CN109580864A

CN109580864A - 一种动物性食品中那西肽残留的检测方法

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Publication number: CN109580864A
Application number: CN201910119392.6A
Authority: CN
Inventors: 贺利民; 谢景梦; 曾振灵; 汤有志; 苏贻娟
Original assignee: South China Agricultural University
Current assignee: South China Agricultural University
Priority date: 2019-02-18
Filing date: 2019-02-18
Publication date: 2019-04-05
Anticipated expiration: 2039-02-18
Also published as: CN109580864B

Abstract

本发明提供了一种动物性食品中那西肽残留的检测方法，属于兽药残留检测领域。本发明提供的动物性食品中那西肽残留的检测方法，包含以下步骤：将动物性食品的肌肉组织依次经碱溶液水解、除脂和调节pH值后，经固相萃取洗脱，得到洗脱液；将所述洗脱液依次经吹干、溶解和过滤，得到滤液；对所述滤液进行液相色谱‑串联质谱分析检测4‑羟甲基‑3‑甲基吲哚‑2‑甲酸的含量，根据所述那西肽标准对应的4‑羟甲基‑3‑甲基吲哚‑2‑甲酸的含量计算得到所述动物性食品中那西肽残留的含量。本发明提供的检测方法具有高选择性和高灵敏度的特点，能够高效检测出动物肌肉组织中那西肽残留的含量。

Description

一种动物性食品中那西肽残留的检测方法

技术领域

本发明涉及兽药残留检测领域，尤其涉及一种动物性食品中那西肽残留的检测方法。

背景技术

那西肽是一种由链霉菌产生的含硫多肽类抗生素，能够有效抑制革兰氏阳性菌生长，在畜牧业中被广泛用于预防和治疗呼吸道疾病和肠炎等细菌性感染。同时，那西肽能够有效促进动物生长，常作为促生长剂被添加到饲料中，用于提高猪、家禽和鱼类等动物的生长速度和饲料转化率。然而由于养殖户缺乏药物残留潜在危害的意识，在实际生产中滥用及不合理用药的现象，可能导致那西肽在动物性食品中残留，通过食物链进入人体危及人类健康。

目前，国内外报道的用于动物性食品中那西肽残留的检测方法主要包括微生物法、气相色谱-质谱联用法和高效液相色谱法。其中高效液相色谱法因其操作简单，准确度高等优势成为目前动物性食品中那西肽残留物检测的首选。然而，由于动物性食品或血浆中那西肽浓度低，检测限高，使得高效液相色谱分析在药物残留检测和药代动力学研究领域未取得明显进展。目前为止还没有LC-MS/MS(液相色谱-质谱联用)方法用于那西肽残留的检测报道。

发明内容

鉴于此，本发明的目的在于提供一种动物性食品中那西肽残留的检测方法。本发明提供的检测方法基于那西肽在碱性溶液中水解的原理结合液相色谱-串联质谱技术，使检测方法具有高选择性和高灵敏度的特点，能够高效检测出动物性食品中那西肽残留的含量。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

一种动物性食品中那西肽残留的检测方法，包含以下步骤：

将动物性食品的肌肉组织依次经碱溶液水解、除脂和调节pH值后，经固相萃取洗脱，得到洗脱液；

将所述洗脱液依次经吹干、溶解和过滤，得到滤液；

对所述滤液进行液相色谱-串联质谱分析检测4-羟甲基-3-甲基吲哚-2-甲酸的含量，根据所述那西肽标准对应的4-羟甲基-3-甲基吲哚-2-甲酸的含量计算得到所述动物性食品中那西肽残留的含量。

