CN109562053B

CN109562053B - 通过番木瓜汁的水不溶性部分活化的脂肪和/或蜡

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Publication number: CN109562053B
Application number: CN201780026929.3A
Authority: CN
Inventors: C·科凯
Original assignee: ISP Investments LLC
Current assignee: ISP Investments LLC
Priority date: 2016-03-08
Filing date: 2017-03-07
Publication date: 2022-04-15
Anticipated expiration: 2037-03-07
Also published as: US20190307670A1; KR20180115328A; CN109562053A; EP3426355B1; US20230015456A1; US11478418B2; EP3426355A1; JP2019507780A; WO2017153422A1; FR3048610B1; FR3048610A1

Abstract

本发明涉及一种获得富含番木瓜脂肪酶的番木瓜汁的水不溶性部分的方法、通过该方法可获得的水不溶性部分、一种通过所述番木瓜汁的水不溶性部分制备活化脂肪和/或活化蜡的方法、能够通过该方法获得的活化脂肪和/或活化蜡、一种结合所述活化脂肪和/或所述活化蜡的组合物，以及这些产品的美容用途。

Description

通过番木瓜汁的水不溶性部分活化的脂肪和/或蜡

技术领域

本发明涉及化妆品领域。更具体地，本发明涉及通过皮肤涂敷/途径施用的活化脂肪和/或活化蜡，所述活化脂肪和/或活化蜡可用于化妆品中，特别是用于延迟皮肤老化的出现或限制皮肤老化迹象，保护皮肤和/或表面体表面抵抗所有类型的外部侵害，和/或促进皮肤水平的细胞分化，或增强皮肤和/或表面体表面的屏障功能。

背景技术

皮肤是一种重要的器官，提供多种功能，如感觉和保护功能，以及抵抗多种外部侵害(屏障功能)的免疫、代谢或体温调节功能。由于三个不同的叠加层中的结构：表皮，真皮和皮下组织，使得这些功能成为可能。表皮是表面上皮，构成皮肤的外部结构并确保其保护功能。通过上皮细胞的凝聚和通过产生丝状和抗性的蛋白质、角蛋白来确保该功能。真皮是结缔组织，由基本物质构成，其中浸没有成纤维细胞、胶原纤维和弹性蛋白纤维、由成纤维细胞合成的蛋白质纤维。胶原纤维提供了真皮强度的很大一部分，它们有助于弹性，特别是皮肤和/或粘膜的健康状态。真皮下面是一层脂肪组织：皮下组织。

与所有其它器官一样，皮肤会老化。皮肤老化方法涉及的因素多种多样。皮肤随时间老化的现象尤其伴随着细胞功能的减慢和细胞外基质的某些蛋白质中结构异常的出现。皮肤变得不那么柔软、细腻，经常干燥并且失去弹性，伴有皱纹和细纹。

在表皮中，角质形成细胞增殖的减慢和随年龄的分化是解释衰老过程中皮肤变薄的一个因素。表皮萎缩，皮肤失去其保护能力。皮肤成纤维细胞也发生改变，并且细胞外基质蛋白如胶原蛋白或弹性蛋白的产生减少。

长期暴露于紫外线和其它侵略性环境因素加速并加剧皮肤老化现象。我们谈到的是光老化。

在老化方法中起主要作用的机制之一是在必需分子中例如在脂质膜、蛋白质、DNA中，尤其是在线粒体DNA中氧化损伤的累积。因此，这些损伤累积的重要后果之一是细胞产生ATP的能力降低。

多年来，健康和化妆品专业人士一直在寻找方法来对抗或至少减少皮肤老化的现象，以及增加皮肤对外部侵害以及每天所承受的压力的抵抗力的方法。

在化妆品中，油是天然化妆品概念的基础。由于其水合和保护性质，传统上使用通过自然处理而不添加合成化学品获得的植物油。

由于它们的特定组成，化妆品中最常用的油是由长链多不饱和酸组成的油，特别是γ-亚麻酸，它在膜的流动性、减少表皮水分流失以及预防皮肤老化中起特殊作用。实际上，一些脂肪酸可能改善或维持皮肤的水合度。

油最通常用作赋形剂而不是活性成分。然而，申请人先前已开发出一种组合物，特别是用于美容目的，其包含在生理学上可接受的介质中至少特定二酰基甘油(缩写为“DAG”)和特定脂肪醇的组合作为活性成分。该组合物在专利申请PCT/FR2004/000944中描述并要求保护，以申请人的名义在参考文献WO 2004/093832 A2下公开。

二酰基甘油(DAG)是因其标记性质而在现有技术中具体描述的化合物。它们起着重要作用，特别是通过它们对蛋白激酶C的作用，并因此具有细胞激活剂的功能。

如专利申请WO 2004/093832中所公开的，获得DAG的反应方法可以是在酸性或碱性介质中进行的化学反应，例如甘油三酯脂肪的水解。该水解也可以酶促进行，例如使用水解酶如脂肪酶的生化反应。优选地，WO 2004/093832的组合物中使用的DAG得自包含已经历酶水解，特别是脂肪酶水解的甘油三酯的脂肪(动物、植物或合成油)。

脂肪酶是水解甘油酯的酶。根据它们的不同反应速率水平确定几种类型的脂肪酶。根据它们的不同特性，这些酶也可分为几类：相对于底物；位置特异性或区域选择性；相对于脂肪酸的特异性或类型选择性；相对于位置的特异性或立体定向性。

一些脂肪酶没有特定的特异性。其它是区域选择性的：因此，例如，胰脂肪酶和微生物来源的脂肪酶、曲霉属、根霉属或米黑根毛霉是1,3-选择性脂肪酶。区域选择性脂肪酶在脂肪工业和洗涤剂中都有常见的工业用途。其它脂肪酶是立体定向性的，例如念珠菌脂肪酶，其具有sn2型的立体特异性。sn命名法根据Fisher投影中呈现的不对称碳构型确定甘油三酯骨架的sn1、sn2和sn3位置。

在WO 2004/093832中，有利地使用sn3型的立体特异性脂肪酶(即，其允许甘油三酯在3位水解)。因此，该脂肪酶在3位水解甘油三酯，优先形成1,2-DAG。使用的脂肪酶可以是植物来源(番木瓜)或微生物(圆弧青霉)。根据优选的实施方案，甘油三酯的水解在WO2004/093832中用番木瓜的脂肪酶进行(Villeneuve et al.,JAOCS,72,6:753.1995)。

然而，尽管通过实施专利申请WO 2004/093832的教导获得的组合物在皮肤水平上具有特别令人满意的美容性质，但申请人已经努力改进制备这些组合物的方法十多年，该方法在WO 2004/093832的实施例1中举例说明。更具体地，如该实施例1中所示，用生木瓜汁液进行酶促水解反应以获得1,2-DAG是可能的，然而使用在水性介质中溶解后，并用多元醇或冻干保存的该汁液的纯化制剂。实际上，作为WO 2004/093832的实施例1的目的的制备方法，如果起作用，存在许多实际困难。实际上，关于生木瓜汁的使用，鉴于以下事实，这是特别不利的：生木瓜汁不仅含有目标脂肪酶而且含有蛋白酶(其中有木瓜蛋白酶，一种蛋白酶半胱氨酸)，所述蛋白酶可能降解脂肪酶，或者至少对其酶活性产生负面影响。

因此，WO 2004/093832的实施例1支持使用在水性介质中溶解后，在多元醇(例如山梨糖醇)中保存或冷冻干燥的该汁液的纯化制剂，这是合乎逻辑的。关于后一种可能性，本领域技术人员已知冻干物存在许多缺点，其中包括它们对大气湿度的极端敏感性及其复杂(因此昂贵)的制造方法。

关于在水性介质中溶解并在多元醇(例如山梨糖醇)中保存后使用木瓜汁的纯化制剂的技术方案，结果表明该技术具有在甘油三酯部分水解后需要复杂处理的特别缺点。事实上，为了阻止甘油三酯的部分水解反应，必须对含有保存在多元醇中的番木瓜脂肪酶的水性介质，特别是使用有机溶剂进行几次洗涤步骤。

此外，申请人已经发现，溶解在水性介质中并保存在多元醇中的番木瓜脂肪酶已经经历冷冻，因此几乎不能-甚至不能-以冷冻形式保存，而这从确保番木瓜脂肪酶随着时间高质量、方便并廉价的保存的角度看是非常理想的。

发明内容

通过研究，申请人已经开发出一种真正的技术平台来克服上述缺点的全部或部分。该技术平台主要基于获得和使用番木瓜汁的水不溶性(不溶于水的)部分。因此，本发明的目的是获得富含番木瓜脂肪酶的番木瓜汁的水不溶性部分的方法，所述方法包括以下步骤：

a)将生番木瓜汁粉(dried raw Carica papaya sap)悬浮在蒸馏水中，有利地，生番木瓜粉/蒸馏水的重量比为约0.01至约0.5(优选0.01至0.5)，优选约0.05至约0.25(优选0.05至0.25)，优选约0.08至约0.2(优选0.08至0.2)，特别优选为约0.1(优选0.1)，

b)有利地在一定时间段内以一定转速离心分离步骤a)中获得的悬浮液以获得含有番木瓜汁的所述水不溶性部分的颗粒，所述时间段为约5分钟至约90分钟(优选5分钟至90分钟)，优选约15至约60分钟(优选15分钟至60分钟)，优选约20至约40分钟(优选20至40分钟)，以及所述转速为约2000至约6000rpm(优选2000至6000rpm)，优选约3000至约5000rpm(优选3000至5000rpm)，优选为约4000rpm(优选4000rpm)，

c)回收含有所述富含番木瓜脂肪酶的番木瓜汁的水不溶性部分的颗粒。

在特别有利的实施方案中，所述方法在步骤a)之后和步骤b)之前包括以下步骤：

a')在一定温度下搅拌步骤a)中获得的悬浮液一段时间，所述时间为约15分钟至约240分钟(优选15分钟至240分钟)，有利地为约30分钟至约180分钟(优选30分钟至180分钟)，优选约60分钟至约150分钟(优选60分钟至150分钟)，特别优选为约120分钟(优选120分钟)，以及所述温度为约10℃至约30℃(优选10℃至30℃)，约15℃至约25℃(优选15℃至25℃)，优选为室温。

