CN109601367B - 抗霜霉病黄瓜种间杂种新品种的培育方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了抗霜霉病黄瓜种间杂种新品种的培育方法及应用。该培育方法包括以‘长春密刺’的高代自交系CCMC为母本，以黄瓜‑酸黄瓜渐渗系材料IL52为父本，进行杂交获得F1，杂种F1自交获得F2，并继续通过单粒传的方式构建F6重组自交系；通过对重组自交系群体进行4年的田间成株期霜霉病自然发病表型统计，筛选出抗性高且果实商品性较好的重组单株；利用回交及分子标记辅助选择获得dm5.2区段内基因型与IL52带型一致，而其他染色体区段为‘长春密刺’带型的单株即为抗霜霉病黄瓜种间杂种新品种。新品种具有高抗霜霉病性状和较高的产量和优良的果实品质。

Description

抗霜霉病黄瓜种间杂种新品种的培育方法及应用
技术领域
本发明属于蔬菜分子遗传育种技术领域，涉及抗霜霉病黄瓜种间杂种新品种的培育方法及应用。
背景技术
黄瓜(Cucumis sativus L.，2n＝2x＝14)是全世界大面积栽培的主要蔬菜之一，具有极高的社会价值和经济效益。黄瓜霜霉病是一种广泛发生的世界性病害，是黄瓜主要叶部病害之一，其具有潜育期短，再侵染频繁，流行性强和周年发生等特点，给黄瓜生产带来严重经济损失。防治黄瓜霜霉病最经济有效的方法就是培育抗病品种，因此抗霜霉病育种成为黄瓜抗病育种的主要目标之一。
黄瓜遗传基础狭窄，缺乏许多重要的抗性基因。因此，扩大栽培黄瓜品种基因池，发掘黄瓜近缘种优异抗性基因非常重要。酸黄瓜(Cucumis hystrix Chakr.，2n＝2x＝24)是黄瓜亚属中，黄瓜栽培种唯一的近缘野生种，具有霜霉病、南方根结线虫、蔓枯病和枯萎病等多种抗性，通过种间杂交技术，将普通栽培黄瓜CC3与酸黄瓜进行杂交获得种间杂种F1(2n＝2x＝19)，并进行染色体加倍获得异源四倍体Cucumis hytivus(2n＝4x＝38)，以异源四倍体C.hytivus为‘桥梁’，与栽培黄瓜CC3进行多次回交、自交获得渐渗系群体，这些黄瓜种间杂种群体携带了来自于酸黄瓜的优良性状，包括霜霉病抗性。
传统的黄瓜育种方法存在目标性状转育效率低，周期长等缺点。目前，黄瓜抗霜霉病品种主要依靠田间自然发病或苗期接种的方法进行表型鉴定，该方法不仅耗时长，需要大量的人力和物力，且容易受外界条件的影响，表型选择效率不高，选育难度大，育成的黄瓜品种存在霜霉病抗性不稳定，易受栽培环境影响等弊端。近年来，随着分子标记技术的发展，许多研究者利用与目标性状基因紧密连锁的分子标记对种质进行辅助选择，这一方法不受基因表达和环境因素的影响，可在早代进行选择且操作简单，很大程度上提高了选择的速度和准确性。其中InDel(Insertion/Deletion)分子标记是基于全基因组重测序开发的标记，因其在基因组内分布广、密度大、稳定性和多态率高，检测容易且具有共显性遗传，重复性好、对DNA质量要求较低等优点，可以高效准确地用于遗传图谱构建，利用与目标性状连锁的分子标记进行辅助育种。
发明内容
本发明的目的是提供一种高效的黄瓜种间杂种抗霜霉病性状的转育方法。
本发明的目的通过以下方案实现：
一种抗霜霉病黄瓜种间杂种新品种的培育方法，包括以下步骤：
(1)以‘长春密刺’的高代自交系CCMC为母本，以黄瓜-酸黄瓜渐渗系材料‘IL52’为父本，进行杂交得F1，杂种F1自交获得F2，并继续通过单粒传的方式构建F6重组自交系；通过对重组自交系群体进行4年的田间成株期霜霉病自然发病表型统计，筛选出抗性高且果实商品性较好的重组单株；
(2)回交及分子标记辅助选择
利用3个与抗霜霉病主效QTL dm5.2紧密连锁的InDel标记，从筛选出的高抗单株中继续基因型筛选，选取dm5.2区段为杂合，而其他染色体区段接近‘长春密刺’的高代自交系CCMC带型的单株；所述的3个与抗霜霉病主效QTL dm5.2紧密连锁的InDel标记的引物分别为：17ID76-F：SEQ ID NO.1/17ID76-R：SEQ ID NO.2；17ID129-F：SEQ ID NO.3/17ID129-R：SEQ ID NO.4；17ID185-F：SEQ ID NO.5/17ID185-R：SEQ ID NO.6；