优选地，所述碱溶液包括氢氧化钠溶液和/或氢氧化钾溶液。

优选地，所述碱溶液的摩尔浓度为0.2～4.0mol/L。

优选地，所述动物性食品的肌肉组织包括鸡的肌肉组织、猪的肌肉组织或鱼的肌肉组织。

优选地，所述水解的温度为30～80℃。

优选地，所述水解的时间为0.5～2h。

优选地，所述固相萃取洗脱使用的萃取柱为MAX固相萃取柱。

优选地，所述液相色谱-串联质谱的参数包括：

反相色谱柱C18分离，以乙腈和水为流动相进行梯度洗脱，采用电喷雾离子源电离，负离子在m/z 100～200amu扫描，用三重四极杆质谱仪监测分析。

优选地，所述梯度洗脱的程序为：0～1min，流动相为乙腈和水按体积比5：95组成的混合液；1～10min，流动相为乙腈和水按体积比5：95～90：10组成的混合液；10～11min，流动相为乙腈和水按体积比90：10组成的混合液；11～11.5min，流动相为乙腈和水按体积比90：10～5：95组成的混合液；11.5～15min，流动相为乙腈和水按体积比5：95组成的混合液。

优选地，所述电喷雾离子源电离的条件包括：电喷雾电压为-4500V，离子源温度为600℃，滞留时间为100ms，雾化气压力为55psi，辅助气压力为55psi，气帘气压力为40psi。

本发明提供了一种动物性食品中那西肽残留的检测方法，包含以下步骤：将动物性食品的肌肉组织依次经碱溶液水解、除脂和调节pH值后，经固相萃取洗脱，得到洗脱液；将所述洗脱液依次经吹干、溶解和过滤，得到滤液；对所述滤液进行液相色谱-串联质谱分析检测4-羟甲基-3-甲基吲哚-2-甲酸的含量，根据所述那西肽标准对应的4-羟甲基-3-甲基吲哚-2-甲酸的含量得到所述动物性食品中那西肽残留的含量。本发明利用那西肽的溶解特性，在碱性条件下，那西肽发生水解反应生成特征小分子4-羟甲基-3-甲基吲哚-2-甲酸。本发明提供的检测方法是基于那西肽在碱性溶液中水解的原理，结合液相色谱-串联质谱技术检测4-羟甲基-3-甲基吲哚-2-甲酸，来测定动物组织中那西肽残留的含量。本发明提供的检测方法具有高选择性和高灵敏度的特点，能够高效检测出动物肌肉组织中那西肽残留的含量。实验结果表明，本发明提供的检测方法在2.0～500μg/kg浓度范围内线性良好，相关系数(r²)均大于0.99；检测限和定量限分别为1μg/kg和2μg/kg；在2μg/kg、10μg/kg和20μg/kg三个添加水平下，那西肽在动物性食品猪、鸡和鱼的动物肌肉中的批内回收率为84.7％～108.0％，批间回收率为86.3％～105.3％，批内和批间相对标准偏差分别在1.7％～10.6％和3.5％～7.2％之间。

且本发明提供的检测方法操作简单，作用条件温和，水解反应彻底，可以在动物性食品中那西肽残留的日常监督检测领域中获得广泛的应用，并为那西肽残留的检测研究提供新思路、新手段和技术支持。

附图说明

下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。

图1为氢氧化钠水解那西肽的反应示意图；

图2为那西肽水解产物质谱图；

图3为那西肽水解产物IR谱图；

图4为那西肽水解产物¹HNMR谱图；

图5为那西肽水解产物¹³C NMR谱图；

图6为那西肽水解产物¹³C DEPT-135谱图；

图7为在不同实验条件下水解动物肌肉组织产生的4-羟甲基-3-甲基吲哚-2-甲酸的MRM色谱图。

具体实施方式

本发明提供了一种动物性食品中那西肽残留的检测方法，包含以下步骤：

将所述洗脱液依次经吹干、溶解和过滤，得到滤液；

对所述滤液进行液相色谱-串联质谱检测4-羟甲基-3-甲基吲哚-2-甲酸的含量，根据所述那西肽标准对应的4-羟甲基-3-甲基吲哚-2-甲酸的含量得到所述动物性食品中那西肽残留的含量。