所述室温是指温度为约20℃至约25℃(优选20℃至25℃)，有利地是约20℃(优选20℃)的温度。

优选地，所述方法在步骤b)之后和步骤c)之前包括以下步骤：

b')干燥湿颗粒直至获得颗粒状粉末；

富含番木瓜脂肪酶的番木瓜汁的水不溶性部分在步骤c)中以颗粒状粉末的形式回收。

本发明的另一个目的涉及通过上述方法可获得的富含番木瓜脂肪酶的番木瓜汁的水不溶性部分。

本发明还涉及通过上述方法直接获得的富含番木瓜脂肪酶的番木瓜汁的水不溶性部分。

特别有利的是，申请人已经发现，这种富含番木瓜脂肪酶的番木瓜汁的水不溶性部分可以简单地通过冷冻保存。此外，获得这种富含番木瓜脂肪酶的番木瓜汁的水不溶性部分的方法实施起来非常简单并且便宜。

本发明还涉及根据本发明的番木瓜汁的水不溶性部分用于使脂肪富含二酰基甘油(并因此获得活化脂肪)和/或使蜡富含脂肪醇(并因此获得活化蜡)的用途。

本发明的另一个目的涉及一种制备富含二酰基甘油的脂肪(活化脂肪)的方法，所述方法包括以下步骤：

i)将脂肪与水或与优选含有二价离子，例如钙离子或镁离子的盐溶液混合，水或盐溶液/脂肪的体积比为约0.005至约0.5(优选0.005至0.5)，优选约0.01至约0.4(优选0.01至0.4)，

ii)优选在一定的时间段内将该混合物保持在搅拌下(优选剧烈搅拌下，优选约2000至约3000rpm(优选2000至3000rpm)的速度；所述剧烈搅拌有利地通过促进乳液的装置获得)和一定温度下，直至获得在脂肪和水之间的乳液，所述温度为约30℃至约70℃(优选30℃至70℃)，有利地为约50℃(优选50℃)，所述时间为约1至约30分钟(优选1至30分钟)，优选约5至约20分钟(优选5至20分钟)，优选约10分钟(优选10分钟)，

iii)在所述温度下继续搅拌(优选适度搅拌，优选以约200至约300rpm[优选200至300rpm]的速度)，使前一步骤中获得的混合物与给定体积的通过实施获得上述番木瓜汁的水不溶性部分的方法获得的富含番木瓜脂肪酶的番木瓜汁的水不溶性部分接触，番木瓜汁的水不溶性部分/所用脂肪的体积比为约0.01至约0.2(优选0.01至0.2)，有利地为约0.05至0.015(优选0.05至0.015)，优选约0.1(优选0.1)，

iv)保持所述温度和搅拌约1小时至约6小时(优选1小时至6小时)，有利地约2小时至约5小时(优选2小时至5小时)，优选约4小时(优选4小时)，以获得富含二酰基甘油的脂肪。

在一个特别优选的实施方案中，该制备富含二酰基甘油的脂肪(活化脂肪)的方法在步骤iv)之后包括以下步骤：

v)过滤步骤iv)中获得的混合物，优选使用至少一个梯度过滤器或至少两个孔隙率降低、有利地由约500μm至约250μm(优选由500μm至250μm)降低的过滤器的至少一种叠加，以从含有富含二酰基甘油的脂肪的反应介质中分离出所述富含番木瓜脂肪酶的番木瓜汁的水不溶性部分。

优选地，所述方法在步骤v)之后包括以下两个步骤中的至少一个，并且有利地同时包括以下两个步骤：

-通过干燥剂如无水硫酸镁除去存在于含有富含二酰基甘油的脂肪的反应介质中的残留水，和/或

-通过活性炭对所述富含二酰基甘油的脂肪除臭和/或改善所述富含二酰基甘油的脂肪的光泽。

该过滤步骤v)使得可以容易地停止脂肪中包含的甘油三酯的部分水解反应，而不需要多个含有保存在多元醇中的脂肪酶的水性介质洗涤步骤(如WO 2004/093832的实施例1的方法的情况)并避免使用有机溶剂。在该过滤步骤v)之后，水不溶性部分番木瓜汁也易于回收并且可以重复使用。

通常，可以使用通过上述制备方法获得的番木瓜汁的水不溶性部分的事实使得脂肪的后部分水解处理相对容易。此外，申请人已经发现，使用该富含番木瓜脂肪酶的番木瓜汁的水不溶性部分将保留具有有利的化妆性质的不饱和脂肪酸。

根据一个特定的实施方案，在步骤v)中过滤的富含番木瓜脂肪酶的番木瓜汁的水不溶性部分在该方法的步骤iii)中重复使用，以制备根据本发明的富含二酰基甘油的脂肪。

优选地，所述脂肪是动物、植物和/或海洋来源的油，初榨的或精制的，有利地是初榨的，所述油优选是植物和/或海洋来源的，优选植物来源的。

特别重要的是要注意使用番木瓜汁的水不溶性部分使其可以与初榨油一起“起作用”，即用二酰基甘油富集(活化)初榨油，出于安全性和无害性的原因这是特别理想的(不存在与精制油等有关的有机溶剂)。此外，根据本发明的制备富含二酰基甘油的脂肪的方法特别适用于初榨油的富集，只要初榨油的不皂化部分不被所述方法劣化，所用的酶活性是三酰基甘油酯酶类型。这使得可以在富集二酰基甘油方法后保持初榨油的生物活性；通过所述方法进一步改善这种生物活性。

优选地，所述脂肪是包含甘油三酯的油，所述甘油三酯具有：

-碳数为12至26，有利地为16至20，特别优选为16至18的脂肪酸的脂族烃链，所述脂族烃链是直链或支链的，有利地是直链的；饱和的或不饱和的，有利地是不饱和的，不饱和度优选为1至6，优选1至3；或者

-单或多羟基化的和/或单或多甲氧基化的和/或单或多氧化的和/或单或多环氧化的链。

根据本发明特别优选的实施方案，使用油，优选初榨油作为脂肪，选自琼崖海棠油、覆盆子油、山茶油、月见草油、巴西坚果油、猴面包树油和橄榄油，或者这些油中至少两种的混合物；所述油，优选初榨油，有利地选自琼崖海棠油、覆盆子油、山茶油、月见草油、巴西坚果油和猴面包树油或这些油中至少两种的混合物；所述油，优选初榨油，优选选自琼崖海棠油，覆盆子油，月见草油和猴面包树油或这些油中至少两种的混合物；特别优选地，所述脂肪是琼崖海棠油，优选初榨的琼崖海棠油。

上述二酰基甘油由分别由下式(I)和(II)表示的1,2-二酰基甘油和1,3-二酰基甘油组成：

其中R₁和R₂是：

-碳数为12至26，有利地为16至20，特别优选为16至18的脂肪酸的脂族烃链(换句话说，R₁和R₂表示碳数为11至25，有利地为15至19，特别优选15至17的脂族烃链)，所述脂族烃链是直链或支链的，有利地是直链的；饱和的或不饱和的，有利地是不饱和的，不饱和度优选为1至6、优选1至3；或者

-单或多羟基化的，和/或单或多甲氧基化的，和/或单或多氧化的，和/或单或多环氧化的链。

优选地，所述二酰基甘油主要包含由以下通式(I)表示的1,2-二酰基甘油，优选基本上由以下通式(I)表示的1,2-二酰基甘油组成：

其中R₁和R₂是：

本发明还涉及一种制备富含脂肪醇的蜡(活化蜡)的方法，通过进行以下改变实施上述制备富含二酰基甘油的脂肪的方法：

-将蜡用作脂肪；和

-代替富含二酰基甘油的脂肪，得到富含脂肪醇的蜡，所述脂肪醇有利地是式(III)的脂肪醇：

(III)R”–OH

其中R”代表：

-含有10至34个碳原子，优选12至26个碳原子，特别优选16至22个碳原子的脂肪醇的脂族烃链；

所述脂族烃链是直链或支链的，有利地是直链的；是饱和或不饱和的，优选具有最多6个不饱和度；或者

换句话说，本发明涉及一种制备富含脂肪醇的蜡(活化蜡)的方法，所述方法包括以下步骤：

i’)将蜡与水或与优选含有二价离子，例如钙或镁离子的盐溶液混合，水或盐溶液/蜡的体积比为约0.005至约0.5(优选0.005至0.5)，优选约0.01至约0.4(优选0.01至0.4)，

ii')优选在一定的时间段内保持该混合物在搅拌下和在一定温度下直至获得蜡和水之间的乳液，所述温度为约30℃至约70℃(优选为30℃至70℃)，有利地为约50℃(优选50℃)，所述时间有利地为约1至30分钟(优选1至30分钟)，优选约5至约20分钟(优选5至20分钟)，且优选为约10分钟(优选10分钟)，

iii')仍然在搅拌下和所述温度下，使前一步骤中获得的混合物与给定体积的通过实施获得上述番木瓜汁的水不溶性部分的方法获得的富含番木瓜脂肪酶的番木瓜汁的水不溶性部分接触，番木瓜汁的水不溶性部分/使用的蜡的体积比为约0.01至约0.2(优选0.01至0.2)，有利地为约0.05至0.015(优选0.05至0.015)，优选约0.1(优选0.1)，

iv')保持所述温度和搅拌一段时间以获得富含脂肪醇的蜡，所述时间为约1小时至约6小时(优选1小时至6小时)，有利地约2小时至约5小时(优选2小时至5小时)，优选约4小时(优选4小时)。

优选地，该方法在步骤iv')之后包括以下步骤：

v')过滤步骤iv')中获得的混合物，优选使用至少一个梯度过滤器或至少两个孔隙率降低、有利地由约500μm至约250μm(优选由500μm至250μm)降低的过滤器的至少一种叠加，以将所述富含番木瓜脂肪酶的番木瓜汁的水不溶性部分从含有富含脂肪醇的蜡的反应介质中分离出来。

优选地，所述方法在步骤v')之后包括以下两个步骤中的至少一个，有利地同时包括以下两个步骤：

-通过干燥剂如无水硫酸镁除去存在于含有富含脂肪醇的蜡的反应介质中的残留水，和/或

-通过活性炭对所述富含脂肪醇的蜡除臭和/或改善所述富含脂肪醇的蜡的光泽。

出于本发明的目的，所述蜡优选选自：

-动物来源的蜡，例如蜂蜡，

-矿物来源的蜡，或者，优选地，

-植物来源的蜡，例如荷荷巴蜡、巴西棕榈蜡、小烛树蜡或其混合物；

所述蜡有利地是荷荷巴蜡。

在一个特别重要的实施方案中，本发明的目的还在于一种富含二酰基甘油的脂肪，其可通过本发明的制备富含二酰基甘油的脂肪的方法获得(参见上文)。当然，本发明还涉及通过根据本发明的制备富含二酰基甘油的脂肪的方法直接获得的富含二酰基甘油的脂肪(参见上文)。

