CN109589322A - 植物提取物甜菜碱在制备治疗白癜风药物中的用途 - Google Patents
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Abstract
本发明医药技术领域，涉及植物提取的天然甜菜碱在制备治疗白癜风药物中的用途。本发明经细胞实验表明，天然甜菜碱对人黑素细胞具有良好的促增殖、抗凋亡及抗氧化效应，可显著缓解氧化应激对黑素细胞迁移和黑素生成的抑制效应；实验还显示2mM甜菜碱可显著抑制氧化损伤所致黑素细胞的凋亡，能显著改善高浓度氧化损伤对黑素细胞迁移与黑素合成的抑制效应；甜菜碱对人体皮肤角质形成细胞具有较强的安全性，可按常规药剂学制备成药物制剂，如口服制剂、静脉或透皮吸收的药物制剂，以及用于白癜风组织工程技术中，如用于制备细胞培养增效剂。
Description
技术领域
本发明医药技术领域，涉及植物提取物甜菜碱在制药中的新用途，具体涉及植物提取的天然甜菜碱在制备治疗白癜风药物中的用途。
背景技术
现有技术公开了白癜风是一种常见的获得性、特发性色素减退性皮肤病，其临床特征表现为由局部黑素细胞缺失引起的色素脱失斑；统计显示，其发病率高，自发缓解率低，对患者生活质量影响较大。研究显示，白癜风的发病通常与外伤、日晒、精神创伤、怀孕等因素有关，其具体病因与发病机制迄今尚不甚明确。目前，学界一致认为白癜风的发病可能起始于外因诱发的氧化应激状态，继而促使黑素细胞蛋白结构发生修饰变成新的抗原分子，激活自身免疫应答反应；机体异常的免疫应答反应又同时诱导一种慢性炎性环境，导致ROS蓄积，从而对周围细胞发挥细胞毒性作用。有研究表明，氧化应激在白癜风的起始与进展阶段发挥关键作用，高水平ROS可干扰L-苯丙氨酸(黑素合成关节酶酪氨酸酶的前体)的摄入，氧化并抑制黑素产生调控激素ACTH和α-MSH的生物活性，抑制黑素细胞的粘附、迁移及黑素合成；同时，长期的慢性氧化应激，可下调黑素细胞和角质细胞的WNT通路活性，诱导黑素干细胞分化能力受损、改变黑素细胞转化的能力，并诱发黑素细胞凋亡。目前临床常用的白癜风治疗方法有，抗炎、抗氧化及免疫调节药物，UVB光疗，光化学疗法，细胞和组织移植等等，总而言之，临床实践中对于白癜风的治疗干预相对比较困难。
天然甜菜碱主要从天然植物(如甜菜、枸杞、豆类等)的根茎叶及果实中提取，其有效成分为三甲基甘氨酸，具有维持细胞渗透压、缓和应激和酶保护等多种生物学效应。目前应用于抗肿瘤、降血压、抗消化性溃疡及胃肠功能障碍，以及肝脏疾病的治疗。
迄今，尚未见有关甜菜碱用于白癜风药物治疗及用于组织工程技术中的相关报道。
基于现有技术的现状，本申请的发明人拟提供植物提取物甜菜碱在制药中的新用途，具体涉及植物提取的天然甜菜碱在制备治疗白癜风药物中的用途。
发明内容
本发明的目的在于提供植物提取物甜菜碱在制药中的新用途，具体涉及植物提取的天然甜菜碱在制备治疗白癜风药物中的用途。
本发明还提供甜菜碱在用于组织工程技术中的应用。
本发明的第一方面，提供了天然甜菜碱在制备白癜风治疗药物中的应用。
所述的植物提取甜菜碱，由上海士锋利生物科技有限公司供货，货号B10860。
本发明经细胞实验表明，天然甜菜碱对人黑素细胞具有良好的促增殖、抗凋亡及抗氧化效应，可显著缓解氧化应激对黑素细胞迁移和黑素生成的抑制效应；0.5-5mM天然甜菜碱对健康人群(Pig1)或白癜风患者黑素细胞(Pig3V)均具有良好的促增殖效应，其中以2mM最为显著，PIG1增殖水平升高约38.6％，而PIG3V增殖水平升高约41％；不同浓度甜菜碱对黑素细胞具有不同的抗氧化效应，2mM甜菜碱对Pig1细胞的抗氧化效应最佳，Pig3V以5mM甜菜碱最为显著；甜菜碱对角质形成细胞的抗氧化效应则与干预浓度呈正相关。在此基础上，本发明进一步实验显示2mM甜菜碱可显著抑制氧化损伤(1mM H2O2)所致黑素细胞的凋亡，Pig1与Pig3V的细胞凋亡率均可降低约50％；实验还显示2mM能显著改善高浓度氧化损伤对黑素细胞迁移与黑素合成的抑制效应。
同时，本发明的实验结果表明，甜菜碱对人体皮肤角质形成细胞具有较高的安全性，其中1-10mM的甜菜碱对HaCaT细胞的增殖无明显影响，表明2mM甜菜碱具有较强的安全性。