选择其中高抗霜霉病且符合上述基因型的重组单株与‘长春密刺’的高代自交系CCMC进行回交，在回交1代中继续选择dm5.2区段为杂合，而其他染色体区段接近’长春密刺’的高代自交系CCMC带型的单株与‘长春密刺’的高代自交系CCMC进行回交；在回交2代后，选取dm5.2区段为杂合，而其他染色体区段几乎是‘长春密刺’的高代自交系CCMC带型的单株进行自交，选取dm5.2区段为杂合的单株进行自交，最后获得dm5.2区段内基因型与‘IL52’带型一致，而其他染色体区段为‘长春密刺’的高代自交系CCMC带型的单株即为抗霜霉病黄瓜种间杂种新品种。
其中，所述的抗霜霉病黄瓜种间杂种新品种具有以下特性：
所述的抗霜霉病黄瓜种间杂种新品种基本具有华北型黄瓜‘长春密刺’的高代自交系CCMC的性状，并具有霜霉病抗性，且为自交系；
所述的抗霜霉病黄瓜种间杂种新品种为强雌系，植株长势强，节间长10-12.5厘米，茎粗0.6-0.75厘米，叶片绿色，平均最大叶片面积为23×22厘米，第一雌花节位在7-11节，以后每节均有一朵雌花出现，商品瓜为线形，绿色，瓜刺白色，数量较多，平均瓜长22-26厘米，粗3-4厘米，主侧蔓均可结瓜。
作为本发明方法的优选，步骤(2)中所述的基因型筛选是利用所述的3个与抗霜霉病主效QTL dm5.2紧密连锁的InDel标记的引物对对筛选出的高抗单株基因组DNA进行PCR扩增，扩增产物于6％非变性聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳；InDel标记17ID76在‘长春密刺’的高代自交系CCMC和极端高感霜霉病的RIL单株中扩增出相同的107bp大小的单一条带，而在‘IL52’和极端高抗霜霉病的RIL单株中扩增出相同的114bp大小单一条带；InDel标记17ID129在‘长春密刺’的高代自交系CCMC和极端高感霜霉病的RIL单株中扩增出相同的155bp大小的单一条带，而在‘IL52’和极端高抗霜霉病的RIL单株中扩增出相同的148bp大小单一条带；InDel标记17ID185在‘长春密刺’的高代自交系CCMC和极端高感霜霉病的RIL单株中扩增出相同的97bp大小的单一条带，而在‘IL52’和极端高抗霜霉病的RIL单株中扩增出相同的100bp大小单一条带。
作为本发明方法的优选，所述的PCR扩增反应体系组成为：2×Taq Master Mix10.0μL，ddH2O 4.0μL，正、反向引物各2.0μL，DNA(10ng/uL)2.0μL，反应总体积为20μL。反应程序为94℃预变性5min；每个循环94℃预变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，共35个循环；72℃延伸10min，4℃保存。
用于抗霜霉病黄瓜种间杂种新品种的选育的3个与抗霜霉病主效位点紧密连锁的InDel分子标记，所述的InDel分子标记来源于黄瓜-酸黄瓜渐渗系材料IL52，其引物如下:分子标记17ID76的引物为17ID76-F：SEQ ID NO.1/17ID76-R：SEQ ID NO.2；分子标记17ID129的引物为17ID129-F：SEQ ID NO.3/17ID129-R：SEQ ID NO.4；分子标记17ID185的引物为17ID185-F：SEQ ID NO.5/17ID185-R：SEQ ID NO.6。
本发明所述的3个与抗霜霉病主效位点紧密连锁的InDel分子标记在抗霜霉病黄瓜种间杂种新品种选育中的应用。
本发明所述的与抗霜霉病主效位点紧密连锁的InDel分子标记引物，选自以下任意一对引物:分子标记17ID76的引物为17ID76-F：SEQ ID NO.1/17ID76-R：SEQ ID NO.2；分子标记17ID129的引物为17ID129-F：SEQ ID NO.3/17ID129-R：SEQ ID NO.4；分子标记17ID185的引物为17ID185-F：SEQ ID NO.5/17ID185-R：SEQ ID NO.6。
本发明所述的与抗霜霉病主效位点紧密连锁的InDel分子标记引物在抗霜霉病黄瓜种间杂种新品种选育中的应用。
按照本发明所述的培育方法选育得到的抗霜霉病黄瓜种间杂种新品种在选育抗霜霉病黄瓜杂交种中的应用。
在本发明的一个优选实施例中，将按照本发明所述的培育方法选育得到的抗霜霉病黄瓜种间杂种新品种与配合力高的普通栽培黄瓜按3：1种植，并进行正常的植株管理，在开花期进行隔离，然后以所述的抗霜霉病黄瓜种间杂种新品种为母本，普通栽培黄瓜为父本进行人工授粉，采收所述的抗霜霉病黄瓜种间杂种新品种植株上的成熟果实，剖瓜洗种，将种子晾晒烘干，即得到抗霜霉病的杂种一代种子。
有益效果：