根据一个优选的实施方案，所述脂肪具有的二酰基甘油含量为约5％至约30％(优选5％至30％)，优选约7％至约18％(优选7％至18％)，酸指数为约15至约50mg/g(优选15至50mg/g)，过氧化物指数为约5至30mg/g(优选5至30mg/g)，优选小于20mg/g。

这种富含二酰基甘油的脂肪也称为“活化脂肪”。

如上所述，这种富含二酰基甘油的脂肪(活化的)是动物、植物和/或海洋来源的油，初榨的或精制的，有利地是初榨的，所述油优选是植物和/或海洋来源的，优选植物来源的。

在一个特别优选的实施方案中，这种富含二酰基甘油的脂肪(活化的)是一种油，优选初榨油，选自琼崖海棠油、覆盆子油、山茶油、月见草油、巴西坚果油、猴面包树油和橄榄油，或这些油中至少有两种的混合物；所述油，优选初榨油，有利地选自琼崖海棠油、覆盆子油、山茶油、月见草油、巴西坚果油和猴面包树油或这些油中至少两种的混合物；特别优选地，所述脂肪是琼崖海棠油，优选初榨的琼崖海棠油。实际上，申请人已经发现，当通过皮肤施用时，这些(优选初榨的)富含二酰基甘油，优选1,2-二酰基甘油的油具有特别有利的化妆性质。这就是为什么本发明独立于由用于生产活化油的富集二酰基甘油的方法更广泛地扩展到如上定义的富含二酰基甘油，有利地1,2-二酰基甘油的油(活化油)。

本发明的另一个目的涉及富含脂肪醇的蜡(活化蜡)，其能够通过上述制备富含脂肪醇的蜡的方法获得。当然，本发明还涉及通过上述制备富含脂肪醇的蜡的方法直接获得的富含脂肪醇的蜡(活性蜡)。

本发明的目的还在于一种化妆品组合物，其包含以下，基本上由以下组成或由以下组成：

-至少一种如上所述的富含二酰基甘油的脂肪，其含量占组合物总重量的10^-6％至20％，优选10^-4％至10％，优选10^-3％至2％，优选0.01％至5％，甚至更优选占最终组合物的总重量的0.5至2.5％，和

-至少一种生理学上可接受的赋形剂。

-至少一种如上所述的富含脂肪醇的蜡，其含量占组合物总重量的10^-6％至10％，优选10^-4％至1％，优选0.01％至3％，甚至更优选占最终组合物总重量的0.1％至2.0％，和

-至少一种生理学上可接受的赋形剂。

在一个特别重要的实施方案中，本发明的目的还在于一种化妆品组合物，其包含以下，基本上由以下组成或由以下组成：如上所述的至少一种富含二酰基甘油的脂肪和至少一种如上所述的富含脂肪醇的蜡的混合物，富含脂肪醇的蜡/富含二酰基甘油的脂肪的重量比有利地为0.01至0.11，优选0.02至0.08，优选约0.03(优选0.03)。

-如上所述的至少一种富含二酰基甘油的脂肪和至少一种如上所述的富含脂肪醇的蜡的混合物，富含脂肪醇的蜡/富含二酰基甘油的脂肪的重量比有利地为0.01至0.11，优选为0.02至0.08，优选约0.03(优选0.03)，和

-至少一种生理学上可接受的赋形剂。

-如上所述的至少一种富含二酰基甘油的脂肪和至少一种如上所述的富含脂肪醇的蜡的混合物，其量占组合物总重量的10^-6％至20％，优选占10^-4％至10％，优选0.01％至5％，甚至更优选占最终组合物总重量0.5至2.5％，和

-至少一种生理学上可接受的赋形剂。

根据本发明的组合物可以通过任何合适的途径施用，特别是口服或外部局部施用，并且组合物的制剂将由本领域技术人员调整。

优选地，根据本发明的组合物是适于局部施用的形式。因此，这些组合物必须含有生理学上可接受的介质，也就是说，所述介质与皮肤及其附器相容，在施用期间没有不适的风险并且覆盖所有合适的化妆品形式。

局部施用意指将根据本发明的组合物施用或涂抹在皮肤或粘膜表面上。

在本发明的上下文中，生理学上可接受的赋形剂表示适于与皮肤外层或其附器接触的载体，也就是说，所述载体不表现出毒性并且不引起刺激、过度的过敏反应或不耐受反应。生理学上可接受的赋形剂可包含一种或多种化合物。

作为通常用于预期应用领域的生理学上可接受的赋形剂，可提及例如制剂所需的佐剂，例如溶剂、增稠剂、稀释剂、抗氧化剂、染料、防晒剂、自晒黑剂、颜料、填料、防腐剂、香料、异味吸收剂、精油、维生素、必需脂肪酸、表面活性剂、成膜聚合物等。

在所有情况下，本领域技术人员将确保以不损害本发明组合物的所需有利性质的方式选择这些佐剂及其比例。

生理学上可接受的赋形剂可包含一种或多种化合物。

用于实施本发明的组合物尤其可以是水溶液、含水醇溶液或含油溶液、水包油乳液、油包水或多重乳液的形式；它们也可以是悬浮液或甚至粉末的形式，适于施用到皮肤、粘膜、嘴唇和/或头发上。

这些组合物可以或多或少是流动的，并且还可以具有乳膏、乳液、乳、乳浆、软膏、凝胶、糊剂或泡沫的外观。它们也可以是固体形式，棒状或可以以气溶胶的形式施用于皮肤。

在所有情况下，本领域技术人员将确保以不损害本发明组合物的所需有利性质的方式选择这些佐剂及其比例。这些佐剂可以例如占组合物总重量的0.01至20％。当根据本发明的组合物是乳液时，相对于组合物的总重量，脂肪相可以占5至80重量％，且优选5-50重量％。组合物中使用的乳化剂和助乳化剂选自在所考虑的领域中常规使用的那些。例如，相对于组合物的总重量，它们可以以0.3至30重量％的比例使用。

根据本发明的另一个有利的实施方案，根据本发明的活性成分可以包封或包括在化妆品载体例如脂质体或用于化妆品领域的任何其它纳米胶囊或微胶囊中，或吸附在粉末状有机聚合物、矿物质载体如滑石和膨润土上。

有利地，除了根据本发明的活性成分之外，根据本发明的组合物还可以包含至少一种具有与本发明的美容效果类似和/或互补的美容效果的其它活性成分。根据本发明，该活性成分被定义为“另外的活性成分”。

例如，所述另外的活性成分可以选自：抗衰老、紧致、淡化、保湿、排液、微循环促进剂，刺激细胞外基质、激活能量代谢、抗菌、抗真菌、舒缓、抗自由基、抗紫外线、抗痤疮、抗炎的药剂、去角质剂、脱屑剂，提供温暖感，以及清新和苗条的感觉的麻醉剂。

这些另外的试剂可选自以下组：

-维生素A，特别是维甲酸、视黄醇、视黄醇丙酸酯和视黄醇棕榈酸酯；

-维生素B3，更特别是烟酰胺、烟酸生育酚；

-维生素B5、维生素B6、维生素B12、泛醇；

-维生素C，特别是抗坏血酸、抗坏血酸葡糖苷、抗坏血酸四棕榈酸酯、镁和抗坏血酸磷酸钠；

-维生素E、F、H、K、PP，辅酶Q10；

-金属蛋白酶抑制剂，或TIMPs的激活剂；

-DHEA、其前体和衍生物；

-氨基酸如精氨酸、鸟氨酸、羟脯氨酸、羟脯氨酸二棕榈酸酯、棕榈酰甘氨酸、羟赖氨酸、甲硫氨酸及其衍生物、N-酰基氨基酸化合物；

-天然或合成肽，包括二肽、三肽、四肽、五肽和六肽及其亲脂性衍生物、异构体，和与其它物质如金属离子(如铜、锌、锰、镁及其它)的络合物。举例来说，可以提及商品名为

CHRONOGEN^TM，LAMINIXYL IS^TM，PEPTIDE Q10^TM，COLLAXYL^TM(专利FR2827170,

)，PEPTIDE VINCI 01^TM(专利FR2837098,

)，PEPTIDE VINCI 02^TM(专利FR2841781,

)，ATPeptide^TM(专利FR2846883,

)的肽或由

以ATPeptide ^TM的名称销售的合成肽序列Arg-Gly-Ser-NH2；

-卤虫提取物，以GP4G^TM(FR2817748,

)的名称销售；

-植物肽提取物，例如亚麻籽提取物(Lipigenine TM，专利FR2956818，

)、大豆、斯佩尔特小麦、葡萄、油菜籽、亚麻、大米、玉米和豌豆提取物；

-酵母提取物，例如Dynagen^TM(专利FR2951946,

)或Actopontine^TM(专利FR2944526,

)；

-脱氢乙酸(DHA)；

-合成或天然来源的植物甾醇；

-水杨酸及其衍生物、α-和β-羟基酸、硅烷醇；

-氨基糖、葡萄糖胺、D-葡糖胺、N-乙酰葡糖胺、N-乙酰-D-葡糖胺、甘露糖胺、N-乙酰甘露糖胺、半乳糖胺、N-乙酰半乳糖胺；

-多酚提取物、异黄酮、黄酮类，如葡萄提取物、松树提取物、橄榄提取物；

-脂质如神经酰胺或磷脂、动物油如角鲨烯或角鲨烷；植物油，如甜杏仁、椰子、蓖麻、荷荷巴油、橄榄、油菜籽、花生、向日葵、小麦胚芽、玉米胚芽、大豆、棉花、苜蓿、罂粟、南瓜、月见草、小米、大麦、黑麦、红花、西番莲、榛子、棕榈、杏仁、鳄梨、金盏花；乙氧基化植物油和乳木果油；

-所有防紫外线剂和防晒霜；

-环状AMP及其衍生物、腺苷酸环化酶的活化剂和磷酸二酯酶抑制剂、积雪草提取物、积雪草苷和积雪草酸、甲基黄嘌呤、茶碱、咖啡因及其衍生物、茶碱、可可碱、毛喉素、七叶苷和七叶灵、ACE抑制剂，Val-Trp肽、神经肽Y抑制剂、脑啡肽、银杏叶提取物、山药提取物、芦丁、巴拉圭茶提取物、瓜拉那提取物、低聚糖、多糖、肉碱、常春藤提取物、墨角藻提取物、提取水解的夏枯草、鸡冠花的水解提取物、光滑果榆绿木提取物、木薯叶提取物、棕榈酰肉碱、肌肽、牛磺酸、接骨木提取物、海藻提取物如掌状红皮藻提取物。