本发明的甜菜碱可以按常规药剂学制备成药物制剂，如口服制剂、静脉或透皮吸收的药物制剂等。
本发明的第二方面，提供了甜菜碱在白癜风组织工程技术中如，用于制备细胞培养增效剂中的应用。
本发明细胞实验显示，天然甜菜碱对白癜风患者黑素细胞具有良好的促增殖活性，其中2mM甜菜碱效果最佳；同时，天然甜菜碱对皮肤角质形成细胞具有较高的安全性，进一步，本发明提供一种实验显示的增效剂，尤其是人体黑素细胞培养的增效剂，所述药物其活性成分为植物提取甜菜碱。
本发明所述的药用载体，即药学上可接受的载体，是指药学领域中常用的除活性成分以外添加物，例如稀释剂(淀粉类、糖类、纤维素类和无机盐类)、赋形剂等，填充剂如淀粉蔗糖、粘合剂如水、乙醇、纤维素衍生物、明胶和聚乙烯吡咯烷酮，崩解剂如干淀粉、羧甲基淀粉钠，增溶剂如聚山梨酯类和聚氧乙烯脂肪酸酯类等，吸收促进剂、表面活性剂如吐温、司盘，吸附载体、润滑剂如硬脂酸镁、微粉硅胶等；另外，还可以在组合物中加入其它辅料如香味剂、甜味剂等。
本发明为植物提取甜菜碱开辟了新的用途，将其用于白癜风治疗药物或组织工程细胞培养的增效剂，具有良好的临床应用前景。
附图说明
图1.不同浓度甜菜碱对人体黑素细胞，其中，(A)和角质形成细胞(B)增殖的影响，*，P＜0.05；**，P＜0.01；***，P＜0.001。
图2.不同浓度甜菜碱干预氧化损伤Pig1细胞的氧化自由基(ROS)水平检测，其中，*，P＜0.05；**，P＜0.01。
图3.不同浓度甜菜碱干预氧化损伤Pig3V细胞的氧化自由基(ROS)水平检测，其中，*，P＜0.05；**，P＜0.01。
图4.不同浓度甜菜碱干预氧化损伤HaCaT细胞的氧化自由基(ROS)水平检测，其中，**，P＜0.01。
图5.甜菜碱可抑制氧化应激所致黑素细胞的凋亡效应，其中，*，P＜0.05；**，P＜0.01。
图6. 2mM甜菜碱可显著缓解氧化应激对黑素细胞迁移的抑制效应，其中，**，P＜0.01。
图7. 2mM甜菜碱可缓解氧化应激对人黑素细胞产黑素水平的损伤效应，其中，**，P＜0.01。
下面结合本发明的实施例对本发明作详细说明，以下实施例是在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
具体实施方式
实施例1.不同浓度甜菜碱对人体黑素细胞和角质形成细胞增殖活性的检测实验
实验材料：植物提取甜菜碱购自上海士锋利生物科技有限公司购买，货号B10860；
Pig1和Pig3V细胞(由美国芝加哥洛约拉大学Caroline Le Poole教授馈赠)，Pig1为健康人体黑素细胞株，Pig3V为白癜风患者黑素细胞株。HaCaT细胞为角质形成细胞株，由华山医院中心实验室提供；
细胞培养箱(Thermo Scientific 8000)，光学显微镜(XDS-1A)，CCK-8(碧云天)，酶标检测仪(Thermo MK3型)，摇床(Qilinbeier TS-1000)；
实验方法：待细胞生长至对数生长期时，调整细胞密度为1×105cells/mL，接种至96孔板，每孔接种200μL，37℃，5％CO2培养；次日细胞给予不同浓度的甜菜碱(0，0.5，1，2，5，10和20mM)，12h后进行CCK8检测；每孔加入20μL的CCK-8，37℃，5％CO2培养箱内培养避光孵育1～4h，酶标仪450nm波长测出同一时间点OD值，用测得的OD值进行统计学分析；
实验结果如图1A所示，0.5-5mM天然甜菜碱对人黑素细胞具有良好的促增殖效应，其中以2mM干预效果最为显著，PIG1增殖水平升高约38.6％，而PIG3V增殖水平升高约41％；而更高浓度(10-20mM)则无明显影响，提示甜菜碱对黑素细胞具有较高的安全谱，而2mM对人黑素细胞具有最佳的促增殖活性；同时，本发明评估了不同浓度甜菜碱对人角质形成细胞增殖活性的影响(如图1B所示)，CCK8结果显示1，2，5和10mM的甜菜碱对HaCaT细胞的生长无明显影响，各组间无统计学差异，表明甜菜碱对角质形成细胞的安全谱较高，中高浓度甜菜碱无明显毒副作用。
实施例2.不同浓度甜菜碱对氧化损伤黑素细胞及角质形成细胞的抗氧化效应检测
实验材料：甜菜碱、黑素细胞(Pig1和Pig3V细胞)以及角质形成细胞(HaCaT细胞)同实施例1；DHE荧光探针(上海碧云天生物技术有限公司)；
