CN109602902B - 一种猪巴氏杆菌多糖蛋白偶联疫苗及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于兽用疫苗技术领域，具体涉及一种猪巴氏杆菌多糖蛋白偶联疫苗及其制备方法。所述猪巴氏杆菌多糖蛋白偶联疫苗包括猪多杀性巴氏杆菌荚膜多糖和蛋白类载体，两者经纳米微球连接而成，其中猪巴氏杆菌荚膜多糖、蛋白类载体和纳米微球的重量比为(1.5～2.5)：(0.5～1)：1。所述猪巴氏杆菌多糖蛋白偶联疫苗的制备方法包括以下步骤：多糖‑纳米微球偶联体的制备、多糖‑纳米微球偶联体的改性以及猪巴氏杆菌多糖蛋白偶联疫苗的制备。本发明猪巴氏杆菌多糖蛋白偶联疫苗采用荚膜多糖和破伤风类毒素相结合，提高了疫苗的免疫原性，制备的疫苗免疫原性强、安全无毒副作用并且接种效果好。

Description

一种猪巴氏杆菌多糖蛋白偶联疫苗及其制备方法
技术领域
本发明属于兽用疫苗技术领域，具体涉及一种猪巴氏杆菌多糖蛋白偶联疫苗及其制备方法。
背景技术
多杀性巴氏杆菌是一种革兰氏阴性短杆菌，能够感染家畜、家禽和野禽等多种动物，具体表现为禽类的禽霍乱、猪肺疫、牛和兔等动物的出血性败血症。其中，猪是巴氏杆菌最常见的自然宿主，其会引起猪体的肺炎、败血症甚至混合感染，导致猪群的高发病率和高死亡率。我国传统上所说的“猪肺疫”是由猪多杀性巴氏杆菌引起的一种急性传染病，俗称“锁喉风”，其中急性症状表现为败血症变化、咽喉部肿胀和高度呼吸困难，慢性症状表现为慢性肺炎。传统的对于猪多杀性巴氏杆菌感染的治疗主要采用药物治疗如抗生素等，但近年来随着抗生素的广泛使用，多杀性巴氏杆菌的耐药性越来越强，而且还会产生一定的副作用，因此多杀性巴氏杆菌引起的疾病单纯的靠药物预防已经变得越来越困难。
中国专利文献CN 107569681 A公开了一种牛多杀性巴氏杆菌病二价灭活疫苗及其制备方法，该疫苗由抗原和疫苗佐剂组成，其中的抗原为牛多杀性巴氏杆菌荚膜A型Pm-TJ株和牛多杀性巴氏杆菌荚膜B型C45-2株，该种灭活疫苗虽然安全可靠，但在使用上具有一定的局限性，能否应用于其他畜类尚未可知。目前，除了药物治疗外，主要采用灭活疫苗和活菌疫苗来预防猪多杀性巴氏杆菌病，但灭活疫苗只对同源菌株的感染具有保护作用，而活菌疫苗对同源菌株和异源菌株的感染具有一定的交叉保护作用，但易出现毒力返强的现象。
荚膜是存在于多杀性巴氏杆菌细胞壁外的一层粘液性物质，可保护细菌免受抑菌或杀菌物质的侵害以及宿主吞噬细胞的吞噬，同时还有助于细菌黏附于宿主细胞表面以诱发感染，是细菌得以生存的重要表面结构。研究表明，多杀性巴氏杆菌的荚膜主要成分是多糖，是细菌重要的保护性抗原和毒力因子，同时也是细菌结构变化最少的表面抗原，具有较好的免疫原性，因此是最适宜做疫苗的靶抗原之一。荚膜多糖疫苗与传统疫苗相比，其成分单一，不存在易引起免疫副反应的物质，使得该类疫苗更为安全、有效，已成为应用最多的疫苗之一。
近年来，已经出现了将荚膜多糖应用于制备多杀性巴氏杆菌疫苗的实例。例如，中国专利文献CN 104163858 A公开了一种多杀性巴氏杆菌无细胞抗原，所述抗原来自灭活的多杀性巴氏杆菌培养物的上清液，所述的上清液含有多糖和蛋白，该疫苗具有注射部位局部副反应小及对动物的生长影响作用小，但是其由于分子量过小导致免疫原性效果不佳。中国专利文献CN 106729696 A公开了一种罗非鱼源无乳链球菌荚膜多糖疫苗的制备方法及其应用，该疫苗由鱼源无乳链球菌荚膜多糖制备所得，并与破伤风类毒素载体相结合，获得的疫苗特异性强并具有免疫保护力。