本发明的目的还在于有效量的至少一种根据本发明的富含二酰基甘油的脂肪、至少一种根据本发明的富含脂肪醇的蜡或根据本发明的组合物的美容用途，所述用途是通过皮肤施用以在健康的人类或动物个体(优选哺乳动物)，优选人类中：

-延迟皮肤老化的出现或限制皮肤老化迹象，和/或

-保护皮肤和/或其附器免受各种外部侵害，和/或

-促进表皮分化，和/或

-加强皮肤和/或其附器的屏障功能。

“皮肤老化的可见迹象”是指由于老化引起的皮肤外观的任何变化，例如细纹和皱纹、色素缺陷如老年斑或缺乏光泽、眼袋、黑眼圈、萎缩、失去弹性、紧致度和/或肤色，以及皮肤中不会系统地导致外观变化的任何内部变化，例如皮肤变薄，或由环境压力如污染和紫外线辐射造成的任何内部皮肤损伤。

皮肤是一种器官，其上部，角质层和覆盖它的水脂膜，作为免于受到外部环境损害的物理屏障。这种屏障作用，通常称为“皮肤屏障功能”，在组织的自体调节中具有重要意义。然而，众所周知，屏障功能的改变是由紫外线辐射(UVA和UVB)、寒冷、干旱、大气污染、某些化学物质等因素导致的外部侵害造成的。在皮肤老化期间也观察到屏障功能的改变，并且尤其是由于减慢和异常的表皮分化，这可能导致皮肤渗透性的增加。

根据本发明的组合物可以通过有利于最佳的表皮分化来对抗所有这些外部侵害，使得可以维持足以维持由皮肤代表的这种基本屏障功能的功能组织结构和生理渗透性。

本发明的目的还在于一种美容治疗方法，所述方法用于延迟皮肤老化的出现或限制皮肤老化的迹象和/或在皮肤水平上对抗细胞老化现象和/或保护皮肤和/或其附器免受所有类型的外部侵害和/或促进皮肤水平上的细胞分化和/或增强皮肤和/或其附器的屏障功能，所述方法包据在至少部分皮肤和/或其附器上施用有效量的根据本发明如上定义的组合物。

附图说明

为了完整起见，申请人为了表征番木瓜汁的水不溶性部分而获得的实验数据如下，在本发明的详细描述中。该实验数据参见图1-4，图1-4简要介绍如下：

图1是木瓜汁中存在的蛋白质(1)，在木瓜汁的水不溶性部分(也称为“非水溶性”)中存在的蛋白质(2)，在木瓜汁的水可溶性部分(也称为“水溶性”)中存在的蛋白质(3)，商业木瓜蛋白酶(Fluka)(4)，和12％聚丙烯酰胺凝胶上的分子量标记物(Invitrogen)(M)的蛋白质的电泳图谱；

图2是在木瓜汁上(1)，木瓜汁的水不溶性部分上(2)，木瓜汁的水溶性部分上(3)和商业木瓜蛋白酶上(4)用抗体靶向木瓜蛋白酶进行的蛋白质印迹法图像；

图3是含有10％酪蛋白用于蛋白酶检测的12％聚丙烯酰胺酶谱凝胶；所述酶谱凝胶上放有木瓜汁(1)，木瓜汁的水不溶性部分(2)，木瓜汁的水溶性部分(3)，标准木瓜蛋白酶(Sigma，Ref P4752)(5)；这种酶谱凝胶用考马斯蓝染色；

图4A是在用考马斯蓝显示的14％聚丙烯酰胺凝胶上的非变性条件的酶谱凝胶；其上放有木瓜汁(1)，木瓜汁的水不溶性部分(2)，木瓜汁的水溶性部分(3)，商业木瓜蛋白酶(Fluka)(4)，以及分子量标记物(M)；

图4B是在14％聚丙烯酰胺凝胶上的非变性条件下的酶谱凝胶，通过覆盖由橄榄油和维多利亚蓝(B)组成的凝胶显示；凝胶酶谱上放有木瓜汁(1)，木瓜汁的水不溶性部分(2)，木瓜汁的水溶性部分(3)，商业木瓜蛋白酶(Sigma，ref.P4752)(4)，以及分子量标记物(M)。

图5是显示了人皮肤样品中琼崖海棠、猴面包树、覆盆子和月见草的0.5％活化油和灭活油的泛细胞角蛋白标记的定量图。

具体实施方式

定义

脂肪：在本发明的含义内，脂肪具有现有技术中普遍接受的定义，即由具有疏水性质的分子组成的物质。脂肪主要由甘油三酯组成，甘油三酯是衍生自甘油分子和三种脂肪酸的酯。其它组分形成所谓的不皂化部分或“不皂化物”。主要脂肪是：

-在室温下呈液态的油，因为它们主要由具有低熔点的不饱和脂肪酸组成；

-在室温下呈糊状或固体的脂肪，因为它们主要由具有较高熔点的饱和脂肪酸组成。

如上所述，为了本发明的目的，动物、植物和/或海洋来源的油，初榨的或精制的，有利地是初榨的油，被用作脂肪，所述油优选地是植物和/或海洋来源的，优选是植物来源。

海洋来源的脂肪：海洋脂肪可以是动物、植物、细菌和/或可以是藻类(例如微藻类，如下所述)。举例来说，可以提及鱼油，例如鲨鱼肝油和鳕鱼肝油，以及藻类和微藻油如雨生红球藻。

植物来源的油(或更简单地说，“植物油”)：根据本发明特别优选的实施方案，使用植物油，例如橄榄油、菜籽油、大豆油、玉米油、甜杏仁油、和油、银屑油、巴西棕榈油、月桂树油、琉璃苣油、西兰花油、布荔奇果油、琼崖海棠油、山茶油、红花油、黑加仑油、大麻油、椰子油、黄瓜籽油、蔓越莓油、覆盆子油、百香果油、猕猴桃籽油、榛子油、巴西坚果油、乳木果液油、葡萄籽油、杏仁油、芝麻油、米糠油、肉豆蔻籽油、番茄籽油、猴面包树油、月见草油、山茶油、亚麻荠油、牛奶蓟油、葡萄籽油、胡萝卜油、圣约翰麦汁油、亚麻籽油、核桃油、石榴籽油、尼日拉籽油、琉璃苣油、南瓜籽油、紫苏油、绿咖啡豆油、鳄梨油、芙蓉油、摩洛哥坚果油、红花油、玫瑰果油、云莓油、墨西哥(鼠尾草)油。但也是一种油性浸渍的花，如香草、圣约翰草、百合、胡萝卜、贝利、山金车、芦荟、金盏花、刺梨(非穷举清单)。如上所述，在这些植物油中，在本发明实施过程中发现的那些植物油因其特别有趣的美容性质而是优选的，琼崖海棠油(优选初榨的)、覆盆子油(优选初榨的)、山茶油(优选初榨的)、月见草油(优选初榨的)、巴西坚果油(优选初榨的)、猴面包树油(优选初榨的)和橄榄油(优选)；规定前六个是特别优选的。

琼崖海棠油(Calophyllum inophyllum L.；Tamanu)：海棠，被大溪地人称为Tamanu，马达加斯加人称为Fohara，因其对皮肤的有益作用而产生显著的油。它非常芳香，这种油传统上用于治疗许多皮肤病(湿疹、牛皮癣、带状疱疹......)

大量研究表明，琼崖海棠油含有许多具有消毒和保护作用的活性成分，使这种油成为应对皮肤问题的宝贵盟友。

可皂化部分由亚油酸(30-35％)、油酸(30-35％)、棕榈酸(15-20％)、硬脂酸(15-20％)组成。

不皂化部分由以下组成：内叶霉素A：抗菌、消毒作用；苦参碱和叶内醇内酯：强效愈合和皮肤修复；多酚：抗氧化剂和愈合作用，它们对静脉循环也有很强的作用；维生素E：天然抗氧化剂。

猴面包树油(Adansonia digitata)：猴面包树油因其抗过敏和抗炎特性在塞内加尔药典中使用。在化妆品中，这种非常润肤和舒缓的油对干燥、撕裂和干裂的皮肤特别有效。以治疗和再生而闻名，建议用于烧伤护理。可皂化部分由亚油酸(22-26％)、油酸(30-40％)、棕榈酸(20-25％)、硬脂酸(2-6％)组成。不皂化部分由植物甾醇(包括β-谷甾醇)和维生素E组成。

巴西坚果油(Bertholletia excelsa)：巴西坚果或亚马逊坚果来自一种名为Bertholletia excelsa的南美树。是磷脂、生育酚和植物甾醇的植物来源，巴西坚果油为皮肤带来柔软、舒适和弹性，同时起到天然抗氧化剂的作用。

可皂化部分由亚油酸(40-45％)、油酸(Omega-9)(30-35％)、棕榈酸(10-15％)、硬脂酸(5-10％)组成。不皂化部分由以下组成：植物甾醇(包括β-谷甾醇)：它们维持细胞膜的结构和功能并减少炎症；角鲨烯：皮肤表面的主要成分，它们具有润肤和抗氧化特性；生育酚：天然维生素E，强效抗氧化剂，防止脂肪酸的酸败，保护细胞免受自由基的伤害；磷脂：与形成细胞膜的化合物相似的化合物，润肤和保护性质；硒：具有抗氧化特性的微量元素。

月见草油(Oenothera biennis)：月见草油富含亚油酸，是含有γ-亚麻酸的稀有油之一。这些必需脂肪酸，细胞膜的重建者，具有异常的软化、活化、重组和抗皱性能。月见草油还富含维生素E，保护皮肤免于过早衰老。

