CN109619561A - 一种胎盘间充质干细胞微囊粉的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种胎盘间充质干细胞微囊粉的制备方法，它包含如下步骤：一、剪取胎盘底蜕膜面的组织，剪成肉泥，放入胞培养瓶中进行传代培养；二、取细胞悬浮液到新的离心管中离心5min；收集下层沉淀，加入传代培养基；三、细胞生长后冻融裂解得细胞混合液，将细胞混合液离心处理；四、取上清液于新的无菌离心管中，低温保存；五、制备5％阿拉伯胶壁材溶液；六、制备1％壳聚糖壁材溶液；制备W/O型乳状液；七、制备W/O/W型乳状液；八、复凝聚反应；九、固化反应；十、冷冻得到胎盘间充质干细胞微胶囊；本发明将活性物质制备成微胶囊进行保护，减小温度、光照等因素对活性物质的影响，达到常温储存的要求。

Description

一种胎盘间充质干细胞微囊粉的制备方法
技术领域
本发明涉及保健品技术领域，具体涉及一种胎盘间充质干细胞微囊粉的制备方法。
背景技术
2007年，英国科学家Anastasia在Nature杂志上撰文指出：成体干细胞对人体自我修复和组织再生至关重要，成体干细胞的减少是人体衰老的主要原因。这一发现对人类理解衰老过程以及干细胞移植具有重要意义，这也是近年来干细胞也再生医学研究蓬勃发展的原因。
间充质干细胞(MSC)源于发育早期的中胚层和外胚层。间充质干细胞是一种具有自我复制能力和多向分化潜能的成体干细胞，属于非终末分化，它既有间质细胞，又有内皮细胞和上皮细胞的特征。在机体正常的组织损伤修复过程中，MSC是一种重要的参与组织再生的细胞库。在组织损伤引起的特殊信号作用下，MSC迁移到受损部位，在局部聚集增殖，依据不同的损伤信号沿着不同途径分化。MSC易于分离扩增，体外扩增能力强，即使扩增若干倍仍能保持其多向分化能力。因此，MSC是一种实用的组织修复种子细胞。
间充质干细胞作为一种多能干细胞，既可以为造血干细胞提供细胞生长的物理微环境，又可以分泌大量的细胞因子，如干细胞因子(Stem Cell Growth Factors，SCF)，血小板生成素，血管生产素，白介素3，白介素6等，供应干细胞增殖和分化使用。临床实验由美国哈弗大学麻省理工大学进行的临床实验，156名SCF受试者中有147名出现与对照组明显的差异，证明SCF可以提高记忆、延缓衰老。
相较于其他干细胞，胎盘间充质干细胞(placental mesenchymal stem cells，pMSCs)具有来源方便，细胞数量充足，易于分离、培养、扩增和纯化，传代扩增30多代后仍具有干细胞特性。它是从胎盘组织提取的一种多能干细胞，在临床上有广阔的应用前景，包括急性肝损伤、糖尿病足、下肢缺血、子痫前期、自体免疫疾病、骨关节炎、早衰症等疾病的治疗。目前研究表明，胎盘是间充质干细胞的最佳来源。
间充质干细胞除了用于疾病的辅助治疗，抗衰老也是科学家们正在研究的一项重要方向，皮肤是人体面积最大的器官，皮肤和其他器官一样，随着年龄不断增加，都逐渐趋向衰老。引起皮肤衰老的原因很多，如氧化性损伤(ROS损伤)：活性氧(reactive oxygenspecies，ROS)和活性氮(reactive nitrogen species，RNS)是引起蛋白质氧化损伤的重要因素。在细胞内和外环境中，蛋白质均是自由基和其他氧化剂作用的主要目标。据估计，细胞内的大分子中，由蛋白质清除的自由基占活性自由基总量的50％-75％。由于某些蛋白质具有较长的半衰期，容易造成氧化性损伤的积累，加快皮肤衰老过程。