基于目前的多杀性巴氏杆菌疫苗存在着免疫原性低、使用上存在着局限性、需要进行多次接种以及可能有一些残留的毒力等问题，因此急需为人们提供一种新型的免疫原性强、安全无副作用并且接种效果好的猪巴氏杆菌多糖蛋白偶联疫苗及其制备方法。
发明内容
本发明旨在克服现有技术的不足，提供一种猪巴氏杆菌多糖蛋白偶联疫苗及其制备方法，该多糖蛋白偶联疫苗采用荚膜多糖和破伤风类毒素蛋白载体相结合，提高了疫苗的免疫原性，制备的疫苗免疫原性强、安全无毒副作用并且接种效果好。
为了实现上述目的，本发明的技术方案如下：
一种猪巴氏杆菌多糖蛋白偶联疫苗，包括猪巴氏杆菌荚膜多糖和蛋白类载体，所述猪巴氏杆菌荚膜多糖和蛋白类载体经纳米微球连接而成，所述猪巴氏杆菌荚膜多糖、蛋白类载体和连接体的重量比为(1.5～2.5)：(0.5～1)：1。
进一步地，所述猪巴氏杆菌荚膜多糖、蛋白类载体和连接体的重量比为2：0.75：1。
进一步地，所述蛋白类载体为破伤风类毒素。
进一步地，所述纳米微球的内部为磁性微粒，所述磁性微粒通过高分子材料进行包裹。
更进一步地，所述高分子材料为为阿拉伯胶和木质素，所述阿拉伯胶和木质素的重量比为(0.1～0.4)：1。
再进一步地，所述阿拉伯胶和木质素的重量比为0.25：1。
进一步地，所述纳米微球的制备方法，包括以下步骤：
S1、磁性微粒的制备：称取FeCl2·4H2O和FeCl3·6H2O分别溶解于蒸馏水中，配制成Fe2+浓度为0.1～0.3mol/L的溶液A和Fe3+浓度为0.1～0.15mol/L的溶液B，将溶液A和溶液B混合置入三口瓶中，加入去离子水在10000r/min条件下高速搅拌，搅拌的同时缓慢滴加3mol/L的氢氧化钠直至溶液变得黑亮，停止加入氢氧化钠，继续搅拌25～35min后加入油酸在10000r/min条件下高速搅拌0.8～1.5h，然后用无水乙醇和去离子水清洗干净，去除磁粒表面吸附的油酸，最后加以磁场分离得到磁性微粒，保存备用；
S2、取所述步骤S1中的磁性微粒与无水乙醇按照等体积混合，超声活化25～35min后置于55～65℃水浴中，缓慢的滴加阿拉伯胶和木质素，两者的比例为(0.1～0.4)：1，在N2保护下搅拌反应9～12h，制成纳米微球。
上述猪巴氏杆菌多糖蛋白偶联疫苗的制备方法，包括以下步骤：
S1、多糖-纳米微球偶联体的制备：向pH为5～7的0.1mol/L TBS缓冲溶液中加入猪巴氏杆菌荚膜多糖与纳米微球，于室温下反应14～18h，反应结束后进行透析，除去未反应磁性纳米微球，制得多糖-纳米微球偶联体；
S2、多糖-纳米微球偶联体的改性：向所述步骤S1中的多糖-纳米微球偶联体中加入戊二酸，200r/min下搅拌反应5～8h，反应结束后用PBS缓冲液进行洗涤，制得改性多糖-纳米微球偶联体，4℃保存备用；
S3、猪巴氏杆菌多糖蛋白偶联疫苗的制备：向pH为5～7的0.1mol/L TBS缓冲溶液中加入所述步骤S2中的改性多糖-纳米微球偶联体和蛋白类载体，共反应22～26h，混合均匀，制得猪巴氏杆菌多糖蛋白偶联疫苗。
进一步地，所述猪巴氏杆菌荚膜多糖的制备方法，包括以下步骤：