可皂化部分由亚油酸(70-75％)、γ-亚麻酸(5-10％)、油酸(4-8％)、棕榈酸(4-8％)、硬脂酸(1-4％)组成。

不皂化部分(1.5至2％)由以下组成：植物甾醇：愈合和恢复作用，它们还减轻炎症；三萜：抗自由基作用，它们保护组织免于退化；包括维生素E的甾醇：天然抗氧化剂。

山茶油(Caellia sinensis L.)：山茶油，也称为绿茶油，是从茶树种子中提取的。山茶花的植物油对皮肤具有滋养、保护、软化和保湿的功效。

可皂化部分由亚油酸(5-10％)、油酸(75-80％)、棕榈酸(5-10％)、硬脂酸(1-5％)组成。

不皂化部分(1.5至2％)由以下组成：三萜类；角鲨烷；皂苷以及山奈酚及其糖苷：这些是强的抗炎化合物，如槲皮素。它们有助于保护身体免受炎症引起的损害。

覆盆子油(Rubus idaeus L.)：由于异常含量的必需脂肪酸(Omega-3和Omega-6)，覆盆子油具有治疗功效，还用于缓解瘙痒和湿疹。还已知覆盆子油吸收一些UVA和UVB射线，提供太阳光保护。它富含抗氧化剂和类胡萝卜素，也是日晒护理和晒后修复的理想油。

可皂化部分由亚油酸(50-55％)和α-亚麻酸(30-35％)、油酸(Omega-9)(10-15％)、棕榈酸(0-5％)组成。

不皂化部分由以下组成：维生素E(约5600mg/kg)：天然抗氧化剂；没食子酸：天然抗氧化剂；类胡萝卜素(β-胡萝卜素、叶黄素和隐黄质)：抗自由基作用，它们保护组织免于退化。

橄榄油(Olea europaea L.)：橄榄树因其超长的寿命而闻名千年。它也是世界历史上提到的第一棵树。

通过冷压其果肉而不是其核获得的橄榄油是最富含油酸的油之一。滋养、柔软和润肤，我们在传统的阿勒颇和马赛肥皂的组成中发现橄榄油。

它是一种极好的治疗剂，具有显著浓度的不皂化物(约1至2％)，所述不皂化物提供抗氧化、舒缓和保护性质，抵御天气和阳光的有害影响。在体内，橄榄油具有消化和轻微通便的特性，使其被推荐用于消化紊乱，特别是胃部失调。

可皂化部分由亚油酸(15-20％)、油酸(55-60％)、棕榈酸(15-20％)、硬脂酸(0-5％)组成。

不皂化部分由以下组成：酚类化合物(羟基酪醇)：主要的抗氧化剂；植物甾醇：愈合和恢复作用；角鲨烯：皮肤表面的主要成分，它们具有润肤和抗氧化特性；维生素E(α-生育酚)；叶绿素：天然抗氧化剂。

当用于本发明目的的脂肪是油(优选实施方案)时，该油可以是初榨的或精制的。根据本发明特别优选的实施方案，优选使用至少一种初榨油，优选初榨植物油。实际上，申请人开发的技术平台具有的显著优点是能够获得富含二酰基甘油和/或脂肪醇(化妆品活性成分)的初榨油，优选初榨植物油，而无需利用精制油。

初榨植物油：被称为“初榨”的植物油是纯植物油，仅通过机械方法从水果、种子、籽粒中提取，通常通过栽培植物的第一次冷压(在60℃的最高温度下)。这些油的特征在于其不皂化和可皂化的部分。不皂化部分是残余部分，其不溶于水但在皂化后可溶于有机酸。不皂化脂肪含量通常为0.5至2％。它是一种复杂的混合物，包括甾醇、碳氢化合物(角鲨烯，...)、三萜、脂肪醇(蜡)、脂溶性色素、维生素等。植物油的不皂化部分因其生物学特性而在化妆品中得到应用。油的可皂化部分的特征在于脂肪酸、甘油酯和甘油三酯。脂肪酸有两种类型：饱和脂肪酸、不饱和脂肪酸(单不饱和/MUFA或多不饱和/PUFA)。在本发明的含义内，特别优选使用这些初榨植物油作为脂肪。

精制油：尽管如上所述，在本发明的意义上优选使用初榨油，优选初榨植物油，后者也可以与精制油一起很好地起作用。对于要精制的油，它必须经受热压。在80℃至120℃的温度下进行加压。这产生不能直接食用的原油，必须经过一个长系列的处理以消除不想要的味道和颜色。脱胶步骤涉及通过与酸化水一起搅拌除去造成不稳定性和在油炸过程中产生泡沫和烟雾的物质(游离脂肪酸、磷脂)，所述酸化水将水解并由此分离这些物质。然后用苏打溶液中和味道。然后在90℃下用漂白土漂白并过滤以除去油中的颜料。该方法以使用低压水蒸气除臭以更好地保持油的质量结束。以这种方式，获得了几乎没有味道的透明无臭精制油。这些油的特征仅在于其可皂化部分，不皂化部分通过处理被去除。

申请人已经发现不皂化部分的组分，即甾醇、碳氢化合物(角鲨烯等)、三萜、脂肪醇(蜡)、脂溶性颜料和维生素(非穷尽列表)使得可以增加根据本发明的活化脂肪和含有它们的组合物的生物(美容)活性。这是为什么使用包括这种有价值的不皂化部分的初榨油(优选初榨植物油)对于本发明特别优选的原因之一，构成本发明的技术平台非常适合于富集/活化初榨油。

活化脂肪/活化油：本发明特别旨在获得富含二酰基甘油的脂肪(优选油)，特别是1,2-二酰基甘油；在皮肤应用的情况下，因此富集的脂肪/油中存在的二酰基甘油起到化妆品活性成分的作用。换句话说，富含二酰基甘油的脂肪具有改性的结构和在皮肤水平上增加的生物(美容)活性。这就是为什么因此富集的脂肪/油也被称为活化脂肪/活化油。

蜡：蜡是乙二醇和两种脂肪酸的酯，或脂肪酸和长链醇的单酯。蜡可以是动物来源的，例如蜂蜡；植物来源，例如荷荷巴蜡、巴西棕榈蜡或小烛树蜡；或矿物来源。

脂肪醇是具有长烃链的脂族醇，其在末端位置具有单个羟基官能团。脂肪醇是指式(III)的化合物：

(III)R”–OH

其中R”代表脂肪醇的脂族链。该脂肪醇由包含10至34个碳原子的碳链构成。

根据本发明的一个具体实施方案，脂肪醇具有碳数为12至26的碳链。根据本发明的另一个优选实施方案，脂肪醇在其脂族链上具有16至22个碳原子。

因此，这些脂肪醇优选选自饱和或不饱和的平均尺寸脂族链脂肪醇。

此外，脂肪醇的脂族链，即基团R"，可以是直链或支链碳链，和/或饱和的或不饱和的，不饱和度为1至6。R"基团也可以是单或多羟基化的和/或单或多甲氧基化的和/或单或多氧化的和/或单或多环氧化的链。因此它可以以所有现有的天然形式存在。

这些脂肪醇在蜡中大量存在。这些蜡可以是动物来源的，例如蜂蜡，或植物来源的，例如荷荷巴蜡、巴西棕榈蜡或小烛树蜡，或矿物来源的蜡。

因此，例如，荷荷巴油蜡(缩写为“荷荷巴蜡”，一种构成荷荷巴油的超过96％部分的蜡)的受控水解具有释放其中包含的主要脂肪族脂肪醇的作用，这提供了脂肪醇、饱和或不饱和的直链烃链的混合物。

特别地，荷荷巴油蜡的水解使得可以获得高纯度的在脂族链中具有16-22个碳原子的脂肪醇的混合物。

荷荷巴油蜡是荷荷巴籽(Simmondsia chinensis)中含有的液体蜡，这是一种原产于亚利桑那州南部和加利福尼亚州以及墨西哥西北部的灌木植物。荷荷巴籽的油产量为其重量的约50％。荷荷巴油是具有36至46个碳原子链的蜡类酯的混合物。每个分子由通过酯键连接的脂肪酸和脂肪醇组成。荷荷巴油的特点是存在10％油酸(C_18:1)、70％钆酸(C_20:1)、15％芥酸(C_22:1)、5％神经酸(C_24:1)和相关脂肪醇、十八碳烯醇(C_18:1)、二十碳烯醇(C_20:1)、二十二碳烯醇(C_22:1)和二十四碳烯醇(C_24:1)。因此，荷荷巴蜡的受控水解具有释放其中所含的主要脂肪族脂肪醇的作用，其提供饱和或不饱和的直链脂肪醇的混合物。

因此，例如，荷荷巴蜡(构成荷荷巴油的超过96％部分的蜡)的受控水解具有释放其中包含的主要脂肪族脂肪醇和脂肪酸的作用，使得可以获得富含饱和和不饱和的烃基脂肪醇和脂肪酸的蜡。特别地，通过本发明水解荷荷巴油使得可以获得富含脂肪醇的蜡和具有18-24个碳原子的脂肪酸。因此，这种水解使得可以浓缩所有能够作用于皮肤的活性成分。

根据本发明的脂肪酸和脂肪醇的混合物优选从荷荷巴油(Simmondsiachinensis)中存在的蜡的水解获得。该水解使得该蜡的脂肪醇组分的释放成为可能。该水解可以使用三酰基甘油水解酶进行酶促水解，所述三酰基甘油水解酶的主要活性是水解酯键以释放醇和酸。本发明特别有利的可能性之一是使用与用于水解三酰基甘油的脂肪酶相同的脂肪酶。

优选地，根据本发明，构成缔合的活性成分，即富含二酰基甘油的油和富含脂肪酸和脂肪醇的蜡，将是植物、海洋或动物来源的。

活化蜡：本发明特别旨在获得如上定义的富含脂肪醇的蜡(优选荷荷巴油蜡，缩写为“荷荷巴蜡”)。在皮肤应用的情况下，存在于如此富集的蜡中的脂肪醇有利地与活化的脂肪/油(参见上文)的二酰基甘油组合充当活性化妆品成分。换句话说，富含脂肪醇的蜡具有改性的结构和在皮肤水平上增加的生物(美容)活性。这就是为什么如此富集的蜡也被称为活化蜡的原因。

番木瓜脂肪酶：脂肪酶(三酰基甘油水解酶；EC.3.1.1.3)是可逆酶，其在反应最有利的意义上水解甘油酯。根据它们的不同特异性，这些酶也可分为几类：相对于底物的特异性；位置特异性或立体定向性；相对于脂肪酸性质的特异性或类型选择性；位置特异性或立体特异性。在本发明中，使用sn3型的立体定向脂肪酶。因此，该脂肪酶通过优先形成1-2二酰基甘油来水解甘油三酯。使用的脂肪酶可以是植物来源(例如：番木瓜)或微生物(例如：圆弧青霉)。申请人开发的技术平台基于番木瓜脂肪酶的使用(Villeneuve et al.,JAOCS,72,6:753.1995)。

