CN109568670A - 一种子宫内膜损伤修复的水凝胶及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种子宫内膜损伤修复的水凝胶，水凝胶是由氨基化芦荟多糖‑甘油醛凝胶、包载肝素高亲和性细胞因子的肝素‑泊洛沙姆凝胶、子宫内膜去细胞基质组成，通过改变组分配比，控制子宫内膜损伤修复水凝胶的力学强度和降解速度。该子宫内膜损伤修复的水凝胶免疫源性低且具备子宫内膜快速修复的多重优点，为内膜修复提供最佳的理化和生物学微环境，有效引导细胞定向排列，具有良好的力学性能，实现子宫内膜损伤的快速修复。

Description

一种子宫内膜损伤修复的水凝胶及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种子宫内膜损伤修复的水凝胶，特别涉及一种子宫内膜损伤修复的水凝胶的组成、制备及其用途。

背景技术

子宫是产生月经、孕育胎儿的场所，正常的子宫内膜能进行自身修复与再生，在女性生理和生殖功能中起着举足轻重的作用。但是内分泌严重失调、子宫内感染和宫腔手术等情况会导致子宫内膜损伤，从而破坏子宫内膜正常结构。一旦子宫内膜基底层受到损伤，会导致上皮、间质细胞再生障碍，新生血管形成受损，内膜自我修复功能受到严重影响。当宫腔缺乏内膜覆盖时，其前后壁可发生纤维化、瘢痕化及黏连，导致诸多妇科疾病的发生。因此，子宫内膜损伤是妇科疾病中最常见的病理过程，已成为导致子宫内膜黏连(IUA)和不孕的主要因素。目前子宫内膜损伤的治疗方法包括手术切除，联合雌二醇激素药物和宫内节育器进行全面治疗。虽然这些常规治疗手段在术后取得了有效的治疗结果，但其复发率高达62.5％，存在着预后不良，如子宫内膜基底膜严重损伤，严重IUA和子宫腔硬化等后遗症状。角质细胞生长因子(KGF)具有促进上皮细胞增生、分化、伤口愈合以及细胞保护等功能，局部应用可望促进子宫内膜的修复和再生。但由于缺乏有效的应用剂型，直接应用细胞生长因子促进子宫内膜修复的在体研究目前还鲜有报道。

目前，已有阴道栓剂、灌洗剂、口服片剂作为子宫内膜修复制剂已有报道，但其疗效不佳，主要原因在于现有这些制剂无法保证治疗药物与内膜损伤部位紧密接触并维持长时间有效浓度。此外，由于子宫内膜黏液的快速分泌更新，导致受损子宫的腔道内治疗药物快速流失，从而无法达到有效的药物治疗浓度，这些因素成为阻碍目前制剂在子宫内膜损伤修复应用的瓶颈。

从临床应用角度出发，理想的子宫内膜损伤修复制剂首先应同时满足以下条件：①生物相容性好，所用材料应安全无毒无刺激，且生物可降解；②pH值、力学强度和弹性等理化参数适宜，不引起子宫内膜的二次损伤；③提供良好的局部营养环境，材料降解和治疗药物的释放速度控制在6天左右，以不影响生理和月经周期；④具有很好的子宫内膜亲和性，不受子宫内膜黏液快速分泌的影响。目前尚缺乏一种能够同时满足以上要求的子宫内膜损伤修复制剂。

发明内容

本发明的目的在于克服“现有制剂不能同时满足子宫内膜损伤修复所有要求”的瓶颈，提供一种免疫源性低且具备子宫内膜快速修复的多重优点，为内膜修复提供最佳的理化和生物学微环境，有效引导细胞定向排列，具有良好的力学性能，实现子宫内膜损伤的快速修复。