本发明将动物性食品的肌肉组织依次经碱溶液水解、除脂和调节pH值后，经固相萃取洗脱，得到洗脱液。在本发明中，所述碱溶液优选包括氢氧化钠溶液和/或氢氧化钾溶液；所述碱溶液的摩尔浓度优选为0.2～4.0mol/L，进一步优选为0.5～3mol/L，更优选为1～2mol/L。本发明对所述碱溶液的来源没有特殊的限定，采用本领域常规市售产品或常规方法制得均可。

在本发明中，所述水解的温度优选为30～80℃，进一步优选为40～70℃，更优选为50～60℃；所述水解的时间优选为0.5～2h，进一步优选为1～1.5h。在本发明中，所述水解优选在恒温水浴中进行。本发明对所述水解的具体操作没有特殊限定，采用本领域常规水解操作即可，具体的如振荡。

在本发明中，所述那西肽残留的水解产物包括4-羟甲基-3-甲基吲哚-2-甲酸。

在本发明中，所述动物性食品的肌肉组织优选包括鸡的肌肉组织、猪的肌肉组织或鱼的肌肉组织。在本发明中，所述动物性食品的肌肉组织优选取自混饲那西肽后于不同时间点宰杀的试验鸡、猪和鱼。

在本发明中，所述除脂优选在除脂溶剂中进行，所述除脂溶剂优选包括正己烷、石油醚、戊烷、庚烷或辛烷。在本发明中，所述碱溶液水解所得水解液与除脂溶剂的用量比优选为1：1。本发明对所述除脂溶剂的具体来源没有特殊的限定，采用本领域常规市售产品均可。本发明通过简单除脂，去除水解产物中的类脂肪物质。

所述除脂完成后，本发明优选将所述除脂后的水解产物依次进行涡旋和离心，得到下层清液后，再调节pH值。

在本发明中，所述涡旋的时间优选为0.5～5min。在本发明中，所述离心的温度优选为0～14℃；所述离心的转速优选为1000～16000转/min，进一步优选为5000～10000转/min；所述离心的时间优选为2～30min，进一步优选为10～20min。

得到下层清液后，本发明优选采用酸溶液对所述下层清液调节pH值。在本发明中，所述调节至的pH值优选为6.0～8.5。

在本发明中，所述酸溶液优选包括盐酸溶液、硫酸溶液、硝酸溶液或磷酸溶液；所述酸溶液的摩尔浓度优选为1～12mol/L。本发明对所述酸溶液的来源没有特殊的限定，采用本领域常规市售产品或常规方法制得均可。

在本发明中，所述固相萃取洗脱使用的萃取柱优选为MAX固相萃取柱，所述MAX固相萃取柱的参数优选为：柱体积为1～6mL，吸附剂填料重量为20～500mg，吸附剂填料的粒径为5～75μm。

在本发明中，所述固相萃取洗脱的顺序优选为：活化、淋洗、洗脱。所述活化优选采用体积比为1～6：1～6的甲醇、氨水依次进行活化；所述淋洗优选采用水进行淋洗；所述洗脱优选采用甲酸-甲醇溶液进行洗脱。在本发明中，所述氨水的体积百分含量优选为0.2～2％，所述甲酸-甲醇溶液中甲酸的体积百分含量优选为2～5％。本发明对所述氨水、甲醇和甲酸-甲醇溶液的来源没有特殊的限定，采用本领域常规市售产品或常规方法制得均可。

在本发明中，所述固相萃取洗脱的速度优选为1～2mL/min。

得到洗脱液后，本发明将所述洗脱液依次经吹干、溶解和过滤，得到滤液。本发明优选采用氮气将洗脱液吹干。

在本发明中，所述溶解优选在有机溶剂中进行，所述有机溶剂优选包括体积百分含量为10～100％甲醇水溶液、10～100％乙腈水溶液、体积百分含量为0％～0.2％氨水甲醇溶液或体积百分含量为0％～0.2％氨水乙腈溶液。本发明对所述甲醇溶液、乙腈溶液和氨水的具体来源没有特殊限定，采用本领域常规市售产品或常规方法制得均可。本发明对所述有机溶剂的用量没有特殊限定，能够满足将吹干后的洗脱液完全溶解即可。