细胞培养箱(Thermo Scientific 8000)，光学显微镜(XDS-1A)，倒置拍照显微镜(OLYMPUS，IX71)；
实验分组：三种细胞Pig1、Pig3V和HaCaT细胞，均分为对照组、模型组与甜菜碱干预组，黑素细胞模型组为0.4mM H2O2，角质形成细胞为0.2mM H2O2。甜菜碱干预浓度设定，Pig1细胞为0.25-10mM，Pig3V细胞为0.25-50mM，HaCaT细胞为1-10mM；
待细胞长满后调整细胞浓度为5×105cells/ml，接种于96孔培养板，每孔100μl，37℃，5％CO2培养箱内培养24h，观察细胞80％粘连；按照分组对细胞进行处理，4-8h后吸弃培养液，加入浓度为10μM的DHE荧光探针溶液，在37℃细胞培养箱内孵育20分钟，后用无血清细胞培养液洗涤细胞三次，以充分去除未进入细胞内的DHE，用荧光显微观察细胞荧光强度拍照并分析荧光强度；
实验结果如图2-4所示，Pig1细胞的氧化自由基水平(ROS)检测结果显示：模型组的ROS明显增多，与模型组相比，甜菜碱给药组中，0.25mM和0.5mM组与模型组无明显差异；1mM，2mM和5mM时明显低于模型组，且以2mM最为明显；Pig3V细胞的ROS检测结果显示：模型组的ROS明显增多，与模型组相比，甜菜碱给药组中，0.25mM，0.5mM和5mM组明显低于模型组，具有统计学意义，以5mM最为显著；而20mM和50mM的甜菜碱浓度过高，导致细胞明显死亡；HaCaT细胞的ROS检测结果显示：模型组的ROS明显增多，与模型组相比，甜菜碱给药组中，1mM，2mM，5mM和10mM组显著低于模型组，且甜菜碱浓度越高，保护效应约强，均具有统计学意义；
实验表明，甜菜碱对人黑素细胞和黑素细胞均具有轻度的抗氧化保护作用，对健康黑素细胞Pig1的保护作用优于白癜风黑素细胞Pig3V。
实施例3.甜菜碱对氧化损伤所致人黑素细胞凋亡的保护效应检测
实验材料：甜菜碱、黑素细胞Pig1和Pig3V细胞同实施例1；DHE荧光探针(上海碧云天生物技术有限公司)；
细胞培养箱(Thermo Scientific 8000)，Annexin V-FITC/PI试剂盒(贝博生物401006)，75％乙醇(无锡展望)；流式细胞仪(BD-FACSVerse)(BD-C6)；
实验方法：两种细胞各分为4组：对照组(Control)，模型组(1mM H2O2)，模型组(1mMH2O2)，模型组+甜菜碱(2mM)，模型组+甜菜碱(5mM)；
根据上述分组对细胞进行不同处理后，收集进行细胞凋亡检测：用不含EDTA的胰酶消化收集后(注：胰酶消化时间不宜过长，否则会影响细胞膜上磷脂酰丝氨酸与AnnexinV-FITC的结合)，在室温中，1500rpm离心5min，收集细胞；细胞洗涤，用预冷1*PBS(4℃)重悬细胞一次，1500rpm离心5min，洗涤细胞；加入300μL的1*Binding Buffer悬浮细胞；AnnexinV-FITC标记，加入5μL的Annexin V-FITC混匀后，避光，室温孵育15min；PI标记，再加入10μL的PI染色，轻轻混匀细胞，于避光条件下室温孵育10min。流式细胞仪检测，CELL Quest软件分析；
实验结果如表1与图5所示，凋亡检测结果显示：模型组细胞有明显的黑素细胞凋亡，2mM和5mM甜菜碱给药后两种黑素细胞凋亡率明显下降，且2mM甜菜碱保护效果优于5mM浓度。
表1甜菜碱对氧化损伤黑素细胞凋亡率的影响。
实施例4.2mM甜菜碱缓解氧化应激对人黑素细胞迁移的抑制效应实验
实验材料：甜菜碱、黑素细胞Pig1和Pig3V细胞同实施例1；Matrigel(BDIncorporated，USA)，-20℃保存；Tanswell plate(Costar，Coring Incorporated，USA)，聚碳酯膜微孔(0.8μm)，苏木素染液。细胞培养箱(Thermo Scientific 8000)，光学显微镜(XDS-1A)，倒置拍照显微镜(OLYMPUS，IX71)；
实验方法：两种细胞各分为3组：对照组(Control)，模型组(1mM H2O2)，模型组(1mMH2O2)，模型组+甜菜碱(2mM)；