S1、将猪巴氏杆菌接种于装有500mL BHI液体培养基的三角烧瓶中，在恒温培养摇床中振荡8～12h，振荡条件为28℃、160rpm，进行扩大培养，制得培养液A；
S2、低温离心培养液A，将离心所得沉淀用PBS缓冲液溶解并高压蒸汽灭菌，制得灭菌液B；
S3、将灭菌液B的上清液过滤，制得悬浮液C；
S4、向悬浮液C中加入1/2体积的十六烷基三甲基溴化铵，充分搅拌后4℃静置过夜，离心，收集沉淀物，得到复合多糖；
S5、将复合多糖溶入2mol/L氯化钙溶液中搅拌，充分溶解后离心取上清液，向上清液中加入两倍体积的80％乙醇，4℃静置2天，离心收集沉淀，沉淀溶于水，进行除蛋白、透析和冻干，制得猪巴氏杆菌荚膜多糖。
单纯的荚膜多糖由于其分子量较小导致免疫效果较差，研究表明载体蛋白与荚膜多糖联用增强了其免疫原性，同时能够提高细胞的免疫水平。但是，多糖和蛋白同为生物大分子，两者的结构在一定程度上会相互影响，这就会使得多糖的一些重要抗原表位易被蛋白质所屏蔽，从而降低多糖的免疫原性。
因此，在本发明的技术方案中，通过摸索荚膜多糖与破伤风类毒素的合适比例为(1.5～2.5)：1，在保证荚膜多糖原有的免疫原性的基础上，破伤风类毒素还可以增强其作用；其次，选择将荚膜多糖先与纳米微球进行反应，然后再对多糖纳米微球进行改性，使得荚膜多糖充分的与蛋白类载体结合，协同作用，增强了疫苗的预防作用；再者，本发明采用纳米微球作为荚膜多糖与破伤风类毒素的连接体，并且选用合适比例的高分子材料阿拉伯胶和木质素对纳米微球内部的磁性微粒进行包裹，增强了疫苗的疗效和使用安全性。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
(1)本发明猪巴氏杆菌多糖蛋白偶联疫苗以猪巴氏杆菌荚膜多糖与破伤风类毒素载体通过纳米微球连接而成，三者协同作用，不仅提高了疫苗的免疫原性，同时要保证了疫苗的使用安全性。
(2)本发明猪巴氏杆菌多糖蛋白偶联疫苗的制备方法不仅在培养工艺上有很大的提升，并且打破了传统的以活菌数为基础来进行制备疫苗，制备方法简单稳定，适合规模化工业生产的需要。
具体实施方式
以下通过具体实施例进一步描述本发明，本发明不仅仅限于以下实施例。在本发明的范围内或者在不脱离本发明的内容、精神和范围内，对本发明进行的变更、组合或替换，对于本领域的技术人员来说是显而易见的，且包含在本发明的范围之内。
本发明猪巴氏杆菌CVCC466由中国兽医药品监察所提供，阿拉伯胶CAS号9000-01-5，木质素CAS号8061-51-6，其它试剂均为常规市售产品。
实施例1、本发明猪巴氏杆菌荚膜多糖的制备
本发明实施例1猪巴氏杆菌荚膜多糖的制备方法，包括以下步骤：
S1、将猪巴氏杆菌接种于装有500mL BHI(脑心浸液琼脂)液体培养基的三角烧瓶中，在恒温培养摇床(28℃，160rpm)中振荡10h，进行扩大培养，制得培养液A；
S2、低温离心培养液A，将离心所得沉淀用PBS(磷酸缓冲盐溶液)溶解并高压蒸汽灭菌，制得灭菌液B；
S3、将灭菌液B的上清液过滤，制得悬浮液C；
S4、向悬液液C中加入1/2体积的十六烷基三甲基溴化铵，充分搅拌后4℃静置过夜，离心，收集沉淀物，得到复合多糖；
