CN109575914B - 一种检测n-乙酰转移酶2荧光探针的应用 - Google Patents
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Abstract
一种检测N‑乙酰转移酶2荧光探针的应用，其属于生物医药技术领域。它可用于测定不同来源生物体系中N‑乙酰转移酶2的酶活性。以ARHB作为特异性探针反应底物，借助N‑乙酰转移酶2体外反应体系，通过定量检测单位时间内N‑乙酰化代谢产物的生成量来测定各生物样品中N‑乙酰转移酶2的活性。本发明可用于不同个体来源人和动物组织样本、不同种属细胞及细胞制备物、以及各种植物和微生物中N‑乙酰转移酶2活性的定性、定量测定，并可实现对N‑乙酰转移酶2处置药物能力的评估，以及N‑乙酰转移酶2抑制剂的开发、筛选。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种检测N-乙酰转移酶2荧光探针的应用。
背景技术
芳香胺N-乙酰化转移酶为Ⅱ相药物代谢酶，主要的生理功能为能够将乙酰辅酶A上的乙酰基转移到芳香胺类、肼、芳香羟胺和芳香肼等物质的N原子或O原子上，在人体内对芳香胺类致癌物质的活化或灭活以及某些药物的代谢过程中起着重要的作用。这主要是因为乙酰化作用是该类物质代谢转化的重要步骤之一，由NATs催化完成。发生在氮原子上的乙酰化作用所产生的胺类衍生物通常是无毒性的，而发生在氧原子上的乙酰化作用所产生的乙酰氧基芳胺类或杂环胺类衍生物含有高反应活性的氮离子，极易与DNA结合形成加合物，引起DNA突变，从而导致细胞癌变。
人类NAT具有两种亚型 NAT1 NAT2，两者有相互独立的基因编码。虽然两者在结构上有一定相似性，但在组织分布和生物学作用方面相差较大。 NAT1 表达于人体大多数组织，催化对氨基水杨酸和对氨基苯甲酸等物质的乙酰化代谢。NAT2又称芳香胺N乙酰化转移酶，主要催化芳香胺进行乙酰化转移反应;NAT2 表达于肝脏和肠道，在体内参与20多种肼类化合物及致癌性芳香胺和杂环胺 类化合物的生物激活或灭活代谢。NAT1、NAT2均具有遗传多态性，但因 NAT2的显著多态性在药 物代谢及环境致癌物激活和失活过程中表现出更为 重要的意义，因此，近年来NAT2在药物代谢方面的作用正受到越来越多的重视。早在几十年前，人们就发现机体中NAT2功能的变异与异烟肼乙酰化作用的多样性是相关的。NAT2活性在人群中呈多态分布，根据乙酰化表型的不同可将人群划分为三类:慢型乙酰化代谢者、快型乙酰化代谢者和中间型乙酰化代谢者。NAT2)在肝脏中参与包括异烟肼 、利福平在内的一线抗结核药物的代谢。异烟肼通过NAT2的乙酰化作用生成乙酰异烟肼，后者水解为异烟酸和 乙酰肼，乙酰肼一部分进一步水解为肼，一部分在NAT2酶的作用下生成无毒物质排出体外，肼及乙酰肼已被认定是肝毒性物质，可以导致药物性肝损害的发生。利福平具有诱导肝脏多种代谢酶的作用，利福平不仅在肝中去乙酰化为异烟肼乙酰化提供乙酰基，且可诱导肝药酶活性，加速乙酰异烟肼代谢为乙酰肼，从而增加异烟肼的肝毒性。
因此，开发具有高灵敏度、抗环境干扰能力强的适用于检测N-乙酰转移酶2的特异性荧光探针底物，并建立高灵敏度的科学检测方法，在临床诊断、药物开发与合理使用方面，具有重要的应用价值。
发明内容
本发明提供一种检测N-乙酰转移酶2荧光探针的应用，该特异性荧光探针底物可被N-乙酰转移酶2选择性的水解，生成荧光属性明显改变的水解产物，可被荧光检测器检测。利用该探针反应可对多种生物体系中N-乙酰转移酶2的分布和功能进行定量评价，并可用于N-乙酰转移酶2抑制剂的筛选。
本发明公开的N-乙酰转移酶2的特异性荧光探针底物，为该探针底物为9-(4-氨基苯基)-3,6-双(二乙氨基)占吨翁醋酸盐（ARHB）。
本发明还公开了上述化合物作为N-乙酰转移酶2的特异性荧光探针底物的应用：采用上述ARHB作为N-乙酰转移酶2的特异性底物，进行结合反应，通过检测单位时间内代谢产物的生成量（代谢产物荧光强度）来定量测定不同生物体系（包括重组表达N-乙酰转移酶2、人或动物组织制备液、各类组织细胞、微生物及植物等生物体系）中N-乙酰转移酶2的活性；具体反应条件如下：
——体系中以ARHB作为特异性探针底物；底物浓度选择10 μM。
——在磷酸盐缓冲液中，反应温度为20 oC至60 oC之间，优选37 oC为最优反应时间；孵育体系pH介于5.5 ~ 10.5之间，优选pH 7.4为最优反应pH值；
