaag agacgtgaaa taatcataaa agccataaac aaagaactca taatagattc 240

cgcaatatct atatcagagc cgaacataga aagcgctatt atagaaactg gcaaaaattt 300

aaacgccaat gaagattcta gcgacgacga tgacttgttc gataacttga gaaaactgcg 360

cgatactaac tcggataact atacaaacaa taagagcaat ggaagttcaa ctaaaagttt 420

tgacgtgaaa cgtaacaaac gcagtcgtag cgtcgatcct gatgaaaaga acggcagaga 480

aaaaatgcag aagattgaag aagcagatga agttgatagt gataaagatg atggggatga 540

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cgatactgag gacattttga atggaatcgc aagaatcgca gatgatgaca gtgataaaga 660

agatgccgat atcgttttac cgacgaggcg tgataaaag 699

<210> 4

<211> 699

<212> DNA

<213> 二化螟(茭白Chilo suppressalis)

<400> 4

agaagccgaa ggttacgacc caaccgcaga aggaacaccc cttgtgccta tttcaagcga 60

atccgtcgac gctatggaag acgaattatt ccagcgtgta ctgaaagggg taggagtcgc 120

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cgatactgag gacattttga atggaatcgc aagaatcgca gatgatgaca gtgataaaga 660

agatgccgat atcgttttac cgacgaggcg tgataaaag 699

Claims

1.一种基于timeout基因鉴定二化螟水稻种群和茭白种群的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

步骤2、琼脂糖凝胶电泳，回收timeout扩增片段，测序；

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤1中正向引物如SEQ ID NO：1所示；反向引物如SEQ ID NO：2所示。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤1中的PCR反应条件如下：循环前95℃预变性5min，每个循环包括95℃变性30s，56.5℃退火30s，72℃延伸2min，共设34个循环，循环结束后于72℃延伸10min。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述二化螟水稻种群timeout基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述二化螟茭白种群timeout基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述目标基因timeout通过高通量转录组测序对种群进行筛选得到。