溶解完成后，本发明优选将溶解后的溶液依次进行涡旋、超声和离心。本发明对所述涡旋、超声和离心的具体操作没有特殊限定，采用本领域常规操作即可。

在本发明中，所述过滤优选采用过滤膜，所述过滤膜优选为水系针头滤膜，所述过滤膜的直径优选为0.1～0.5μm。

得到滤液后，本发明对所述滤液进行液相色谱-串联质谱检测4-羟甲基-3-甲基吲哚-2-甲酸的含量，根据所述那西肽标准对应的4-羟甲基-3-甲基吲哚-2-甲酸的含量得到所述动物性食品中那西肽残留的含量。

在本发明中，所述液相色谱-串联质谱的参数优选包括：反相色谱柱C18分离，以乙腈和水为流动相进行梯度洗脱，采用电喷雾离子源电离，负离子在m/z 100～200amu扫描，用三重四极杆质谱仪监测分析。

在本发明中，所述反相色谱柱C18的柱温优选为10～50℃，进一步优选为30℃。

在本发明中，所述梯度洗脱的程序优选为：0～1min，流动相为乙腈和水按体积比5：95组成的混合液；1～10min，流动相为乙腈和水按体积比5：95～90：10组成的混合液；10～11min，流动相为乙腈和水按体积比90：10组成的混合液；11～11.5min，流动相为乙腈和水按体积比90：10～5：95组成的混合液；11.5～15min，流动相为乙腈和水按体积比5：95组成的混合液。在本发明中，所述梯度洗脱的流速优选为0.1～0.5mL/min，进一步优选为0.25mL/min。

在本发明中，所述电喷雾离子源电离的条件优选包括：电喷雾电压为-4500V，离子源温度为600℃，滞留时间为100ms，雾化气压力为55psi，辅助气压力为55psi，气帘气压力为40psi。

在本发明中，所述4-羟甲基-3-甲基吲哚-2-甲酸在电喷雾电离模式下，其具有良好的质谱行为，从而实现灵敏、快速、可靠、定性定量的检测出4-羟甲基-3-甲基吲哚-2-甲酸的含量。本发明根据所述4-羟甲基-3-甲基吲哚-2-甲酸含量间接测定那西肽含量。

本发明优选将系列不同浓度那西肽标准品水解生成系列不同浓度的4-羟甲基-3-甲基吲哚-2-甲酸，根据不同浓度的那西肽以及对应的色谱峰面积绘制那西肽标准曲线，同时将动物性食品中那西肽残留水解产生的相应4-羟甲基-3-甲基吲哚-2-甲酸的峰面积代入建立的那西肽标准曲线方程计算出那西肽的残留量，或从那西肽标准曲线图上直接读得。

在本发明中，所述标准曲线横坐标x优选为那西肽浓度，纵坐标y优选为相应的色谱峰面积。

在本发明中，所述标准曲线的线性范围优选为2～500μg/L；所述标准曲线的检测限优选为0.7μg/kg；所述标准曲线的定量限优选为2μg/kg。当被检测的动物性食品为鸡的肌肉组织时，所述标准曲线的线性方程优选为y＝6.09×10⁴x+1.3×10⁴，相关系数优选为0.9961；当被检测的动物性食品为鸡的肌肉组织时，所述标准曲线的线性方程优选为y＝6.53×10⁴x-8.62×10⁴，相关系数优选为0.9963；当被检测的动物性食品为鸡的肌肉组织时，所述标准曲线的线性方程优选为y＝8.92×10⁴x+7.95×10⁴，相关系数优选为0.9968。

下面结合实施例对本发明提供的动物性食品中那西肽残留的方检测法进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