S5、将复合多糖溶于2mol/L氯化钙溶液中搅拌，充分溶解后离心取上清液，向上清液中加入两倍体积的80％乙醇，4℃静置2天，离心收集沉淀，沉淀溶于水，进行除蛋白、透析和冻干，制得猪巴氏杆菌荚膜多糖。
实施例2、本发明猪巴氏杆菌多糖蛋白偶联疫苗
本发明实施例2猪巴氏杆菌多糖蛋白偶联疫苗，包括猪巴氏杆菌荚膜多糖和破伤风类毒素，所述猪巴氏杆菌荚膜多糖和破伤风类毒素经纳米微球连接而成，所述猪巴氏杆菌荚膜多糖、破伤风类毒素和纳米微球的重量比为1.5：0.5：1。
所述纳米微球的内部为磁性微粒，所述磁性微粒通过阿拉伯胶和木质素进行包裹，所述阿拉伯胶和木质素的重量比为0.1：1。
所述纳米微球的制备方法，包括以下步骤：
S1、磁性微粒的制备：分别称取FeCl2·4H2O和FeCl3·6H2O分别溶解于蒸馏水中，配制成Fe2+浓度为0.2mol/L的溶液A和Fe3+浓度为0.125mol/L的溶液B，将溶液A和溶液B混合置入三口瓶中，加入去离子水在10000r/min条件下高速搅拌，搅拌的同时缓慢滴加3mol/L的氢氧化钠直至溶液变得黑亮，停止加入氢氧化钠，继续搅拌30min后加入油酸在10000r/min条件下高速搅拌1h，然后用无水乙醇和去离子水清洗干净，去除磁粒表面吸附的油酸，最后加以磁场分离得到磁性微粒，保存备用；
S2、取所述步骤S1中的磁性微粒与无水乙醇按照等体积混合，超声活化30min后置于60℃水浴中，缓慢的滴加阿拉伯胶和木质素，两者的比例为0.1：1，在N2保护下搅拌反应10h，制成纳米微球。
其中猪巴氏杆菌荚膜多糖通过实施例1的方法制备。
上述猪巴氏杆菌多糖蛋白偶联疫苗的制备方法，包括以下步骤：
S1、多糖-纳米微球偶联体的制备：向pH为6的0.1M TBS缓冲溶液(三乙醇胺缓冲盐溶液)中加入猪巴氏杆菌荚膜多糖与纳米微球，于室温下反应16h，反应结束后进行透析，除去未反应磁性纳米微球，制得多糖-纳米微球偶联体；
S2、多糖-纳米微球偶联体的改性：向所述步骤S1中的多糖-纳米微球偶联体中加入戊二酸，200r/min下搅拌反应7h，反应结束后用PBS缓冲液进行洗涤，制得改性多糖-纳米微球偶联体，4℃保存备用；
S3、猪巴氏杆菌多糖蛋白偶联疫苗的制备：向pH为6的0.1M TBS缓冲溶液中加入所述步骤S2中的改性多糖-纳米微球偶联体和破伤风类毒素，共反应22h，混合均匀，制得猪巴氏杆菌多糖蛋白偶联疫苗。
实施例3、本发明猪巴氏杆菌多糖蛋白偶联疫苗
本发明实施例3猪巴氏杆菌多糖蛋白偶联疫苗，包括猪巴氏杆菌荚膜多糖和破伤风类毒素，所述猪巴氏杆菌荚膜多糖和破伤风类毒素经纳米微球连接而成，所述猪巴氏杆菌荚膜多糖、破伤风类毒素和纳米微球的重量比为2：0.75：1。
所述纳米微球的内部为磁性微粒，所述磁性微粒通过阿拉伯胶和木质素进行包裹，所述阿拉伯胶和木质素的重量比为0.25：1。
所述纳米微球的制备方法，包括以下步骤：
S1、磁性微粒的制备：分别称取FeCl2·4H2O和FeCl3·6H2O分别溶解于蒸馏水中，配制成Fe2+浓度为0.2mol/L的溶液A和Fe3+浓度为0.125mol/L的溶液B，将溶液A和溶液B混合置入三口瓶中，加入去离子水在10000r/min条件下高速搅拌，搅拌的同时缓慢滴加3mol/L的氢氧化钠直至溶液变得黑亮，停止加入氢氧化钠，继续搅拌30min后加入油酸在10000r/min条件下高速搅拌1h，然后用无水乙醇和去离子水清洗干净，去除磁粒表面吸附的油酸，最后加以磁场分离得到磁性微粒，保存备用；