申请人发现，水凝胶是一类具有力学强度、弹性模量的半固体制剂，温敏型HP水凝胶联合原位给药注射技术为子宫内局部应用提供良好的基础。但已有报道的水凝胶制剂在子宫内膜亲和性、治疗药物的释放速度符合生理和月经周期等方面存在明显不足，不能满足子宫内膜损伤修复的特殊需要。为了解决现有制剂的这些问题，申请人经过大量研究发现，芦荟中具有多种成分，其中芦荟多糖具有很好的子宫内膜修复作用。申请人通过氨基化修饰，制备氨基化芦荟多糖，可以与甘油醛交联形成力学性质良好的凝胶，不仅没有已报道的醛基交联剂的毒性，还具有很好的生物相容性和可调控的降解速度，充分发挥芦荟多糖的子宫内膜损伤部位的组织修复、微血管再生、促进内膜上皮细胞迁移、改善局部营养环境等作用。此外，申请人发现肝素修饰的泊洛沙姆凝胶具有多重特点，包括：肝素的抗疤痕和抗纤维化的作用；保证肝素高亲和性细胞因子的控制释放和长效作用；保持泊洛沙姆的温敏型水凝胶性质，在体温时形成弹性好的固体凝胶，从而保证肝素高亲和性细胞因子不流失等。正常的子宫壁有3层，最外面的两层分别是浆膜层和肌层，最里面的一层是内膜层。申请人研究发现，只有子宫内膜层的去细胞基质生物相容性最好，包含很多营养因子，可以为子宫内膜损伤修复提供良好的营养微环境。而子宫浆膜层和肌层的去细胞基质生物相容性较差，且容易引起纤维化、瘢痕化及黏连的产生，不利于子宫内膜的修复。此外，子宫内特殊的酸性环境也是子宫内膜修复过程中重要影响的因素，而维生素C具有酸性调节、抗氧化和内膜上皮细胞保护等多功能，可以与其它营养组分共同发挥子宫内膜的修复作用。

因此，本申请保护的一种子宫内膜损伤修复的水凝胶，该水凝胶是由氨基化芦荟多糖-甘油醛凝胶、包载肝素高亲和性细胞生长因子的肝素-泊洛沙姆凝胶、维生素C、子宫内膜去细胞基质组成，通过改变组分配比，控制子宫内膜损伤修复水凝胶的力学强度和降解速度。

上述的水凝胶中包载肝素高亲和性细胞因子的肝素-泊洛沙姆凝胶的质量百分含量为40％-60％、氨基化芦荟多糖-甘油醛凝胶的质量百分含量为10％-20％、维生素C的质量百分含量为0.5％-2％、子宫内膜去细胞基质的质量百分含量为20％-40％。

上述的肝素高亲和性细胞因子在肝素-泊洛沙姆凝胶中的质量百分含量为0.001％～0.1％。

上述的肝素高亲和性细胞生长因子选自：转化生长因子、胰岛素样生长因子、角质细胞生长因子、成纤维细胞生长因子、表皮生长因子、血管内皮生长因子、神经生长因子中的一种或几种组合。

上述的肝素高亲和性细胞生长因子优选血管内皮生长因子。

上述的子宫内膜去细胞基质包括不同种动物的子宫内膜去细胞基质和同种动物的子宫内膜去细胞基质。

上述的子宫内膜去细胞基质优选同种动物的子宫内膜去细胞基质。

上述子宫内膜损伤修复的水凝胶的一种制备方法，是将大鼠子宫内膜去细胞基质粉碎，与包载肝素高亲和性细胞生长因子的肝素-泊洛沙姆凝胶混匀，加入氨基化芦荟多糖-甘油醛凝胶混匀，加入维生素C混匀，形成均匀的半固体凝胶。

上述子宫内膜损伤修复的水凝胶的另一种制备方法，是将大鼠子宫内膜去细胞基质粉碎，与氨基化芦荟多糖-甘油醛凝胶混匀，加入包载肝素高亲和性细胞生长因子的肝素-泊洛沙姆凝胶混匀，加入维生素C混匀，形成均匀的半固体凝胶。

上述的子宫内膜损伤修复的水凝胶用于子宫内膜各种损伤的修复。

与现有技术相比，本发明的子宫内膜损伤修复的水凝胶发挥“包载肝素高亲和性细胞生长因子的肝素-泊洛沙姆凝胶、氨基化芦荟多糖-甘油醛凝胶、维生素C、子宫内膜去细胞基质”各组分的优势，实现优势互补，在保证免疫源性低的前提下为内膜修复提供最佳的力学和生物学微环境，具体包括：①氨基化芦荟多糖-甘油醛凝胶，提供良好的免疫微环境，降低子宫内膜损伤修复水凝胶的免疫源性，同时具有力学性能，提供子宫内膜损伤修复所需的力学强度。②包载肝素高亲和性细胞生长因子的肝素-泊洛沙姆凝胶，具有引导和促进子宫内膜损伤快速修复的多重优点，包括：防止子宫内膜损伤修复的纤维形成、体温时形成弹性好的固体凝胶保证肝素高亲和性细胞因子不流失、保证肝素高亲和性细胞因子的缓慢释放和长效作用。③子宫内膜去细胞基质，提供内膜上皮细胞生长所需的各种养分。④维生素C具有抗氧化、酸性调节和内膜上皮细胞保护等多功能。⑤本发明的子宫内膜损伤修复水凝胶的降解速度和治疗药物的释放速度维持在6天左右，符合生理(月经)周期的需求。⑥本申请保护的技术方案中各组分是协同互补和必要的关系，共同发挥作用。