MSC可以释放促进细胞生长的生长因子例如SCF促使细胞的增殖与分化，同时MSC也可以释放一种化学物质NADH(Nicotinamide adenine dinucleotide)，是烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的还原态，还原型辅酶Ⅰ，是细胞生长所需能量的直接来源物质，并且参与人体上千种以上的代谢反应，没有NADH，细胞无法维持正常的结构和功能。细胞中NADH含量越高，它所产生的能量就越多，这个细胞的功能就越好，该细胞以及整个个体的寿命就越长。NADH在人体有四种存在形式(NAD+/NADH和NADP+/NADPH)，NADH本身是一种很强的生物抗氧化剂，可有效清除人体有害自由基。NADPH还可以激活人体抗氧化系统活性，促进人体其他生物抗氧化剂的再生(如维生素C、维生素E、谷胱甘肽等)。NAD+是能真正深入细胞组织的小分子，有效激活长寿基因Sirt1～7的活性，从根本上激活抑制衰老基因生长，延缓衰老。
因此，MSC正日渐用于皮肤的抗衰研究及应用。现有的细胞类活性物质，普遍存在性质不稳定，易受温度、光照等环境因素的影响，特别是对温度要求严格，如果不加以保护，常温条件下很容易失活。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的缺陷和不足，提供一种胎盘间充质干细胞微囊粉的制备方法，将活性物质制备成微胶囊进行保护，减小温度、光照等因素对活性物质的影响，达到常温储存的要求。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：它包含如下步骤：
一、选取足月顺产或剖宫产的盘状胎盘，剪取胎盘底蜕膜面的组织；
二、在无菌室挑取颜色鲜亮的组织，剪成肉泥；
三、将剪碎的组织用细胞刮刀平铺于T75cm2的细胞培养瓶中，做好标记；
四、将细胞培养瓶倒扣，缓慢加入无血清培养基，放入37℃培养箱中，向培养箱中充入5％的CO2，倒置2h，拧紧瓶盖；
五、将细胞培养瓶正置，确保培养液能覆盖住每块组织，静置培养；
六、三天后观察组织块，观察时动作要轻，尽量不要晃动；
七、七天后再半量换液，此后均半量换液；
八、待细胞汇合度达到80％左右时，进行传代培养；
九、将培养液去除，生理盐水冲洗一遍，加入2mL的0.25％Trypsin-EDTA(1X)，放入37℃培养箱中，约3-5min，待细胞变圆时，停止消化，弃去消化液，加入无血清培养基至培养瓶终止消化，轻轻吹打贴壁的细胞，使细胞均匀分布于溶液中，吸取细胞悬浮液到新的离心管中，离心5min，转速为1500rpm；
十、弃去上层溶液，收集下层沉淀，加入传代培养基，按着1×105个/mL细胞量进行传代培养；
十一、待细胞生长至80-90％密度时，收获细胞；计数，取1×108胎盘间充质干细胞，加入预冷的50mL灭菌去离子水，反复冻融，使细胞充分裂解，其它细胞液氮中冷冻保藏；
十二、根据需要冻存的细胞数，在50mL离心管中加入若干毫升的细胞冻存重悬细胞；
十三、将冻存的细胞均分到若干个2mL的冻存管中，每管加细胞悬液1mL，将冻存管盖拧紧盖好；
十四、将冻存管置于已平衡到4℃的程序降温盒中，移至-80℃冰箱逐级降温-80℃；
十五、从程序降温盒中取出冻存管，迅速移至液氮中长期冻存备用；
十六、取第十一步骤中裂解后的细胞混合液，在4℃的温度下离心10min1转速为10000rpm；吸取含有活性物质的上清液于新的无菌离心管中，定容至100mL，低温保存备用；
十七、称取5g阿拉伯胶及100g去离子水，在60℃水浴中搅拌溶解，得到5％阿拉伯胶壁材溶液；
十八、称取1g壳聚糖及100g去离子水，在50℃水浴中搅拌溶解，得到1％壳聚糖壁材溶液；
十九、将步骤十六中低温保存的上清液加入花生油中，上清液与花生油的体积比为1:3，在35℃的温度下高速分散乳化40min，转速为10000rpm，得到均一的W/O型乳状液；