S2、取所述步骤S1中的磁性微粒与无水乙醇按照等体积混合，超声活化30min后置于60℃水浴中，缓慢的滴加阿拉伯胶和木质素，两者的比例为0.25：1，在N2保护下搅拌反应10h，制成磁性纳米微球。
其中猪巴氏杆菌荚膜多糖通过实施例1的方法制备。
上述猪巴氏杆菌多糖蛋白偶联疫苗的制备方法，包括以下步骤：
S1、多糖-纳米微球偶联体的制备：向pH为6的0.1M TBS缓冲溶液中加入猪巴氏杆菌荚膜多糖与纳米微球，于室温下反应18h，反应结束后进行透析，除去未反应磁性纳米微球，制得多糖-纳米微球偶联体；
S2、多糖-纳米微球偶联体的改性：向所述步骤S1中的多糖-纳米微球偶联体中加入戊二酸，200r/min下搅拌反应7h，反应结束后用PBS缓冲液进行洗涤，制得改性多糖-纳米微球偶联体，4℃保存备用；
S3、猪巴氏杆菌多糖蛋白偶联疫苗的制备：向pH为6的0.1M TBS缓冲溶液中加入所述步骤S2中的改性多糖-纳米微球偶联体和破伤风类毒素，共反应24h，混合均匀，制得猪巴氏杆菌多糖蛋白偶联疫苗。
实施例4、本发明猪巴氏杆菌多糖蛋白偶联疫苗
本发明实施例4猪巴氏杆菌多糖蛋白偶联疫苗，包括猪巴氏杆菌荚膜多糖和破伤风类毒素，所述猪巴氏杆菌荚膜多糖和破伤风类毒素经纳米微球连接而成，所述猪巴氏杆菌荚膜多糖、破伤风类毒素和纳米微球的重量比为2.5：1：1。
所述纳米微球的内部为磁性微粒，所述磁性微粒通过阿拉伯胶和木质素进行包裹，所述阿拉伯胶和木质素的重量比为0.4：1。
所述纳米微球的制备方法，包括以下步骤：
S1、磁性微粒的制备：分别称取FeCl2·4H2O和FeCl3·6H2O分别溶解于蒸馏水中，配制成Fe2+浓度为0.2mol/L的溶液A和Fe3+浓度为0.125mol/L的溶液B，将溶液A和溶液B混合置入三口瓶中，加入去离子水在10000r/min条件下高速搅拌，搅拌的同时缓慢滴加3mol/L的氢氧化钠直至溶液变得黑亮，停止加入氢氧化钠，继续搅拌30min后加入油酸在10000r/min条件下高速搅拌1h，然后用无水乙醇和去离子水清洗干净，去除磁粒表面吸附的油酸，最后加以磁场分离得到磁性微粒，保存备用；
S2、取所述步骤S1中的磁性微粒与无水乙醇按照等体积混合，超声活化30min后置于60℃水浴中，缓慢的滴加阿拉伯胶和木质素，两者的比例为0.4：1，在N2保护下搅拌反应10h，制成纳米微球。
其中猪巴氏杆菌荚膜多糖通过实施例1的方法制备。
上述猪巴氏杆菌多糖蛋白偶联疫苗的制备方法，包括以下步骤：
S1、多糖-纳米微球偶联体的制备：向pH为6的0.1mol/L TBS缓冲溶液中加入猪巴氏杆菌荚膜多糖与纳米微球，于室温下反应18h，反应结束后进行透析，除去未反应磁性纳米微球，制得多糖-纳米微球偶联体；
S2、多糖-纳米微球偶联体的改性：向所述步骤S1中的多糖-纳米微球偶联体中加入戊二酸，200r/min下搅拌反应8h，反应结束后用PBS缓冲液进行洗涤，制得改性多糖-纳米微球偶联体，4℃保存备用；
S3、猪巴氏杆菌多糖蛋白偶联疫苗的制备：向pH为6的0.1mol/L TBS缓冲溶液中加入所述步骤S2中的改性多糖-纳米微球偶联体和破伤风类毒素，共反应26h，混合均匀，制得猪巴氏杆菌多糖蛋白偶联疫苗。
对比例1