具体实施方式

下文将详细描述本发明具体实施例。应当注意的是，下述实施例中描述的技术特征或者技术特征的组合不应当被认为是孤立的，它们可以被相互组合从而达到更好的技术效果。

实施例1子宫内膜损伤修复的水凝胶的制备

制备方法1：按照表1的子宫内膜损伤修复的水凝胶各实验组的组成，秤取各组分，按照无菌操作法将子宫内膜去细胞基质粉碎，与包载肝素高亲和性细胞生长因子的肝素-泊洛沙姆凝胶混匀，加入氨基化芦荟多糖-甘油醛凝胶混匀，加入维生素C混匀，形成均匀的半固体凝胶。

制备方法2：按照表1的子宫内膜损伤修复的水凝胶各实验组的组成，秤取各组分，按照无菌操作法将子宫内膜去细胞基质粉碎，与氨基化芦荟多糖-甘油醛凝胶混匀，加入包载肝素高亲和性细胞生长因子的肝素-泊洛沙姆凝胶混匀，加入维生素C混匀，形成均匀的半固体凝胶。

各对照组的制备参照实验组的制备方法进行。

表1子宫内膜损伤修复的水凝胶各实验组的组成

注：“子宫内膜去细胞基质”项下括号内的动物是指子宫内膜去细胞基质的来源动物；Vit C：维生素C；TGF：转化生长因子；IGF：胰岛素样生长因子；KGF：角质细胞生长因子；bFGF：碱性成纤维细胞因子；VEGF：血管内皮生长因子；EGF：表皮生长因子；NGF：神经生长因子。

表2子宫内膜损伤修复的水凝胶各对照组的组成

注：Vit E：维生素E；Vit P：维生素P；各列括号内的材料是指该类材料的来源；英文缩写的生长因子全称见表1的注解。

实施例2在体评价各组子宫内膜损伤修复水凝胶应用效果

(1)大鼠子宫内膜损伤动物模型

通过机械刮宫法构建大鼠机械性子宫内膜损伤模型，方法为：在无菌手术室内，取体重250-300g的SPF级雌性SD大鼠，每日观察大鼠阴道涂片，处于动情间期的雌鼠用于模型构建。实验用大鼠用10％水合氯醛麻醉，以75％酒精对下腹部消毒，于尿道上端1cm处切开皮肤进入腹腔，暴露子宫，在右侧Y型子宫1/3处切口，利用自制刮勺刮除子宫内膜以模拟临床上人子宫内膜刮除术，造成病理性子宫内膜损伤，术后缝合手术切口。待大鼠麻醉苏醒后放入动物房饲养，饲养环境改为清洁笼具单笼喂养，勤换垫料并保持干燥，自由饮水和进食并加强营养，并在造模后三天内，每日常规大腿肌注青霉素钠200,000U/kg，防止伤口感染。

(2)各组水凝胶的体内应用效果

应用以上建立好的大鼠子宫内膜损伤模型，各组水凝胶经原位注射到已损伤的子宫内膜上，比较分析各组水凝胶对子宫内膜损伤的修复作用。在每组相对应实验时间点，取大鼠用10％水合氯醛麻醉，用250ml生理盐水经心脏灌流快速冲洗，待右心耳流出液体变澄清后，更换为4％多聚甲醛快速灌注，体内固定各部位组织，待大鼠肢体僵硬后缓慢滴注。将灌注完成的大鼠经腹部模型制备时所用切口剪开，暴露Y型子宫组织，小心取出右侧损伤处上下各0.25cm子宫，置于4％多聚甲醛中固定24h。将存放在4％多聚甲醛的子宫组织取出，用纱布包好放在细水流下冲洗过夜。硬蜡包埋，以5μm厚度的进行组织切片。

将以上大鼠子宫组织的病理切片，通过HE染色、TUNEL细胞凋亡、免疫组化方法，测定大鼠子宫内膜的修复效果；应用透射电镜(TEM)观察切取各实验组子宫内膜电镜标本，比较经不同组水凝胶应用后子宫内膜损伤部位的组织形态变化。