木瓜(番木瓜)主要生长在世界各地的热带和亚热带地区。木瓜是番木瓜科的一员，属于十字花目。番木瓜乳液因其内肽酶而闻名，内肽酶是半胱氨酸的丰富来源，包括木瓜蛋白酶、木瓜凝乳蛋白酶和番木瓜半胱氨酸蛋白酶。这些蛋白酶可以提取为水溶性乳液蛋白。Giordani等人报道了脂肪酶活性的存在。直到最近，所有溶解来自这种乳液部分的酶活性的尝试都失败了。因此，番木瓜乳液脂酶(CPL)传统上被认为是“天然固定化”生物催化剂。在用水洗涤乳液颗粒并离心后，可以获得含有脂肪酶活性的干粉。在水解过程中和酰基转移反应过程中都研究了番木瓜乳液原料树液的立体定向性和类型选择性。在水解过程中，通过该生物催化剂测定1,3-立体定向活性，优选sn-3立体活性。

在其实验程序中，申请人已经证明了该脂肪酸的脂肪酶的某种类型选择性，本发明在所述实验条件下，将其定向为具有长度为18至20和不饱和度为0至3的长链脂肪酸的三酰基甘油。实际上，先前进行的试验表明，在本发明所用的操作条件下，获得富含1,2-二酰基甘油的油的产率对于主要含有链长为18至20碳的脂肪酸并且具有不饱和度的油(例如橄榄油)，比对于其饱和脂肪酸链长分别为8至10个碳(辛酸/癸酸甘油三酯-

812)、12至16个碳(动物黄油)、16至18个碳(棕榈油)的油，更高。结果总结在下表1中。

表1：使用来自不同脂肪的番木瓜脂肪酶的DAG富集产率的比较

如上所述，申请人开发的技术平台基于番木瓜脂肪酶的使用，更具体地基于其汁液的水不溶性部分的使用。然而，更广泛地，本发明还扩展至通过任何合适的脂肪酶(优选通过sn3型的立体定向脂肪酶，例如植物或微生物来源)富含二酰基甘油的脂肪，有利地富含1,2-二酰基甘油，优选如上定义的式(I)的1,2-二酰基甘油，所述脂肪选自琼崖海棠油(优选初榨)、覆盆子油(优选初榨)、山茶油(优选初榨)、月见草油(优选初榨)、巴西坚果油(优选初榨)和猴面包树油(优选初榨)，所述脂肪是琼崖海棠油(优选初榨)。此外，本发明还扩展至一种组合物，其包含以下，基本上由以下组成或由以下组成：所述富含二酰基甘油的脂肪(有利地为1,2-二酰基甘油，优选如上定义的式(I)的1,2-二酰基甘油)和富含脂肪醇的蜡(优选如上定义的式(III))。

番木瓜汁(又称：“生番木瓜汁”)：木瓜汁是从番木瓜乳液中获得的。通过切割仍然是绿色的水果来收集乳液。对绿色水果进行表面切割以收集与空气接触时固化的白色乳液。它主要由以下组成：蛋白质，包括内肽酶(生木瓜蛋白酶＝木瓜酶、木瓜凝乳蛋白酶、木瓜蛋白酶；木瓜蛋白酶是212个氨基酸的蛋白质，分子量为23000道尔顿)、脂肪酶(番木瓜脂肪酶，英文名称Carica papaya lipase；参见Villeneuve et al.JAOCS,72,6:753.1995)，以及糖和维生素。

附器：附器是表皮的可见保护产品，其特征在于强烈的角质化。头发、牙齿、指甲和毛发都是附器。

皮肤：在本发明的含义内，皮肤在广义上被理解为构成身体涂层的身体组分，并且特别包括头皮(被头发覆盖的头骨的皮肤)。

纯化木瓜汁的表征，更特别是该木瓜汁的水不溶性部分(非水溶性)的表征

当木瓜汁粉悬浮在水中时，表现出分解脂肪活性和蛋白酶活性的酶表现出不同的溶解性：不同于负责脂肪酶活性的酶，蛋白酶是可溶的(Giordani et al.,1991)。该性质使得可以将木瓜汁部分地分离成两个部分(参见下表2)。

表2：木瓜汁分离的研究和表征

木瓜汁的分离的特征在于干物质含量以及所得部分的蛋白质含量，将这些值与木瓜汁的值进行比较。使用的木瓜汁含有18％的水分，其悬浮液在水中为10％，通过离心分离两个部分导致回收得到92％的原始干物质和99.7％最初存在的蛋白质。在这些蛋白质中，88％发现于水溶性部分中，12％发现于水不溶性颗粒部分中(参见上表2)。在第二步中，通过分离方法获得的蛋白质已被更精确地表征。因此，在研究蛋白酶和脂肪酶的酶活性后，可以确定这两个部分中存在的蛋白质的分子量。根据凯氏定氮法测定原汁中以及每个部分中存在的蛋白质的量，并报告于下表3中。然后测量木瓜汁以及水溶性部分和水不溶性部分的蛋白酶活性和分解脂肪活性。

表3：木瓜汁以及水溶性和水不溶性部分的特定酶活性和总酶活性

木瓜汁在水中的悬浮使得可以有效地将最初包含在木瓜汁中的蛋白酶活性与脂肪酶活性分离。实际上，最初存在的约90％的蛋白水解活性和分解脂肪活性分别存在于水溶性部分和水不溶性部分中。

在变性和还原条件下，在12％聚丙烯酰胺凝胶上测定木瓜汁及其水溶性部分和水不溶性部分中存在的蛋白质的分子量。由此获得的电泳图谱显示在图1中。轨迹M对应于分子量标记物(Invitrogen)；轨迹1对应木瓜汁；轨迹2对应于在木瓜汁的水中的部分；轨迹3对应于该木瓜汁的水溶性部分，轨迹4对应于商业上购买的木瓜蛋白酶(Fluka)。

观察到的主要蛋白质的分子量通过与分子量标记物的相关性，用等式log PM＝f(Rf)(Rf＝从蛋白质的迁移距离/从凝胶前面的迁移距离)来确定。

这些分子量如下表4所示。

表4：存在于木瓜汁、不溶性部分和水溶性部分以及商业木瓜蛋白酶中的蛋白质的分子量

木瓜汁有四种分子量分别为18、22、23和35kDa的主要蛋白质。水不溶性部分似乎由分子量为23kDa的单一蛋白质组成。由于分子量为15、18、22、23、28和35kDa的六种蛋白质的水溶性部分，15kDa蛋白质的存在必须归因于在木瓜汁悬浮期间发生的水解。商业木瓜蛋白酶没有分解脂肪活性，由与木瓜汁相同的五种蛋白质形式组成。电泳图谱之间的相似性当然是由于该商业提取物是酶原和/或成熟酶形式的木瓜汁内肽酶的混合物的事实。

基于这些结果，番木瓜脂肪酶似乎具有23kDa的分子量。然而，相同分子量的蛋白质也存在于水溶性部分和商业木瓜蛋白酶中，其中已显示出单一的蛋白酶活性。

通过蛋白质印迹表征

然后通过蛋白质印迹对这些相同样品进行分析，以鉴定对应于木瓜蛋白酶类活性的蛋白质的分子量。

使用的抗体，来源于靶向木瓜蛋白酶的山羊血清的多克隆抗体(Rockland，抗木瓜蛋白酶[番木瓜])，主要显示35kDa的蛋白质。对于分子量为15至28kDa的蛋白质，观察到较弱的信号。

据描述，木瓜蛋白酶的分子量范围为21至23kDa(Azarkan et al.,2003)。使用的抗体明显与木瓜蛋白酶原即具有N末端区域(134个氨基酸)的木瓜蛋白酶的酶原前体结合，其后是由212个氨基酸组成的成熟酶。实际上，该酶原由345个氨基酸组成(Taylor et al.,1999,Azarkan et al.,2003)。

对低强度信号的更精确分析使得可以鉴定不溶性和水不溶性部分以及水溶性部分的22kDa的蛋白质中抗体对分子量为28kDa的蛋白质的不太特异性结合的存在。

对于水不溶性部分，抗木瓜蛋白酶的抗体不与分子量为23kDa的蛋白质结合。这证实了这种蛋白质不是木瓜蛋白酶类的蛋白酶，而是番木瓜的脂肪酶。

通过酶谱凝胶表征

酶谱凝胶技术可以通过标记它们自身的活性来确定蛋白质混合物中多种酶的存在。特定底物预先包括在聚丙烯酰胺凝胶中，形成不同的轨迹并通过相同反应显示的所述多种酶称为同功酶。

考虑实施两种酶谱凝胶(分解脂肪的和蛋白水解的)以确定各种提取物中蛋白酶和番木瓜脂肪酶的存在。

-揭示蛋白酶的酶谱

使用的Novex酪蛋白酶谱凝胶由分离凝胶组成，所述分离凝胶由12％聚丙烯酰胺组成并含有10％酪蛋白，酪蛋白是蛋白酶的潜在底物。该凝胶在非还原条件下产生，以保持酶活性。具有蛋白水解活性的酶将局部水解凝胶酪蛋白。用考马斯蓝染色凝胶后，蛋白质已经被水解的区域在均匀的蓝色背景上以白色突出显示，如图3所示。在该图3中，轨迹1对应于木瓜汁，轨迹2对应于木瓜汁的水不溶性部分，轨迹3对应于木瓜汁的水溶性部分，轨迹4对应于商业购买的木瓜蛋白酶(Fluka)。

对于所分析的所有部分，都观察到酪蛋白的水解，并因此观察到或多或少重要的蛋白酶活性的存在(图3)。观察到两种异构体，异构体2对于水溶性部分和商业木瓜蛋白酶具有更大的强度。

-揭示脂肪酶的酶谱

用于检测脂肪酶活性的酶谱的产生比蛋白酶更复杂。文献描述了由两种凝胶组成的系统，在第一种凝胶中分离蛋白质，第二种凝胶含有底物(Gilbert et al.,1991,Abousalham et al.,2000)。在第一步中，蛋白质在天然条件下在聚丙烯酰胺凝胶上迁移。然后，通过施加由第二聚丙烯酰胺凝胶组成的覆盖层来揭示脂肪酶的存在，所述第二聚丙烯酰胺凝胶含有脂质底物和有色指示剂维多利亚蓝，所述维多利亚蓝的颜色在酸性介质中为蓝色，在碱性介质中为红色(Yadav et al.,1997)。因此，在这种类型的酶谱中，脂肪酶活性的存在通过对应于橄榄油的三酰基甘油的水解区，并因此对应于油酸的产生的蓝色的出现来显示。