二十、将W/O型乳状液加入5％阿拉伯胶中，W/O型乳状液与5％阿拉伯胶的体积为比1:4，在35℃的温度下高速分散乳化30min1转速为10000rpm，得到均一的W/O/W型乳状液；
二十一、将上述W/O/W型乳状液加入1％壳聚糖中；W/O/W型乳状液与1％壳聚糖的体积比为1:1，恒温匀速搅拌条件下，用1mol/LHCl溶液和0.1g/mLNaOH调节PH至4-5；在25℃的温度下高速分散乳化30min，转速为10000rpm，使阿拉伯胶与壳聚糖发生复凝聚作用；
二十二、室温条件下，固化4h；
二十三、真空冷冻干燥机预冷至-45℃后开始抽真空，控制在80Kpa，冷冻时间8h，得到胎盘间充质干细胞微胶囊。
进一步地，步骤四及步骤九中的无血清培养基包含人间充质干细胞基础培养基和添加物，并充分混合，人间充质干细胞基础培养基和添加物以10:1的体积比充分混合，混合后加入L-gln，使其终浓度达到2mM；
进一步地，步骤十中的传代培养基包含完全培养基和MSCGM-CDTMBulletKit；完全培养基和MSCGM-CDTM BulletKit的质量比为3:1；
进一步地，步骤十二中，细胞冻存液的添加量为1×107细胞加入1ml冻存液；
进一步地，步骤十二中，细胞冻存液内包含如下重量份原料：人血白蛋白50％、无血清培养液40％、二甲基亚砜10％；
进一步地，步骤十七中，阿拉伯胶的CAS号为9000-01-5；
进一步地，步骤十八中，壳聚糖的CAS号为9012-76-4；
进一步地，步骤二十一中，1mol/LHCl溶液的CAS号为7647-01-0；0.1g/mLNaOH的CAS号为1310-73-2。
采用上述方案后，本发明有益效果为：本发明所述的一种胎盘间充质干细胞微囊粉的制备方法，将活性物质制备成微胶囊进行保护，减小温度、光照等因素对活性物质的影响，达到常温储存的要求。
具体实施方式
下面对本发明作进一步的说明。
本具体实施方式采用的技术方案是：它包含如下步骤：
一、选取足月顺产或剖宫产的盘状胎盘，剪取胎盘底蜕膜面的组织；
二、在无菌室挑取颜色鲜亮的组织，剪成肉泥；
三、将剪碎的组织用细胞刮刀平铺于T75cm2的细胞培养瓶中，做好标记；
四、将细胞培养瓶倒扣，缓慢加入无血清培养基，放入37℃培养箱中，向培养箱中充入5％的CO2，倒置2h，拧紧瓶盖；
五、将细胞培养瓶正置，确保培养液能覆盖住每块组织，静置培养；
六、三天后观察组织块，观察时动作要轻，尽量不要晃动；
七、七天后再半量换液，此后均半量换液；
八、待细胞汇合度达到80％左右时，进行传代培养；
九、将培养液去除，生理盐水冲洗一遍，加入2mL的0.25％Trypsin-EDTA(1X)，放入37℃培养箱中，约3-5min，待细胞变圆时，停止消化，弃去消化液，加入无血清培养基至培养瓶终止消化，轻轻吹打贴壁的细胞，使细胞均匀分布于溶液中，吸取细胞悬浮液到新的离心管中，离心5min，转速为1500rpm；
十、弃去上层溶液，收集下层沉淀，加入传代培养基，按着1×105个/mL细胞量进行传代培养；传代培养基包含完全培养基和MSCGM-CDTM BulletKit；完全培养基和MSCGM-CDTM BulletKit的质量比为3:1；
十一、待细胞生长至80-90％密度时，收获细胞；计数，取1×108胎盘间充质干细胞，加入预冷的50mL灭菌去离子水，反复冻融，使细胞充分裂解，其它细胞液氮中冷冻保藏；
十二、根据需要冻存的细胞数，在50mL离心管中加入若干毫升的细胞冻存重悬细胞；细胞冻存液的添加量为1×107细胞加入1ml冻存液；
十三、将冻存的细胞均分到若干个2mL的冻存管中，每管加细胞悬液1mL，将冻存管盖拧紧盖好；
十四、将冻存管置于已平衡到4℃的程序降温盒中，移至-80℃冰箱逐级降温-80℃；
十五、从程序降温盒中取出冻存管，迅速移至液氮中长期冻存备用；