氢氧化钠水解那西肽的反应示意图参见图1，1M氢氧化钠在50℃条件下水解那西肽得到4-羟甲基-3-甲基吲哚-2-甲酸。

在本发明实施例1中所用仪器参见表1。

表1实施例1中所用仪器名称及型号

在本发明实施例1中所用原料参见表2。

表2实施例1中所用原料名称及来源

原料名称	公司
		氢氧化钠	上海强顺化学试剂有限公司
色谱纯甲醇	美国Fisher公司
		色谱纯乙醇	美国Fisher公司
色谱纯乙腈	美国Fisher公司
		色谱纯甲酸	德国Sigma-Aldrich公司
分析纯甲醇	广州化学试剂厂
		分析纯正己烷	广州化学试剂厂
分析纯乙酸乙酯	广州化学试剂厂
		那西肽标准品(纯度≥88.6％)	中国兽医药品监察所
那西肽原料药(纯度≥92％)	广州市凯阁生物科技有限责任公司
		健康鸡(1.0～1.5kg)	广东智威农业科技股份有限公司

实施例1

那西肽水解产物4-羟甲基-3-甲基吲哚-2-甲酸的制备

称取5g那西肽原料药于250mL单口平底烧瓶中，加入200mL水，在磁力搅拌下，混合均匀后，缓慢加入4mol/L氢氧化钠溶液50mL，在室温条件下搅拌反应2h。将反应溶液转移至50mL离心管，在4℃、9000转/min条件下，离心搅拌10min后，将上清液转移至250mL四氟乙烯具塞分液漏斗中，分别用50mL正己烷和乙酸乙酯萃取洗涤3次；静置分层，下层转移至250mL烧杯中，6mol/L盐酸调节pH值至3～4，用50mL乙酸乙酯萃取3次，合并乙酸乙酯，在40℃下旋至近干，倒入2mL乙醇复溶，在4℃、9000转/min条件下，离心搅拌5min后，取下层沉淀置于真空干燥箱，在60℃真空条件下，干燥24h，得粗产品。将所得粗产品用色谱纯乙醇溶解，通过制备液相色谱仪进行分离提纯，将所收集的馏分采用真空冷冻干燥，收集冻干产物，为那西肽水解产物的成品，进一步结构鉴定。

4-羟甲基-3-甲基吲哚-2-甲酸的结构表征

将上述制备得到的那西肽水解产物分别通过质谱(MS)、红外光谱(IR)和核磁共振(NMR)进行结构表征，确定水解产物为4-羟甲基-3-甲基吲哚-2-甲酸。

采用高分辨质谱(负离子模式)测定该那西肽水解产物，产物中[M-H]^-离子质量数为204.0660，折算其分子量M为205.0738，按分子式C₁₁H₁₁NO₃提取的精确质量数为205.0733，实验值与推测的4-羟甲基-3-甲基吲哚-2-甲酸理论值质量数差小于2.5ppm。串联四极杆质谱测定4-羟甲基-3-甲基吲哚-2-甲酸的二级质谱图参见图2，从图2中可以看出，4-羟甲基-3-甲基吲哚-2-甲酸分子主要断裂为160(脱CO₂)和142(脱CO₂和H₂O)两个碎片离子。

图3为那西肽水解产物IR谱图，从图3中可以看出，3466～2900cm^-1多峰为-OH，-NH及C-H等的伸缩振动峰，1722cm^-1、1632cm^-1、1266cm^-1和1476cm^-1等强峰为羰基及苯环骨架伸缩振动峰，具有4-羟甲基-3-甲基吲哚-2-甲酸的特征官能团峰。

图4为那西肽水解产物¹H NMR谱图，从图4中可以看出，化学位移δ2.85ppm为-CH₃(3H)，δ4.89ppm和δ5.02ppm为-CH₂-(2H，裂分)，δ7.05～7.35ppm为吲哚苯环3取代后3个H的耦合裂分为2，3和2重峰。