(1)本专利中霜霉病抗性新品种是通过黄瓜种间杂交技术培育的，将野生近缘种酸黄瓜的霜霉病抗性转移到普通栽培黄瓜品种中，该抗霜霉病黄瓜种间杂种新品种培育技术为国际首例，可加速黄瓜霜霉病抗性育种进程。
(2)利用本发明中与黄瓜-酸黄瓜渐渗系抗霜霉病主效QTL紧密连锁的3个分子标记，在RIL群体中16个极抗霜霉病单株和16个极感霜霉病单株中的抗霜霉病位点选择效率为100％，这3个分子标记可作为鉴定基于IL52的霜霉病抗性品种的连锁标记，提高育种效率。
(3)本专利中的高抗霜霉病的黄瓜种间杂种新品种是华北型黄瓜自交系品种，有较高的产量和优良的果实品质，可直接作为改良其他霜霉病抗性品种的骨干亲本。
附图说明
图1：感霜霉病品种(左边植株)与抗霜霉病黄瓜-酸黄瓜渐渗系‘IL52’(右边植株)在成株期田间自然发病情况下的霜霉病抗性表现
图2：抗霜霉病黄瓜种间杂种新品种的育种技术路线
图3：分子标记在双亲，F1和育种筛选群体中极端抗、感霜霉病单株中的验证结果
图4：新品种DMR114(左边植株)和感病对照(右边植株)在田间霜霉病自然发病情况下的抗性表现
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
举例说明本发明的具体实施过程，使本领域技术人员按照其不需要创造性劳动就能完成该发明即可，实施例的限定不能作为限定发明人保护范围的局限。
实施例1：抗霜霉病黄瓜种间杂种新品种DMR114的培育及应用，包括：
1、亲本的性状：
(1)霜霉病抗性供体亲本IL52
IL52(Zhang K,Wang X,Zhu W,et al.Complete resistance to powdery mildewand partial resistance to downy mildew in a Cucumis hystrix,introgressionline of cucumber were controlled by a co-localized locus[J].Theoretical&Applied Genetics,2018,131:2229-2243.)是黄瓜-酸黄瓜渐渗系材料之一，植株生长势强，多侧枝，侧蔓结果为主，商品瓜形状为椭圆形，高抗霜霉病。
(2)华北生态型受体亲本‘长春密刺’的高代自交系CCMC
‘长春密刺’的高代自交系CCMC(管苇、张云霞、杨树琼、陈劲枫、娄群峰；黄瓜倍性材料创制及染色体组成的FISH鉴定[J].中国农业科学，2014,47(17)：3513-3522；以及Zhang K,Wang X,Zhu W,et al.Complete resistance to powdery mildew and partialresistance to downy mildew in a Cucumis hystrix,introgression line ofcucumber were controlled by a co-localized locus[J].Theoretical&AppliedGenetics,2018,131:2229-2243.均有记载)是由华北鲜食类型F1品种‘长春密刺’经过多代自交获得的自交系，植株生长势强，少侧枝，主蔓结果为主，商品瓜条形状为棒状，但易感霜霉病。
2、抗霜霉病基因的具体转育与选择过程：
(1)抗霜霉病基因的转育
将感霜霉病黄瓜‘长春密刺’的高代自交系CCMC和抗霜霉病黄瓜-酸黄瓜渐渗系‘IL52’同时进行浸种、催芽、播种、定植及正常的植株管理。
在开花期，以‘长春密刺’为母本，以IL52为父本，进行杂交得F1，具体操作为：在授粉前一天下午，将第二天要开放的‘长春密刺’的高代自交系CCMC的雌花蕾和‘IL52’的雄花蕾进行套花隔离，开花当天上午8点，将‘IL52’的雄花花粉授到‘长春密刺’的高代自交系CCMC的雌花柱头上，3朵雄花授一朵雌花，并继续对授粉后的雌花套花隔离三天。
杂种F1自交获得F2，并继续通过单粒传的方式构建了一套含有155个株系的F6重组自交系。通过对重组自交系群体进行3年的田间成株期霜霉病自然发病表型统计，筛选出抗性高且果实商品性较好的重组单株。
(2)回交及分子标记辅助选择
利用3个与抗霜霉病主效QTL dm5.2紧密连锁的InDel标记，筛选出的高抗单株中继续基因型筛选，选取dm5.2区段为杂合，而其他染色体区段接近‘长春密刺’的高代自交系CCMC带型的单株。该单株高抗霜霉病，多侧枝，商品瓜条形状为圆筒形，可后续与‘长春密刺’进行回交，以获得具有‘长春密刺’的高代自交系CCMC的表型且具有霜霉病抗性的品种。