两种聚丙烯酰胺凝胶平行实施。用考马斯蓝染色第一对照凝胶(图4A)，使得可以在非变性条件下显示蛋白质的迁移谱。平行地，用含有底物的覆盖层显示第二种酶谱凝胶(参见图4B)。

更具体地，图4A表示在14％聚丙烯酰胺凝胶上非变性条件下的酶谱凝胶，以考马斯蓝显示，图4B表示在非变性条件下在14％聚丙烯酰胺凝胶上的凝胶，通过覆盖由橄榄油和维多利亚蓝(B)组成的凝胶显示。

作为图4A和4B的对象的酶谱凝胶的轨迹是相同的并且对应于：

-轨迹1为木瓜汁，

-轨迹2为木瓜汁的水不溶性部分，

-轨迹3为木瓜汁的水溶性部分，

-轨迹4为商业购买的木瓜蛋白酶(Fluka)，且

-轨迹(M)为分子量标记物。

在非变性条件下，迁移是不精确的，仅观察到两个蛋白质实体。(图4A)。

关于酶谱本身，对于木瓜汁以及其水不溶性部分，观察到对应于油酸产生的凝胶的蓝色着色。分解脂肪活性仅存在于这些部分中。

商业木瓜蛋白酶没有脂肪酶活性。因此，该提取物中存在的23kDa蛋白质不对应于脂肪酶，正如对各种部分的酶活性的研究所显示的(参见上面的图2)。

该酶谱研究使得可以揭示蛋白水解活性和分解脂肪活性，已证实木瓜内肽酶是在所研究的提取物中具有显著蛋白水解酶活性的一组蛋白质。

该研究还表明，只有木瓜汁及其水不溶性部分具有与分子量接近23kDa的蛋白质结合的分解脂肪活性。

GPC(气相色谱)方法用于定量1,2-二酰基甘油

使用内标1,3-二棕榈酸甘油酯(1,3-dipalmitine)通过气相色谱进行测定。分析在非极性毛细管柱(HP5(30m x 0.25mm x 0.25mm)上进行，使用

软件控制的，并配有火焰离子化检测器和自动进样器的Agilent 7890气相色谱仪。

载气为氦气(1.0ml/min)，将进样器和检测器加热至330℃，将烤炉程序设定在等温线上325℃下30分钟。注入的样品体积为1μl。在这些条件下，甘油1,3-二棕榈酸酯的保留时间为13分钟。各种二酰基甘油的保留时间通过使用标准物、先前的文献研究以及通过气相色谱与质谱联用进行的初步分析来确定。

响应系数的确定，工作假设是所有1,2-二酰基甘油具有与1,2-二油酸甘油酯相同的响应系数，1,2-二油酸甘油酯用作参考分子。

标准溶液：通过精确称量以下质量，准备以下四种溶液：

表5-标准溶液的制备

在我们的分析条件下，1,2-二油酸甘油酯的响应系数为1.2315(CV为1.63％)。

然后如下分析富集油：

表6–富集油分析

然后如下测定溶液中所含的1,2-二酰基甘油的量：计算溶液中所含的1,2-二油酸甘油酯的质量：

m(Ech)＝[α(Ech)×A(Ech)×m(SI)]/A(SI)

其中:m＝质量(mg)

A＝峰下面积

α＝响应系数

Ech＝样品(1,2-二酰基甘油)

SI＝内标(1,3-二棕榈酸甘油酯)

或者：

M(1,2-二酰基甘油)＝[1,2315×ΣA(1,2-二酰基甘油)×m(1,3-二棕榈酸甘油酯)]/A(1,3-二棕榈酸甘油酯)

含量的计算：

含量(％)＝[m(1,2-二酰基甘油)/m(富集油)])×100

实施例1-获得番木瓜汁的水不溶性部分的方法，其富含番木瓜脂肪酶

富含脂肪酶的番木瓜提取物通过制备100g生木瓜汁粉在900g蒸馏水中的悬浮液而获得。因此，生木瓜汁粉是包含悬浮颗粒和水溶性部分的双相悬浮液。

用锚式搅拌器以500转/分钟(rpm)的速度在室温下搅拌该混合物2小时。

通过使用离心机例如板式离心机在200升/小时的流速下离心混合物30分钟，从而将木瓜汁的水不溶性(非水溶性)部分(如上所述)与可溶性部分分离。

离心颗粒具有目标部分，即生木瓜汁的水不溶性部分。

由此获得20g干重为25％的颗粒部分。

实施例2-制备活化的富含1,2-二酰基甘油的油的方法

在两个单独的步骤中制备混合物，然后通过简单混合将这两种方法的产物以适当的比例混合在一起。

富含1,2-二酰基甘油的油是由初榨的琼崖海棠油或覆盆子油或猴面包树油或月见草油或巴西坚果油或山茶油(因为在本发明的含义内，它们在被活化时提供优异的皮肤美容性质)和占油体积的0.5至50％，优选1-40％的量的水或含有二价离子(如钙或镁离子)的盐溶液制备的。在恒温控制的罐中，将该混合物保持在30至70℃的温度，优选在50℃的温度。使用定子转子型设备将该混合物保持在搅拌下，以允许形成油和水之间的乳液。

然后在给定体积的通过实施实施例1的方法获得的富含番木瓜脂肪酶的番木瓜汁的水不溶性部分存在下，将该混合物保持在搅拌下，番木瓜汁的水不溶性部分/所用脂肪的体积比为约0.01至约0.2，有利地约0.05至0.015，优选为约0.1。

将搅拌和温度保持1至6小时(优选4小时)，也就是说时间足以使形成的二酰基甘油的量最大化。

通过确定常规脂肪工业指标(酸度指数NF EN ISO 660和过氧化物指数NF ISO3976的测量)和使用色谱方法，特别是用于定性和定量二酰基甘油含量的气相色谱法来进行反应的监测。

然后通过物理化学纯化技术来纯化反应介质，目的是获得富有光泽的、无气味的富含1,2-二酰基甘油的油，其颜色最接近最初用于反应的油。

首先将反应介质通过一系列孔隙率降低(500至250μm)的纤维素过滤器过滤。这首先使乳液分解，其次使介质澄清。

然后用无水硫酸镁干燥剂除去残留的水。然后借助于活性炭(优选CN1型

活性炭)将由此获得的油除臭并使其有光泽。

由此获得的油的特征不仅具有本发明所述方法中固有的共同部分，还具有所用油性质固有的特定特征。反应介质主要由未加工的甘油三酯、甘油单酯和1,2-和1,3-型二酰基甘油组成。

这些油的特征通常在于酸度指数为15至50，过氧化物指数为5至30，且1,2-二酰基甘油的比率为5至30％。

获得的二酰基甘油的性质基于最初存在于油中的三酰基甘油。

下面的表7和表8可以比较以下油的酸度指数、过氧化物指数和1,2-二酰基甘油和1,3-二酰基甘油的含量：

-在本发明的意义上特别优选的六种初榨油，与

-相同的六种富含1,2-二酰基甘油的初榨油。

表7-六种优选的初榨油的酸度指数、过氧化物指数和1，2-二酰基甘油和1，3-二酰基甘油含量

表8-1,2 DAG富集后六种优选的初榨油的酸度指数、过氧化物指数和1,2-二酰基甘油和1,3-二酰基甘油含量

此外，通过对上述制备方法进行必要的修正实施，即通过使用蜡代替油并获得富含脂肪醇的蜡，来制备富含液体脂肪醇的蜡。为了完整起见，这种方法描述如下：

首先，使用定子转子型搅拌器，通过将所述蜡与占蜡体积的0.5至50％，优选1至40％的一定量的水或含有二价离子如钙或镁离子的盐溶液混合，没有改变pH，从而将荷荷巴蜡乳化。在恒温控制的罐中，该混合物保持在30至70℃的温度，优选在50℃的温度。使用定子转子型设备将该混合物保持在搅拌下，以允许形成在蜡和水之间稳定的乳液。

然后在给定体积的通过实施实施例1的方法获得的富含番木瓜脂肪酶的番木瓜汁的水不溶性部分存在下，将该混合物保持在搅拌下，番木瓜汁的水不溶性部分/使用的脂肪的体积比为约0.01至约0.2，有利地为约0.05至0.015，优选约0.1。

将搅拌和温度保持1至6小时(优选6小时)，也就是说时间足以使形成的脂肪醇的量最大化。

首先将反应介质过滤通过一系列孔隙率降低(500至250μm)的纤维素过滤器。这首先使乳液分解，其次使介质澄清。

活性炭)将由此获得的蜡除臭并使其有光泽。

通过测量酸度指数NF EN ISO 660并通过使用色谱方法，特别是通过气相色谱法进行反应产物，这使得可以鉴定和定量脂肪酸和脂肪醇的含量。

所得产物的特征优选在于脂肪醇含量为2至4％，以及酸度指数为5mg/g蜡。

在本发明的一个具体实施方案中，该组合物对应于富含1,2-二酰基甘油的油(活化油)或几种富含1,2-二酰基甘油的油(活化油)的混合物。

在本发明的一个具体实施方案中，该组合物对应于富含脂肪醇的液体蜡(活化蜡)或几种富含脂肪醇的液体蜡(活化蜡)的混合物。

在一个优选的实施方案中，通过将富含1,2-二酰基甘油的油(活化油)和富含脂肪醇的液体蜡(活化蜡)以100至90％的浓缩油和0-10％富集的液体蜡的重量比简单地混合，来获得本发明的组合物。

实施例3包含活性油的化妆品配制品

3.1-眼部轮廓凝胶

表9-根据本发明的“眼部轮廓”凝胶的组成

属性：

外观：光滑、半透明的凝胶

pH:5.50–6.0

粘性(D0) 15000-25000(Brookfield RVT/Spindle B/5RPM/1分钟/25℃)

该配制品在实验室中经历了为期3个月的加速稳定性试验。通过28天的双重功效测试验证了该配制品的保存。然而，防腐剂尚未优化至其最低效率水平。

3.2-双相面部精华素

表10-根据本发明的双相面部精华素的组成

属性：

外观:绿色和深蓝色双相液体-使用前摇匀

pH:5.0–6.0

粘性(D0) 不详

实施例4-在根据本发明的不同活化油存在下离体人体皮肤中细胞角蛋白表达的研究

4.1-细胞角蛋白介绍

细胞角蛋白是中间丝蛋白，其与其它蛋白质一起形成细胞的细胞骨架。它们具有许多功能，包括维持上皮结构、保护免受损伤以及与其它细胞质成分的通讯(Fuertes L.etal.,2013)。