图5为那西肽水解产物¹³C NMR谱图，图6为那西肽水解产物¹³C DEPT-135谱图。结合图5～6可以看出，化学位移δ10.33ppm为-CH₃伯碳峰，δ46.73～47.58ppm为-CH₂OH仲碳峰(¹³C DEPT-135谱为负峰)，δ111.17ppm、δ118.97ppm和δ123.79ppm为吲哚苯环上3个CH(7，8和6位)峰；季碳(9，4，2和3位)在¹³C DEPT-135谱图无峰。由此可以看出，NMR解析符合4-羟甲基-3-甲基吲哚-2-甲酸结构。

标准溶液的配制

标准储备液(1mg/mL)的配制

根据含量准确计算并称量那西肽标准品11.3mg，置于10mL棕色容量瓶中，用N,N-二甲基甲酰胺配制成1mg/mL的标准储备液，在-20℃条件下避光保存，有效期6个月。

标准工作液(10μg/mL)的配制

将上述标准储备液稀释后，准确移取1mL于10mL棕色容量瓶中用色谱乙腈稀释定容，配制成10μg/mL的标准工作液，在-20℃条件下避光保存，有效期1个月。根据需要用色谱乙腈逐级稀释配成适当浓度的标准工作液，现配现用。

溶液的配制

1mol/L氢氧化钠溶液的配制

准确称取4g氢氧化钠固体溶于100mL超纯水中，摇匀，现配现用。

6mol/L盐酸溶液的配制

取50mL36％～38％的浓盐酸缓慢加到50mL超纯水中，反复摇匀后备用。

样品前处理

分别准确称取2g均质的动物性食品的鸡、猪和鱼肌肉组织，加入4mL，1mol/L氢氧化钠溶液，涡旋1min后置于恒温水浴震荡器，在50℃条件下震荡水解1h。取出后冷却至室温，在4℃，9000转/min的条件下，离心搅拌5min，收集上清液；加入5mL正己烷，涡旋震荡10min，在4℃，9000转/min的条件下，离心搅拌10min，转移下层溶液；加入6mol/L盐酸调节pH值至7.5±0.5，待净化；将上清液全部转移至预先用3mL甲醇，3mL 0.2％氨水溶液活化的MAX固相萃取柱，将流速控制在1～2mL/min，依次用3mL 0.2％氨水溶液和10％甲醇水溶液淋洗小柱，真空抽干后用1mL 2％甲酸甲醇溶液洗脱，收集洗脱液，于40℃下氮气吹至近干，2mL 50％甲醇水溶液复溶，充分涡旋，超声10min，经0.22μm滤膜过滤，滤液供液相色谱-串联质谱仪检测。

色谱条件为采用反相色谱柱Phenomenex Luna C18(150mm×2mmi.d.，5μm)，柱温30℃，流速为0.25mL/min，流动相A为乙腈，流动相B为水。梯度洗脱的程序为0～1min，流动相为乙腈和水按体积比5：95组成的混合液；1～10min，流动相为乙腈和水按体积比5：95～90：10组成的混合液；10～11min，流动相为乙腈和水按体积比90：10组成的混合液；11～11.5min，流动相为乙腈和水按体积比90：10～5：95组成的混合液；11.5～15min，流动相为乙腈和水按体积比5：95组成的混合液。

质谱条件为离子源：电喷雾电离离子源；扫描方式：负离子扫描；检测方式：多反应监测模式；电喷雾电压：-4500V；离子源温度：600℃；气帘气压力：40psi；雾化气压力：55psi；辅助气压力：55psi。4-羟甲基-3-甲基吲哚-2-甲酸的质谱参数见表3。