十六、取第十一步骤中裂解后的细胞混合液，在4℃的温度下离心10min1转速为10000rpm；吸取含有活性物质的上清液于新的无菌离心管中，定容至100mL，低温保存备用；
十七、称取5g阿拉伯胶及100g去离子水，在60℃水浴中搅拌溶解，得到5％阿拉伯胶壁材溶液；阿拉伯胶CAS号：9000-01-5；
十八、称取1g壳聚糖及100g去离子水，在50℃水浴中搅拌溶解，得到1％壳聚糖壁材溶液；壳聚糖的CAS号：9012-76-4；
十九、将步骤十六中低温保存的上清液加入花生油中，上清液与花生油的体积比为1:3，在35℃的温度下高速分散乳化40min，转速为10000rpm，得到均一的W/O型乳状液；
二十、将W/O型乳状液加入5％阿拉伯胶中，W/O型乳状液与5％阿拉伯胶的体积为比1:4，在35℃的温度下高速分散乳化30min1转速为10000rpm，得到均一的W/O/W型乳状液；
二十一、将上述W/O/W型乳状液加入1％壳聚糖中；W/O/W型乳状液与1％壳聚糖的体积比为1:1，恒温匀速搅拌条件下，用1mol/LHCl溶液和0.1g/mLNaOH调节PH至4-5；1mol/LHCl溶液的CAS号为7647-01-0；0.1g/mLNaOH的CAS号为1310-73-2；在25℃的温度下高速分散乳化30min，转速为10000rpm，使阿拉伯胶与壳聚糖发生复凝聚作用；二十二、室温条件下，固化4h；
二十三、真空冷冻干燥机预冷至-45℃后开始抽真空，控制在80Kpa，冷冻时间8h，得到胎盘间充质干细胞微胶囊。
本具体实施方式中，步骤四及步骤九中的无血清培养基包含人间充质干细胞基础培养基和添加物，并充分混合，人间充质干细胞基础培养基和添加物以10:1的体积比充分混合，混合后加入L-gln，使其终浓度达到2mM；添加物为
步骤四中，细胞培养瓶倒扣之后，可以容纳一定体积的培养基，因为培养瓶瓶口与瓶身有一定的角度，借着瓶口的角度就可以容纳一定体积的培养基，细胞培养瓶倒扣可防止上方的培养物过分干燥，不利于细胞的正常爬出；还可防止将培养瓶从培养箱中拿出来再加培养基时影响细胞正常的贴壁，甚至造成二次污染；
将5％CO2入细胞培养箱，细胞培养瓶带有空气滤膜，可以将空气中的细菌等隔离在瓶口，进入瓶内是无菌洁净的空气，可稳定细胞培养液PH，给细胞提供一个良好的生长环境。
以上所述，仅用以说明本发明的技术方案,而非限制本领域普通技术人员对本发明的技术方案所做的其它修改或者等同替换，只要不脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (8)

1.一种胎盘间充质干细胞微囊粉的制备方法，其特征在于它包含如下步骤：
一、选取足月顺产或剖宫产的盘状胎盘，剪取胎盘底蜕膜面的组织；
二、在无菌室挑取颜色鲜亮的组织，剪成肉泥；
三、将剪碎的组织用细胞刮刀平铺于T75cm2的细胞培养瓶中，做好标记；
四、将细胞培养瓶倒扣，缓慢加入无血清培养基，放入37℃培养箱中，向培养箱中充入5％的CO2，倒置2h，拧紧瓶盖；
五、将细胞培养瓶正置，确保培养液能覆盖住每块组织，静置培养；
六、三天后观察组织块，观察时动作要轻，尽量不要晃动；
七、七天后再半量换液，此后均半量换液；
八、待细胞汇合度达到80％左右时，进行传代培养；
九、将培养液去除，生理盐水冲洗一遍，加入2mL的0.25％Trypsin-EDTA(1X)，放入37℃培养箱中，约3-5min，待细胞变圆时，停止消化，弃去消化液，加入无血清培养基至培养瓶终止消化，轻轻吹打贴壁的细胞，使细胞均匀分布于溶液中，吸取细胞悬浮液到新的离心管中，离心5min，转速为1500rpm；
十、弃去上层溶液，收集下层沉淀，加入传代培养基，按着1×105个/mL细胞量进行传代培养；