人工基底膜制备：取出-20℃保存的Matrigel胶，将其在4℃下过夜解冻，以无血清专用培养液按照体积3∶1稀释Matrigel胶；将Boyden小室放置到24孔培养板，形成上下两室。将制备的人工基底膜100μL加入每个Boyden小室的上室，37℃孵育2-6h使其呈凝胶状。待细胞长满后调整细胞浓度，于上室加入300μL细胞悬液，在下室内加入600μL的含有趋化因子的培养液，按照上述分组对细胞进行不同的处理后放入细胞培养箱，在37℃，5％CO2条件下培养48h，取出小室，吸弃上室液体，用棉签仔细擦净，37℃预温的PBS液漂洗两次，用冰预冷的4％多聚甲醛固定30min，苏木素染色5min。小心将聚碳酯膜自上室基底切取下来，封片后在显微镜下计数，200倍光镜随机选择3个视野计数，取平均值；
实验结果如图6所示，经1mM H2O2处理后，Pig1细胞和Pig3V细胞的迁移效率分布降低95％和86％(P＜0.01)；随着2mM甜菜碱的介入，迁移的细胞数目明显升高，Pig1细胞恢复至对照组迁移水平的58.7％，而Pig3V细胞则恢复至对照组迁移水平的43％，P值均小于0.01，表明2mM甜菜碱显著改善高浓度氧化损伤对黑素细胞迁移的抑制效应。
实施例5. 2mM甜菜碱缓解氧化应激对人黑素细胞黑素合成水平的损伤效应实验
实验材料：甜菜碱、黑素细胞Pig1和Pig3V细胞同实施例1；细胞培养箱(ThermoScientific 8000)，光学显微镜(XDS-1A)，酶标分析仪(北京普朗新技术有限公司，DNM-9602)；
实验分组同实施例4；按照上述分组对细胞进行不同处理，24h后进行黑素的测定；丢弃培养基后，PBS洗涤1次，调整细胞密度，收集10^6个细胞；2500rpm离心10min；弃上清，加1M的NaOH/10％DMSO 1ml溶解细胞，100℃加热30min；用酶标仪测定400nm下的吸光值；
实验结果如图7所示，测定结果表明：经1mM H2O2处理后，Pig1细胞的产黑素水平降低为对照组的42.5％(P＜0.01)，Pig3V细胞的产黑素水平降至对照组的59.4％(P＜0.01)；而随着2mM甜菜碱的介入，两组黑素细胞的黑素表达水平显著恢复，分别恢复至对照组的77.3％(Pig1)和81.6％(Pig3V)，P值均低于0.01；结果表明，2mM甜菜碱能显著改善氧化应激对人体黑素细胞黑素水平的损伤效应加。
Claims (8)
1.植物提取物甜菜碱在制备治疗白癜风药物中的用途。
2.按权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的甜菜碱对人黑素细胞促增殖、抗凋亡及抗氧化。
3.按权利要求2所述的用途，其特征在于，所述的甜菜碱抗氧化浓度为2mM。
4.按权利要求2所述的用途，其特征在于，所述的甜菜碱抗黑素细胞凋亡浓度为2mM。
5.按权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的甜菜碱缓解氧化应激对黑素细胞迁移和黑素生成的抑制。
6.按权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的甜菜碱缓解氧化应激对黑素细胞迁移和黑素生成的抑制的浓度为2mM。
7.按权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的甜菜碱在用于制备细胞培养增效剂中的用途。
8.按权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的药物制成口服制剂、静脉或透皮吸收的药物制剂。
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Legal Events
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|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
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Application publication date: 20190409 |