表34-羟甲基-3-甲基吲哚-2-甲酸的质谱参数

其中，*定量离子为m/z 203.9/160.1。

样品前处理条件的选择和优化

提取

采用摩尔浓度为0.5mol/L、1.0mol/L、1.5mol/L和2.0mol/L的氢氧化钠溶液对那西肽进行水解。结果表明，使用0.5mol/L氢氧化钠溶液水解时，组织分解不完全，那西肽的水解率低于60％。当使用1.0mol/L氢氧化钠溶液水解时，组织分解完全(样品完全变成溶液)，那西肽的水解率较高。继续增加氢氧化钠溶液的浓度，水解率没有明显增加，反而由于碱溶液浓度过高需要更多的盐酸调节pH值，从而形成较多的氯化钠盐溶液，造成过柱时流速缓慢。

在30、40、50和60℃水解温度条件下对那西肽进行水解。结果表明，当水解温度为50℃时，组织水解彻底，水解率较高。继续加大水解温度，那西肽的水解率并无明显变化。

在30、45、60和75min水解时间条件下对那西肽进行水解。结果表明，随着水解时间的增加，那西肽的水解率逐渐增加。当水解时间为60min和75min时，组织水解完全，那西肽均获得满意的水解率(高于90％)且结果相差不大。

净化

采用HLB、C18、MAX和MCX四种常用固相萃取柱用于样品的净化处理。结果表明，HLB、C18和MAX小柱均对4-羟甲基-3-甲基吲哚-2-甲酸有保留，其中，MAX小柱的回收率最高。

采用超纯水、5％、10％、15％及20％甲醇水对样品进行净化处理和回收。结果表明，当使用10％甲醇水溶液淋洗时，样品回收率较高，净化效果较好。继续增大甲醇的比例，净化效果逐渐增强，但同时会将部分目标物淋洗下来，造成回收率偏低。

采用体积百分含量为0.5％、1％、2％及5％甲酸甲醇溶液对4-羟甲基-3-甲基吲哚-2-甲酸进行洗脱。结果表明，当甲酸的浓度增加到2％时，4-羟甲基-3-甲基吲哚-2-甲酸的回收率达到90％以上，继续增加甲酸浓度，回收率没有显著差异。

对MAX固相萃取柱进行分段洗脱。结果表明，当采用1mL 2％甲酸甲醇溶液进行洗脱时，目标分析物能够完全被洗脱下来，继续增加洗脱体积，不仅将更多的杂质洗脱下来，而且延长了吹干时间。

标准曲线、检测限和定量限

准确称取2g均质的空白肌肉组织，加入适量的不同浓度的那西肽标准工作液，涡旋混匀，静置20min。按照上述样品制备方法处理样品，制得浓度分别为2μg/L、5μg/L、10μg/L、20μg/L、50μg/L、100μg/L、200μg/L及500μg/L共8个基质标准溶液，上机检测。将那西肽浓度设为横坐标x，相应的色谱峰面积设为纵坐标y，二者进行线性回归分析，得到回归方程和相关系数(r²)。

向空白动物肌肉组织样品中添加适量的那西肽标准工作液，制得一系列低浓度的加标样品，按照上述样品制备方法处理样品，分别以信噪比(S/N)大于等于3和10时对应的添加浓度作为方法的检测限和定量限。结果如表4所示，从表4中可以看出，在2～500μg/L的浓度范围内，那西肽的浓度与其峰面积之间具有良好的线性关系，相关系数(r²)均大于0.99，那西肽在动物肌肉中的检测限和定量限分别为0.7μg/kg和2μg/kg，远远低于日本肯定列表制度中规定的那西肽在动物组织中的最大残留限量30μg/kg，表明该方法的灵敏度较高，能够满足动物肌肉组织中那西肽残留的检测要求。

表4那西肽线性范围、检测限、定量限、线性方程及相关系数(n＝5)