——反应时间为0 ~ 60分钟，确保以上底物相应的水解产物达到定量限且底物转化率不超过20%时终止反应；
——测定单位时间内底物减少量或产物生成量（产物荧光强度）作为N-乙酰转移酶2活性的评价指标。
本发明提供的N-乙酰转移酶2的特异性荧光探针底物的应用，该探针底物及其代谢产物具有不同的光学属性，可采用荧光检测器实现产物的快速、灵敏检测；代谢产物荧光检测条件分别为：激发波长530 nm，最大发射波长为580 nm。
该特异性探针水解产物为较长发射波长荧光探针，其在N-乙酰转移酶2活性检测过程不易受生物体系基质及杂质的干扰，可用于各种重组N-乙酰转移酶2、人及动物组织制备液、尿及各类组织细胞中N-乙酰转移酶2活性的定量测定；同时也可作为载体及动物整体N-乙酰转移酶2的探针底物，评估N-乙酰转移酶2的个体及种属差异。该探针底物及水解代谢产物的荧光检测方法还可用于N-乙酰转移酶2抑制剂的快速筛选及抑制能力的定量评价。
作为高特异性的N-乙酰转移酶2的荧光探针底物，该化合物可以用来检测N-乙酰转移酶2的活性，尤其适合用于对细菌、昆虫细胞、哺乳动物细胞以及酵母菌克隆表达体系产生的N-乙酰转移酶2活性测定，以及多种哺乳动物组织器官来源的微粒体、S-9等生物样品中N-乙酰转移酶2的活性标定。
选用本发明所述N-乙酰转移酶2的特异性探针底物检测N-乙酰转移酶2体外活性具有以下突出优势：
(1) 高特异性：ARHB可被N-乙酰转移酶2高特异性代谢成具有较强荧光量子差率的产物。
(2) 廉价易得：ARHB可经化学合成获得，合成工艺简单易行，荧光方法检测成本低。
(3) 高灵敏度：ARHB具有较长的荧光发射波长，可以较好的减弱生物背景荧光的干扰。
附图说明
图1 ARHB及其酶解产物的紫外吸收及荧光发射光谱。
图2不同水解酶对ARHB的筛选实验结果。
图3不同离子及氨基酸对ARHB的筛选实验结果。
图4 N-乙酰转移酶2催化ARHB探针反应的酶线性变化。
图5 应用ARHB对不同来源的微生物进行监测其N-乙酰转移酶2的表达。
图6 应用ARHB筛选天然产物中高效的N-乙酰转移酶2的抑制剂。
具体实施方式
实施例1. 体外测定不同代谢酶的选择性
（1）预先准备90 µL 体外代谢反应体系，包括pH 7.4的磷酸盐缓冲液（50 mM）、不同种类代谢酶 (0.1 mg/mL)，1 µL浓度为1 mM（终浓度10 μM）的ARHB于37 oC条件下震荡预孵3分钟；
（2）向反应体系中加入10 µL浓度为20 mM的乙酰辅酶A起始反应
（3）30分钟后，加入50 µL冰乙腈，剧烈震荡后，终止反应；
（4）用高速冷冻离心机在4 oC、20,000 × g的条件下，高速离心20分钟后，取上清液，进行荧光检测（ARHB：Ex=530 nm，Em=580 nm）。结果显示，只有N-乙酰转移酶2（NAT2）催化反应，反应速率远远高于其它水解酶，说明N-乙酰转移酶2催化ARHB的反应有很好的选择性，本发明可应用于N-乙酰转移酶2的活性测定（图2）。
实施例2. 体外测定不同氨基酸对ARHB选择性的影响
（1）预先准备90 µL 体外代谢反应体系，包括pH 7.4的磷酸盐缓冲液（50 mM）、N-乙酰转移酶2、1 µL浓度为1 mM（终浓度10 μM）的ARHB、不同种类的金属离子和氨基酸 (终浓度10 μM)，于37 oC条件下震荡预孵3分钟；
（2）向反应体系中加入10 µL浓度为20 mM的乙酰辅酶A起始反应；
（3）30分钟后，加入50 µL冰乙腈，剧烈震荡后，终止反应；
（4）用高速冷冻离心机在4 oC、20,000 × g的条件下，高速离心20分钟后，取上清液，进行荧光检测（ARHB：Ex=530 nm，Em=580 nm）。结果显示，只有N-乙酰转移酶2（NAG）催化反应，其他金属离子及氨基酸对探针反应的荧光强度没有影响，说明N-乙酰转移酶2催化ARHB的反应有很好的选择性，本发明可应用于N-乙酰转移酶2的活性测定（图3）。
实施例3. N-乙酰转移酶2催化ARHB探针反应的线性研究
（1）预先准备90 µL 体外代谢反应体系，包括pH 6.0的磷酸盐缓冲液（50 mM）、N-乙酰转移酶2 （0-20 μg/mL），1 µL浓度为1 mM（终浓度10 μM）的ARHB，于37 oC条件下震荡预孵3分钟；
（2）向反应体系中加入10 µL浓度为20 mM的乙酰辅酶A起始反应；
（3）30分钟后，加入50 µL冰乙腈，剧烈震荡后，终止反应；