采用猪巴氏杆菌荚膜多糖疫苗代替本发明实施例3制备的猪巴氏杆菌多糖蛋白偶联疫苗。
对比例2
与实施例3相比，本对比例的区别仅在于：对所述步骤S1中的多糖-纳米微球偶联体不进行改性。
对比例3
与实施例3相比，本对比例的区别仅在于：所述猪多杀性巴氏杆菌荚膜多糖、破伤风类毒素和纳米微球的重量比为3：1.5：1。
对比例4
与实施例3相比，本对比例的区别仅在于：所述磁性微粒通过壳聚糖进行包裹。
对比例5
与实施例3相比，本对比例的区别仅在于：所述阿拉伯胶和木质素的重量比为0.6：1。
试验例一、猪巴氏杆菌多糖蛋白偶联疫苗安全性实验
1、试验材料：实施例2～4制备的猪巴氏杆菌多糖蛋白偶联疫苗；21日龄健康仔猪9头；
2、试验方法：9头健康仔猪分为3组，每组3头，各健康仔猪通过颈部肌肉注射4mL实施例2～4制备的猪巴氏杆菌多糖蛋白偶联疫苗，14日后观察每组仔猪的生存状况；
3、试验结果如表1所示。
表1实施例2～4制备的猪巴氏杆菌多糖蛋白偶联疫苗安全性实验
Figure BDA0001880517150000081
由上表1可知，本发明实施例2～4制备的猪巴氏杆菌多糖蛋白偶联疫苗安全性能好，仔猪注射后未出现明显的不良症状，注射局部无明显炎症反应，各脏器无明显病理变化，说明本发明猪巴氏杆菌多糖蛋白偶联疫苗具有良好的安全性能。
试验例二、猪巴氏杆菌多糖蛋白偶联疫苗效果评估实验
1、试验材料：实施例2～4和对比例1～5制备的猪巴氏杆菌多糖蛋白偶联疫苗；21日龄健康仔猪27头；
2、试验方法：21头健康仔猪分为9组，每组三头，各健康仔猪颈部肌肉分别注射实施例2～4和对比例1～5制备的猪巴氏杆菌多糖蛋白偶联疫苗1mL，其中对照组不注射，21日后，每组仔猪经鼻腔接种强毒株菌液，接种剂量为1.0×1010CFU/mL，14日后观察每组仔猪的生存情况；
3、试验结果如表2所示。
表2实施例2～4和对比例1～5制备的猪巴氏杆菌多糖蛋白偶联疫苗效果评估结果
Figure BDA0001880517150000091
由上表2可知：
(1)与对照组相比，本发明实施例2～4制备的猪巴氏杆菌多糖蛋白偶联疫苗对于巴氏杆菌感染具有很好的预防作用，接种疫苗后的仔猪感染后均无任何明显的临床症状；
(2)与实施例3相比，对比例1采用猪巴氏杆菌荚膜多糖疫苗代替本发明实施例3制备的猪巴氏杆菌多糖蛋白偶联疫苗，接种疫苗后的仔猪感染24h后均出现体温升高，精神沉郁，食欲减退或废绝，被毛蓬乱，呼吸困难，出现重度发病的状况；对比例2中对所述步骤S2中的多糖-纳米微球偶联体不进行改性，接种该疫苗后的仔猪感染24h后均出现体温升高，精神沉郁，出现轻度发病的状况；对比例3中所述猪多杀性巴氏杆菌荚膜多糖、破伤风类毒素和纳米微球的重量比为3：1.5：1，接种该疫苗后的仔猪感染24h后均出现体温升高，精神沉郁，食欲减退或废绝，出现中度发病的状况；对比例4采用的高分子材料为壳聚糖，接种该疫苗后的仔猪感染24h后均出现体温升高，精神沉郁，食欲减退或废绝，出现中度发病的状况；对比例5中阿拉伯胶和木质素的重量比为0.6：1，接种该疫苗后的仔猪感染24h后均出现体温升高，精神沉郁，出现轻度发病的状况，说明本发明猪巴氏杆菌多糖蛋白偶联疫苗中荚膜多糖与蛋白载体协同作用，比例合理，并且起连接作用的纳米微球采用合适比例的阿拉伯胶和木质素包裹后可以大大增强疫苗的预防效果。