它们成对表达，根据它们的位置具有不同的表达谱，并且根据它们的分子量和等电点在数字上从1到20排列。细胞角蛋白分为两组(Fuertes L.et al.,2013)：

-I型细胞角蛋白，其为酸并且通常对应于具有低分子量的细胞角蛋白，

-II型细胞角蛋白，其是碱性的并且通常具有高分子量。

在表皮分化过程中，基底层的角质形成细胞失去其增殖潜能，迁移到上层，角蛋白5和14的表达被中断，而角蛋白1和10的表达增加(Paladini RD et al.,1999)。

4.2-研究目的

该研究的目的是确定通过实施实施例2的方法获得的根据本发明的各种活化油/活化蜡混合物对离体人体皮肤中细胞角蛋白表达的影响。

4.3-测试的油

测试的不同油是：

通过实施例2的方法获得的活化的琼崖海棠油(琼崖海棠)/活化的荷荷巴蜡混合物(在实施例4的其余部分中缩写为“活化的琼崖海棠油”)，相对于天然的初榨的琼崖海棠油，

通过实施例2的方法获得的活化的猴面包树油/活化的荷荷巴蜡混合物(在实施例4的其余部分中缩写为“活化的猴面包树油”)，相对于天然的初榨猴面包油，

通过实施例2的方法获得的活化的覆盆子油/活化的荷荷巴蜡混合物(在实施例4的其余部分中缩写为“活化的覆盆子油”)，相对于天然初榨的覆盆子油，

通过实施例2的方法获得的活化月见草油/活化的荷荷巴蜡混合物(在实施例4的其余部分中缩写为“活化的月见草油”)，相对于天然初榨月见草油。

4.3-程序

直径6mm的人体皮肤样品在空气/液体界面中培养。将活化油在相应的非活化油中稀释至0.5％。将20μL油局部施用于皮肤样品(仅一次施用)，然后将这些活组织检查物在37℃下培养24小时。在培养结束时，人体皮肤样品包括在最佳切割温度(OCT)凝胶中。OCT在与冷(液氮)接触时固化。含有皮肤样品的这些块储存在-20℃。

然后取6μm厚的切片。然后将这些皮肤样品切片在37℃下烘箱干燥，然后用丙酮固定(预冷至-20℃)。

使用全细胞角蛋白特异性小鼠单克隆抗体(Abcam，Ref.ab27988)，然后用荧光染料偶联的抗小鼠二级抗体(Invitrogen，Ref A21202)进行免疫标记，然后在落射荧光显微镜(Zeiss Axiovert 200M)下检查皮肤样品的切片。使用Volocity软件从所获得的照片中定量荧光。

4.4-结果

显微镜观察显示，与相应的非活化油相比，用活化的琼崖海棠油、活化的猴面包油、活化的覆盆子油和活化的月见草油处理的活组织检查的表皮中的荧光显著更强。获得的数据如下表11-14所示。

表11-活化的琼崖海棠油对比初榨琼崖海棠油的细胞角蛋白表达(％)

表12-活化的猴面包树油对比初榨猴面包树油的细胞角蛋白表达(％)

表13-活化的覆盆子油对比初榨覆盆子油的细胞角蛋白表达(％)

表14-活化的月见草油对比初榨月见草油的细胞角蛋白表达(％)

相对于相应的非活化油进行统计学分析(平均值±标准误，n＝8，***：使用Student t检验非常显著)。

为了突出在活化油和相应的初榨油之间观察到的表达差异，将获得的数据绘制在图5中所示的图表上。

4.5-结论

通过活化的琼崖海棠油、活化的猴面包树油、活化的覆盆子油和活化的月见草油，离体人体皮肤中细胞角蛋白的表达增加。因此，这些活化油刺激表皮分化，因此具有令人感兴趣的美容性质。

4.6-参考文献

Fuertes L.,Santonja C.,Kutzner H.and Requena L.Immunohistochemistryin Dermatopathology:a review of the most commonly used antibodies(Part I).Actas Dermo-Sifiliográficas.104(2):99-127(2013)

Paladini R.D.and Coulombe P.A.The functional diversity of epidermalkeratins revealed by the partial rescue of the keratin 14null phenotype bykeratin 16.The Journal of Cell Biology.146(5):1185-1201(1999)

Claims

1.富含番木瓜脂肪酶的番木瓜汁的水不溶性部分用于使脂肪富含二酰基甘油和/或使蜡富含脂肪醇的用途，所述富含番木瓜脂肪酶的番木瓜汁的水不溶性部分是通过包括以下步骤的方法获得的：

a)将番木瓜汁粉悬浮在蒸馏水中，其中番木瓜汁粉/蒸馏水的重量比为0.01至0.5，

b)在5分钟至90分钟的时间段内以2000至6000rpm的转速离心分离步骤a)中获得的悬浮液，以获得含有所述番木瓜汁的水不溶性部分的颗粒，

c)回收含有所述富含番木瓜脂肪酶的番木瓜汁的水不溶性部分的所述颗粒，

所述方法在步骤a)之后和步骤b)之前包括以下步骤：

a’)在10℃至30℃的温度下，在15分钟至240分钟的时间段内搅拌步骤a)中获得的悬浮液，

所述方法在步骤b)之后和步骤c)之前包括以下步骤：

b')干燥湿颗粒直至获得颗粒状粉末；

所述富含番木瓜脂肪酶的番木瓜汁的水不溶性部分在步骤c)中以颗粒状粉末的形式回收。

2.制备富含二酰基甘油的脂肪的方法，其包括以下步骤：

i)将脂肪与水或与含有钙或镁离子作为二价离子的盐溶液混合，水或盐溶液/脂肪的体积比为0.005至0.5，

ii)在1至30分钟的时间段内将该混合物保持在搅拌下和30℃至70℃的温度下，直至获得在脂肪和水之间的乳液，

iii)仍然在搅拌和所述温度下，使前一步骤中获得的所述混合物与给定体积的权利要求1 的番木瓜汁的水不溶性部分接触，番木瓜汁的水不溶性部分/所用脂肪的体积比为0.01至0.2，

iv)保持所述温度和搅拌一段时间以获得所述富含二酰基甘油的脂肪，所述时间为1至6小时，

v)过滤步骤iv)中获得的混合物，使用至少一个梯度过滤器或至少两个孔隙率由约500μm至约250μm降低的过滤器的至少一种叠加，以从含有所述富含二酰基甘油的脂肪的反应介质中分离所述富含番木瓜脂肪酶的番木瓜汁的水不溶性部分，

其中，在步骤v)之后进行以下两个步骤中的至少一个：

-通过无水硫酸镁作为干燥剂除去存在于含有所述富含二酰基甘油的脂肪的反应介质中的残留水，和/或

3.根据权利要求2所述的方法，其中所述脂肪是动物、植物和/或海洋来源的油，初榨的或精制的。

4.根据权利要求2所述的方法，其中所述脂肪是包含甘油三酯的油，所述甘油三酯具有：

-碳数为12至26的脂肪酸的脂族烃链，所述脂族烃链是直链或支链的；饱和或不饱和的，不饱和度为1至6；或者

5.根据权利要求2所述的方法，其中所述脂肪是初榨油，选自琼崖海棠油、覆盆子油、山茶油、月见草油、巴西坚果油、猴面包树油和橄榄油，或这些油中至少两种的混合物。

6.根据权利要求2所述的方法，其中所述二酰基甘油由分别由下式(I)和(II)表示的1,2-二酰基甘油和1,3-二酰基甘油组成：

其中R₁和R₂是：

-碳原子数为12至26的脂肪酸的脂族烃链，所述脂族烃链是直链或支链的；饱和或不饱和的，不饱和度为1至6；或

7.根据权利要求2的方法，其中所述二酰基甘油主要包含以下通式(I)表示的1,2-二酰基甘油：

其中R₁和R₂是：

8.制备富含脂肪醇的蜡的方法，所述方法实施根据权利要求2所述的方法，其中蜡被用作脂肪，并且代替富含二酰基甘油的脂肪，获得富含脂肪醇的蜡，其中所述脂肪醇为式(III)的脂肪醇：

(III)R”–OH

其中R”代表：

-含有10至34个碳原子的脂肪醇的脂族烃链，所述脂族烃链是直链或支链的；饱和或不饱和的，不饱和度为最多6；或者

9.根据权利要求8所述的方法，其中所述蜡选自：

-动物来源的蜡，

-矿物来源的蜡，

-植物来源的蜡，

-或其混合物。

10.通过根据权利要求2所述的方法获得的富含二酰基甘油的脂肪。

11.根据权利要求10所述的富含二酰基甘油的脂肪，所述脂肪具有的二酰基甘油含量为5％至30％，酸度指数为15至50mg/g，以及过氧化物指数为5至30mg/g。

12.通过根据权利要求8或9所述的方法获得的富含脂肪醇的蜡。

13.组合物，其包含至少一种根据权利要求10或11所述的富含二酰基甘油的脂肪和至少一种根据权利要求12所述的富含脂肪醇的蜡的共混物。

14.有效量的至少一种根据权利要求10或11所述的富含二酰基甘油的脂肪，至少一种根据权利要求12所述的富含脂肪醇的蜡，或根据权利要求13所述的组合物用于制备组合物的用途，所述组合物以通过皮肤施用以在健康的人类个体或动物中：

-延迟皮肤老化的出现或限制皮肤老化的迹象，和/或

-保护皮肤和/或其附器免受各种外部侵害，和/或

-促进表皮分化，和/或

-加强皮肤和/或其附器的屏障功能。

15.根据权利要求1所述的用途，其中在步骤a)中将番木瓜汁粉悬浮在蒸馏水中，其中番木瓜汁粉/蒸馏水的重量比为0.08至0.2。

16.根据权利要求1所述的用途，其中在步骤a)中将番木瓜汁粉悬浮在蒸馏水中，其中番木瓜汁粉/蒸馏水的重量比为0.1。

17.根据权利要求2所述的方法，其中在步骤i)中水或盐溶液/脂肪的体积比为0.01至0.4。

18.根据权利要求13所述的组合物，其中富含脂肪醇的蜡/富含二酰基甘油的脂肪的重量比为0.01至0.11。

19.根据权利要求8所述的方法，其中所述蜡是植物来源的蜡，是荷荷巴蜡。