分子标记基因型筛选的PCR扩增反应体系组成为：2×Taq Master Mix 10.0μL，ddH2O 4.0μL，正、反向引物各2.0μL，DNA(10ng/uL)2.0μL，反应总体积为20μL。反应程序为94℃预变性5min；每个循环94℃预变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，共35个循环；72℃延伸10min，4℃保存。
PCR产物检测：取出扩增产物中1.5μl样品于6％非变性聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳；接通电极，在120V恒定电压下电泳1.5小时，关闭电源；取下凝胶，银染显色结果显示，InDel标记17ID76在‘长春密刺’的高代自交系CCMC和极端高感霜霉病的RIL单株中扩增出相同的107bp大小的单一条带，而在‘IL52’和极端高抗霜霉病的RIL单株中扩增出相同的114bp大小单一条带；InDel标记17ID129在‘长春密刺’的高代自交系CCMC和极端高感霜霉病的RIL单株中扩增出相同的155bp大小的单一条带，而在‘IL52’和极端高抗霜霉病的RIL单株中扩增出相同的148bp大小单一条带；InDel标记17ID185在‘长春密刺’的高代自交系CCMC和极端高感霜霉病的RIL单株中扩增出相同的97bp大小的单一条带，而在‘IL52’和极端高抗霜霉病的RIL单株中扩增出相同的100bp大小单一条带。(图3)。
选择其中高抗霜霉病且符合上述基因型的重组单株RIL114与‘长春密刺’的高代自交系CCMC进行回交，在回交1代中继续选择dm5.2区段为杂合，而其他染色体区段接近‘长春密刺’的高代自交系CCMC带型的单株RIL114-BC1与‘长春密刺’的高代自交系CCMC进行回交；在回交2代后，选取dm5.2区段为杂合，而其他染色体区段几乎是‘长春密刺’的高代自交系CCMC带型的单株进行自交，选取dm5.2区段为杂合的单株RIL114-BC2进行自交，最后获得dm5.2区段内基因型与‘IL52’带型一致，而其他染色体区段为‘长春密刺’的高代自交系CCMC带型的单株DMR114。
3、抗霜霉病黄瓜种间杂种新品种DMR114的特性：
DMR114基本具有华北型黄瓜‘长春密刺’的性状，并具有霜霉病抗性，且为自交系。
DMR114为强雌系，植株长势强，节间长10-12.5厘米，茎粗0.6-0.75厘米，叶片绿色，平均最大叶片面积为23×22厘米，第一雌花节位在7-11节，以后每节均有一朵雌花出现，商品瓜为线形，绿色，瓜刺白色，数量较多，平均瓜长22-26厘米，粗3-4厘米，主侧蔓均可结瓜。
4、抗霜霉病黄瓜种间杂种新品种DMR114应用：
将DMR114与配合力高的普通栽培黄瓜按3：1种植，并进行正常的植株管理。在开花期进行隔离，然后以DMR114为母本，普通栽培黄瓜为父本进行人工授粉。采收DMR114植株上的成熟果实，剖瓜洗种，将种子晾晒烘干，即得到抗霜霉病的杂种一代种子。
序列表
<110> 南京农业大学
<120> 抗霜霉病黄瓜种间杂种新品种的培育方法及应用
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
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<211> 23
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gtcatactgg tgtgatgagc aaa 23
<210> 6
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
tttttggtta gttttcgtta tatttgaa 28

Claims (2)

1.用于抗霜霉病黄瓜种间杂种新品种的选育的与抗霜霉病主效位点紧密连锁的InDel分子标记引物，其特征在于所述的InDel分子标记来源于黄瓜-酸黄瓜渐渗系材料‘IL52’，其引物如下:分子标记17ID76的引物为17ID76-F：SEQ ID NO.1/17ID76-R：SEQ ID NO.2；分子标记17ID129的引物为17ID129-F：SEQ ID NO.3/17ID129-R：SEQ ID NO.4。
2.权利要求1所述的InDel分子标记引物在抗霜霉病黄瓜种间杂种新品种选育中的应用。
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