十一、待细胞生长至80-90％密度时，收获细胞；计数，取1×108胎盘间充质干细胞，加入预冷的50mL灭菌去离子水，反复冻融，使细胞充分裂解，其它细胞液氮中冷冻保藏；
十二、根据需要冻存的细胞数，在50mL离心管中加入若干毫升的细胞冻存重悬细胞；
十三、将冻存的细胞均分到若干个2mL的冻存管中，每管加细胞悬液1mL，将冻存管盖拧紧盖好；
十四、将冻存管置于已平衡到4℃的程序降温盒中，移至-80℃冰箱逐级降温-80℃；
十五、从程序降温盒中取出冻存管，迅速移至液氮中长期冻存备用；
十六、取第十一步骤中裂解后的细胞混合液，在4℃的温度下离心10min1转速为10000rpm；吸取含有活性物质的上清液于新的无菌离心管中，定容至100mL，低温保存备用；
十七、称取5g阿拉伯胶及100g去离子水，在60℃水浴中搅拌溶解，得到5％阿拉伯胶壁材溶液；
十八、称取1g壳聚糖及100g去离子水，在50℃水浴中搅拌溶解，得到1％壳聚糖壁材溶液；
十九、将步骤十六中低温保存的上清液加入花生油中，上清液与花生油的体积比为1:3，在35℃的温度下高速分散乳化40min，转速为10000rpm，得到均一的W/O型乳状液；
二十、将W/O型乳状液加入5％阿拉伯胶中，W/O型乳状液与5％阿拉伯胶的体积为比1:4，在35℃的温度下高速分散乳化30min1转速为10000rpm，得到均一的W/O/W型乳状液；
二十一、将上述W/O/W型乳状液加入1％壳聚糖中；W/O/W型乳状液与1％壳聚糖的体积比为1:1，恒温匀速搅拌条件下，用1mol/LHCl溶液和0.1g/mLNaOH调节PH至4-5；在25℃的温度下高速分散乳化30min，转速为10000rpm，使阿拉伯胶与壳聚糖发生复凝聚作用；
二十二、室温条件下，固化4h；
二十三、真空冷冻干燥机预冷至-45℃后开始抽真空，控制在80Kpa，冷冻时间8h，得到胎盘间充质干细胞微胶囊。
2.根据权利要求1所述的一种胎盘间充质干细胞微囊粉的制备方法，其特征在于步骤四及步骤九中的无血清培养基包含-XF人间充质干细胞基础培养基和添加物，并充分混合，-XF人间充质干细胞基础培养基和添加物以10:1的体积比充分混合，混合后加入L-gln，使其终浓度达到2mM。
3.根据权利要求1所述的一种胎盘间充质干细胞微囊粉的制备方法，其特征在于步骤十中的传代培养基包含完全培养基-XF和MSCGM-CDTMBulletKit；完全培养基-XF和MSCGM-CDTMBulletKit的质量比为3:1。
4.根据权利要求1所述的一种胎盘间充质干细胞微囊粉的制备方法，其特征在于步骤十二中，细胞冻存液的添加量为1×107细胞加入1ml冻存液。
5.根据权利要求1或4所述的一种胎盘间充质干细胞微囊粉的制备方法，其特征在于步骤十二中，细胞冻存液内包含如下重量份原料：人血白蛋白50％、无血清培养液40％、二甲基亚砜10％。
6.根据权利要求1所述的一种胎盘间充质干细胞微囊粉的制备方法，其特征在于步骤十七中，阿拉伯胶的CAS号为9000-01-5。
7.根据权利要求1所述的一种胎盘间充质干细胞微囊粉的制备方法，其特征在于步骤十八中，壳聚糖的CAS号为9012-76-4。
8.根据权利要求1所述的一种胎盘间充质干细胞微囊粉的制备方法，其特征在于步骤二十一中，1mol/LHCl溶液的CAS号为7647-01-0；0.1g/mLNaOH的CAS号为1310-73-2。
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CN110205290A (zh) * 2019-05-15 2019-09-06 溯源生命科技股份有限公司 一种胎盘间充质干细胞微囊粉的制备方法

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