（4）用高速冷冻离心机在4 oC、20,000 × g的条件下，高速离心20分钟后，取上清液，进行荧光检测（ARHB：Ex=530 nm，Em=580 nm）。结果显示， N-乙酰转移酶2（NAT2）催化ARHB的探针反应在0 - 20 μg/mL范围内呈现良好的酶线性关系，r2值为0.9889，说明本发明中ARHB可应用于复杂样本中N-乙酰转移酶2的活性及其表达量的测定（图4）。
实施例4. N-乙酰转移酶2在不同微生物菌中的成像
（1）预先准备不同微生物菌株包括：金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、耻垢分枝杆菌、乳杆菌，然后应用LB液体培养基对其进行单独培养；12h后取一定量的菌液1000 r离心，获得菌体，利用200µL 的PBS对菌体进行重悬；最后在重悬菌液中加入ARHB 使其终浓度为20μM ，然后在无菌环境中37 oC条件下震荡1h；
（2）1h震荡后，离心去除PBS，用空白PBS洗菌体3遍，最后PBS重悬菌体，然后在莱卡共聚焦下，利用488 激光器激发，采集波段设置为550-610 nm对其中的N-乙酰转移酶2进行荧光成像。
（3）第一步培养菌的菌液在LB的固体培养皿中涂菌，然后在无菌环境培养24h,形成单独菌落，然后在菌落上滴加PBS溶的ARHB，然后37度反应1h后，在小动物成像仪中进行菌板成像，激发波长530，发射550-600 nm（图5）。
实施例5. 利用ARHB从天然产物中进行高通量筛选N-乙酰转移酶2的强效抑制剂
（1）预先准备90 µL 体外代谢反应体系，包括pH 6.0的磷酸盐缓冲液（50 mM）、N-乙酰转移酶2 （10 μg/mL），1 µL浓度为1 mM（终浓度10 μM）的ARHB，分别加入多种不同的天然小分子化合物使其终浓度为10μM，于37 oC条件下震荡预孵3分钟；
（2）向反应体系中加入10 µL浓度为10 mM的乙酰辅酶A起始反应；
（3）30分钟后，加入50 µL冰乙腈，剧烈震荡后，终止反应；
（4）用高速冷冻离心机在4 oC、20,000 × g的条件下，高速离心20分钟取上清液，进行荧光检测（ARHB：Ex=530 nm，Em=580 nm）,结果显示KSB-4对NAT2具有高效的抑制活性，同时阳性抑制剂槲皮素也表现出很好的抑制活力，证明我们开发的抑制剂筛选方法可靠准确，并筛选出了NAT2的高效抑制剂作为下一步抗菌药物的先到化合物进行进一步开发（图6）。
Claims (7)
1.一种检测N-乙酰转移酶2荧光探针非疾病诊断和治疗方法的应用，其特征在于：该探针底物可被N-乙酰转移酶2特异性催化，使探针底物中的氨基被乙酰化，探针结构式如式（1）所示，
该探针底物为9-(4-氨基苯基)-3,6-双(二乙氨基)占吨翁醋酸盐；
该探针底物的应用为：采用9-(4-氨基苯基)-3,6-双(二乙氨基)占吨翁醋酸盐作为N-乙酰转移酶2的特异性底物，进行结合反应，通过定量检测单位时间内的代谢产物的生成率来定量测定不同生物体系中N-乙酰转移酶2的活性。
2.根据权利要求1所述的一种检测N-乙酰转移酶2荧光探针非疾病诊断和治疗方法的应用，其特征在于：体外孵育反应条件为：底物浓度介于1/10~10 K m之间；孵育体系pH介于5.5 ~ 10.5之间；反应温度介于20 ~ 60 oC之间。
3.根据权利要求1所述的一种检测N-乙酰转移酶2荧光探针非疾病诊断和治疗方法的应用，其特征在于：所述生物体系为重组表达N-乙酰转移酶2、细胞样品、人或动物组织、植物、微生物。
4.根据权利要求2所述的一种检测N-乙酰转移酶2荧光探针非疾病诊断和治疗方法的应用，其特征在于：所述底物消除率或产物的生成率低于20%。
5.根据权利要求2所述的一种检测N-乙酰转移酶2荧光探针非疾病诊断和治疗方法的应用，其特征在于：该探针底物的酶代谢产物具有荧光，检测条件为激发波长530 nm，最大发射波长为580 nm。
6.根据权利要求2所述的一种检测N-乙酰转移酶2荧光探针非疾病诊断和治疗方法的应用，其特征在于：该探针底物还可用于N-乙酰转移酶2抑制剂的快速筛选及抑制能力的定量评价。
7.根据权利要求2所述的一种检测N-乙酰转移酶2荧光探针非疾病诊断和治疗方法的应用，其特征在于：该探针底物也可作为载体及动物整体N-乙酰转移酶2的探针底物，评估N-乙酰转移酶2的个体及种属差异。
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