回收率与精密度

准确称取2g均质的空白动物肌肉，加入适量的不同浓度的那西肽标准工作液，涡旋混匀，静置20min。制得浓度分别为2.0μg/kg、10μg/kg和20μg/kg三个添加水平的加标样品，按照上述样品制备方法处理样品，利用标准曲线和线性方程，计算各浓度添加水平的回收率和精密度如表5所示，从表5中可以看出，在2.0μg/kg、10μg/kg和20μg/kg三个添加水平下，那西肽在三种动物肌肉组织中的批内回收率为84.7％～108.0％，批间回收率为86.3％～105.3％。批内和批间相对标准偏差分别在1.7％～10.6％和3.5％～7.2％之间，表明该方法具有较高的回收率和精密度，满足动物组织中兽药残留检测的要求。

表5动物肌肉中那西肽的回收率和精密度(n＝5)

阳性样品检测

从广东智威农业科技股份有限公司购买4只健康鸡，令其自由采食和饮水，适应性饲养一周。随机选取1只作为空白组，另外3只作为给药组，空白组正常喂养，给药组每隔24小时以10mg·kg^-1bw的剂量给药一次，连续给药3天，将三只鸡分别编为1号鸡、2号鸡和3号鸡，在末次给药后分别经过12小时、24小时和36小时进行宰杀，分取鸡肉，按照实施例3中样品制备方法处理样品，每个样品做5个平行，测得1号鸡、2号鸡和3号鸡试样肌肉组织中那西肽残留量分别为7.0μg/kg、10.7μg/kg和8.7μg/kg，相对标准偏差均低于20％，满足残留分析的相关规定要求。

图7为在不同实验条件下水解动物肌肉组织产生的4-羟甲基-3-甲基吲哚-2-甲酸的MRM色谱图，其中，A1为空白猪肉；A2为空白鸡肉；A3为空白鱼肉；A4为空白猪肉添加20μg/kg那西肽标准溶液；A5为空白鸡肉添加20μg/kg那西肽标准溶液；A6为空白鱼肉添加20μg/kg那西肽标准溶液；A7为1号阳性鸡肉；A8为2号阳性鸡肉；A9为3号阳性鸡肉)。从图7中可以看出，各质量色谱图中8.2min处为4-羟甲基-3-甲基吲哚-2-甲酸的保留时间，用于那西肽的定性；阳性鸡肉中4-羟甲基-3-甲基吲哚-2-甲酸的色谱峰面积与一定浓度的那西肽标准溶液水解产生的4-羟甲基-3-甲基吲哚-2-甲酸色谱峰面积之比，乘以标准那西肽浓度即获得阳性鸡肉组织中那西肽的含量。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种动物性食品中那西肽残留的检测方法，其特征在于，包含以下步骤：

将所述洗脱液依次经吹干、溶解和过滤，得到滤液；

2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述碱溶液包括氢氧化钠溶液和/或氢氧化钾溶液。

3.根据权利要求1或2所述的检测方法，其特征在于，所述碱溶液的摩尔浓度为0.2～4.0mol/L。

4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述动物性食品的肌肉组织包括鸡的肌肉组织、猪的肌肉组织或鱼的肌肉组织。

5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述水解的温度为30～80℃。

6.根据权利要求1或5所述的检测方法，其特征在于，所述水解的时间为0.5～2h。

7.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述固相萃取洗脱使用的萃取柱为MAX固相萃取柱。

8.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述液相色谱-串联质谱的参数包括：

9.根据权利要求8所述的检测方法，其特征在于，所述梯度洗脱的程序为：0～1min，流动相为乙腈和水按体积比5：95组成的混合液；1～10min，流动相为乙腈和水按体积比5：95～90：10组成的混合液；10～11min，流动相为乙腈和水按体积比90：10组成的混合液；11～11.5min，流动相为乙腈和水按体积比90：10～5：95组成的混合液；11.5～15min，流动相为乙腈和水按体积比5：95组成的混合液。

10.根据权利要求8所述的检测方法，其特征在于，所述电喷雾离子源电离的条件包括：电喷雾电压为-4500V，离子源温度为600℃，滞留时间为100ms，雾化气压力为55psi，辅助气压力为55psi，气帘气压力为40psi。