基于以上结果，采用双盲法评价各组水凝胶的应用效果，给出综合评分(满分10分)，分数越高代表综合效果越好。

实验结果：大鼠子宫内膜损伤修复水凝胶的实验结果见表3。从表3数据可见，各个实验组在体内免疫原性良好，大鼠子宫内膜损伤修复的免疫原性、材料力学强度、材料降解时间、子宫内膜损伤的修复效果等指标良好，验证了实验组对于大鼠子宫内膜损伤具有良好修复效果。各对照组中，免疫原性、材料力学强度、子宫内膜损伤的修复效果等指标很差，部分对照组的材料降解时间过长或过短，影响子宫正常生理周期，综合评分明显低于实验组结果。由上可知，各实验组对于大鼠子宫内膜损伤具有良好的修复效果，可以作为子宫内膜损伤修复的水凝胶。

表3各组子宫内膜损伤修复水凝胶的应用效果

上述详细说明是针对发明的可行实施例的具体说明，该实施例并非用以限制本发明的专利范围，凡未脱离本发明的等效实施或变更，均应当包含于本发明的专利范围内。

另外，本领域技术人员还可在本发明权利要求公开的范围和精神内做其它形式和细节上的各种修改、添加和替换。当然，这些依据本发明精神所做的各种修改、添加和替换等变化，都应包含在本发明所要求保护的范围之内。

Claims (10)

1.一种子宫内膜损伤修复的水凝胶及其制备方法，其特征在于，所述的水凝胶是由包载肝素高亲和性细胞生长因子的肝素-泊洛沙姆凝胶、氨基化芦荟多糖-甘油醛凝胶、维生素C、子宫内膜去细胞基质组成，通过改变组分配比，控制子宫内膜损伤修复水凝胶的力学强度和降解速度。

2.根据权利要求1所述的子宫内膜损伤修复的水凝胶，其特征在于：所述的水凝胶中包载肝素高亲和性细胞因子的肝素-泊洛沙姆凝胶的质量百分含量为40％-60％、氨基化芦荟多糖-甘油醛凝胶的质量百分含量为10％-20％、维生素C的质量百分含量为0.5％-2％、子宫内膜去细胞基质的质量百分含量为20％-40％。

3.根据权利要求1所述的子宫内膜损伤修复的水凝胶，其特征是：所述的肝素高亲和性细胞因子在肝素-泊洛沙姆凝胶中的质量百分含量为0.001％～0.1％。

4.根据权利要求1所述的子宫内膜损伤修复的水凝胶，其特征是：所述的肝素高亲和性细胞生长因子选自：转化生长因子、胰岛素样生长因子、角质细胞生长因子、成纤维细胞生长因子、表皮生长因子、血管内皮生长因子、神经生长因子中的一种或几种组合。

5.根据权利要求4所述的子宫内膜损伤修复的水凝胶，其特征是：所述的肝素高亲和性细胞生长因子优选血管内皮生长因子。

6.根据权利要求1所述的子宫内膜损伤修复的水凝胶，其特征是：所述的子宫内膜去细胞基质包括不同种动物的子宫内膜去细胞基质和同种动物的子宫内膜去细胞基质。

7.根据权利要求1所述的子宫内膜损伤修复的水凝胶，其特征是：所述的子宫内膜去细胞基质优选同种动物的子宫内膜去细胞基质。

8.一种根据权利要求1～7任一项所述子宫内膜损伤修复的水凝胶的制备方法，其特征是：将大鼠子宫内膜去细胞基质粉碎，与包载肝素高亲和性细胞生长因子的肝素-泊洛沙姆凝胶混匀，加入氨基化芦荟多糖-甘油醛凝胶混匀，加入维生素C混匀，形成均匀的半固体凝胶。

9.一种根据权利要求1～7任一项所述子宫内膜损伤修复的水凝胶的制备方法，其特征是：将大鼠子宫内膜去细胞基质粉碎，与氨基化芦荟多糖-甘油醛凝胶混匀，加入包载肝素高亲和性细胞生长因子的肝素-泊洛沙姆凝胶混匀，加入维生素C混匀，形成均匀的半固体凝胶。

10.根据权利要求1～9所述的子宫内膜损伤修复的水凝胶，其特征是：所述的子宫内膜损伤修复的水凝胶用于子宫内膜各种损伤的修复。