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。

Claims (3)

1.一种猪巴氏杆菌多糖蛋白偶联疫苗，其特征在于，包括猪巴氏杆菌荚膜多糖和蛋白类载体，所述猪巴氏杆菌荚膜多糖和蛋白类载体经纳米微球连接而成，所述猪巴氏杆菌荚膜多糖、蛋白类载体和纳米微球的重量比为2：0.75：1；所述纳米微球的内部为磁性微粒，所述磁性微粒通过高分子材料进行包裹；所述高分子材料为阿拉伯胶和木质素，所述阿拉伯胶和木质素的重量比为0.25：1；
所述蛋白类载体为破伤风类毒素；
所述猪巴氏杆菌荚膜多糖的制备方法，包括以下步骤：
S1、将猪巴氏杆菌接种于装有500mL BHI液体培养基的三角烧瓶中，在恒温培养摇床中振荡8～12h，振荡条件为28℃、160rpm，进行扩大培养，制得培养液A；
S2、低温离心培养液A，将离心所得沉淀用PBS缓冲液溶解并高压蒸汽灭菌，制得灭菌液B；
S3、将灭菌液B的上清液过滤，制得悬浮液C；
S4、向悬浮液C中加入1/2体积的十六烷基三甲基溴化铵，充分搅拌后4℃静置过夜，离心，收集沉淀物，得到复合多糖；
S5、将复合多糖溶入2mol/L氯化钙溶液中搅拌，充分溶解后离心取上清液，向上清液中加入两倍体积的80％乙醇，4℃静置2天，离心收集沉淀，沉淀溶于水，进行除蛋白、透析和冻干，制得猪巴氏杆菌荚膜多糖。
2.如权利要求1所述猪巴氏杆菌多糖蛋白偶联疫苗，其特征在于，所述纳米微球的制备方法，包括以下步骤：
S1、磁性微粒的制备：称取FeCl2·4H2O和FeCl3·6H2O分别溶解于去离子水中，配制成Fe2+浓度为0.2mol/L的溶液A和Fe3+浓度为0.125mol/L的溶液B，将溶液A和溶液B混合置入三口瓶中，加入去离子水在10000r/min条件下搅拌，搅拌的同时缓慢滴加3mol/L的氢氧化钠直至溶液变得黑亮时，停止加入氢氧化钠，继续搅拌30min后加入油酸在10000r/min条件下高速搅拌1h，然后用无水乙醇和去离子水清洗干净，最后加以磁场分离得到磁性微粒，保存备用；
S2、取所述步骤S1中的磁性微粒与无水乙醇按照等体积加入，超声活化30min后，置于60℃水浴中，缓慢的滴加阿拉伯胶和木质素，两者比例为0.25：1，在N2保护下搅拌反应10h，制成纳米微球。
3.一种如权利要求1所述猪巴氏杆菌多糖蛋白偶联疫苗的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、多糖-纳米微球偶联体的制备：向pH为6的0.1mol/L TBS缓冲溶液中加入猪巴氏杆菌荚膜多糖与纳米微球，于室温下反应18h，反应结束后进行透析，除去未反应纳米微球，制得多糖-纳米微球偶联体；
S2、多糖-纳米微球偶联体的改性：向所述步骤S1中的多糖-纳米微球偶联体中加入戊二酸，200r/min下搅拌反应7h，反应结束后用PBS缓冲液进行洗涤，制得改性多糖-纳米微球偶联体，4℃保存备用；
S3、猪巴氏杆菌多糖蛋白偶联疫苗的制备：向pH为6的0.1mol/L TBS缓冲溶液中加入所述步骤S2中的改性多糖-纳米微球偶联体以及破伤风类毒素，共反应24h，混合均匀，制得猪巴氏杆菌多糖蛋白偶联疫苗。
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