CN109548430B - 一种兰科植物种子球粒的制作方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种兰科植物种子球粒的制备方法，包括如下步骤：1)内核制作：将凝胶、活性炭以及植物根系生长所需营养和/或激素用水溶解，高压灭菌得溶胶，冷却，在无菌条件下加入释氧剂，混匀，将溶胶逐滴滴入氯化钙无菌溶液，静置至颗粒硬化；(2)外壳制作；(3)搅动使种子均匀悬浮在溶胶中，将内核投入外壳溶胶，搅动，逐个镊取表面沾附溶胶和种子的内核投入氯化钙无菌溶液，静置，硬化成外壳，得到表面附着多粒兰科植物种子的球粒。本发明工艺简单，费用低廉。
Description
技术领域
本发明涉及一种兰科植物种子球粒制作方法。
背景技术
大部分兰科植物具有较高的观赏、药用等价值，其果实含成千上万粒种子,种子细小或粉状。在无菌条件下把种子撒播在培养基表面，种子萌发膨大成原球茎或根状茎，随后长叶生根，这种无菌播种(非共生萌发)方法是兰科植物育苗的主要手段之一，在春兰、蕙兰、墨兰、大花蕙兰、蝴蝶兰、铁皮石斛、白芨等均有不少报道。兰科植物种子萌发和根系生长的条件并不完全相同。目前采用的无菌播种方法，种子萌发至长叶生根才换瓶转接到新培养基，无法针对萌发和长根阶段的特定需求调节培养基成分。利用种子育苗的另一种方式是用人工种皮包埋由种子萌发的原球茎，固化成人工种子(如申请号：201610547741.0、201210382702.1、201610051914.X、201110284493.2等)，与无菌播种获得幼苗均在培养瓶内进行相比，颗粒化的人工种子方便贮存、运输，并可实现机械化播种，可望在有菌条件下长叶生根成苗。但与其他植物人工种子一样，包埋的繁殖体原球茎并非处于休眠期，而是很快出芽长根，所以在常温下人工种子的贮存和运输时间都不长。
兰科植物种子十分细小，按传统方法一颗人工种子包埋一粒种子(繁殖体)十分困难，而且并非每粒天然种子都有活力，萌发率因品种差异较大，所以一颗人工种子包埋多粒天然种子才能保证每个颗粒都有天然种子正常萌发。目前人工种子的包埋方法以水凝胶海藻酸钠包被技术最常用，海藻酸盐胶囊通气性差，抑制体细胞胚呼吸，降低体细胞胚寿命(孙敬三，桂耀林主编.植物细胞工程实验技术.北京:科学出版社，1990:233.)，将非常细小脆弱的天然种子包埋在海藻酸钠胚乳颗粒中，显然会因氧气供给不足而影响呼吸代谢。
发明内容
本发明的主要目的在于提供一种兰科植物种子球粒及其制作方法。
本发明解决其技术问题的所采用的技术方案是：
一种兰科植物种子球粒的制备方法，包括如下步骤：
1)内核制作：将凝胶、活性炭以及植物根系生长所需营养和/或激素用水溶解，高压灭菌得溶胶，冷却，在无菌条件下加入释氧剂，混匀，将溶胶，滴入氯化钙无菌溶液，静置10-40 分钟，至颗粒硬化；
(2)外壳制作方法：将凝胶、胶黏剂、种子及附加成分的外壳胶液用水溶解，高压灭菌得外壳溶胶；
(3)兰科植物果实水洗净，杀毒；在无菌条件刨开果实，取出种子投入外壳溶胶，每升溶胶投入种子0.1-0.4克，把内核倒入溶胶，搅动使种子均匀悬浮在溶胶中，将表面沾附溶胶和种子的内核投入氯化钙无菌溶液，静置10-40分钟，硬化成外壳，得到表面附着多粒兰科植物种子的球粒。
植物根系生长所需营养和/或激素,或是种子萌发所需营养和激素，具体依据每种兰科植物需求而定。
优选地，所述的植物根系生长所需营养为低盐培养基，所述的低盐培养基，包括1/2MS 培养基、White培养基或B5培养基中的一种。激素为生长素NAA或IBA或其混合，浓度0.1-0.4mg/L溶胶。
进一步优选，所述的植物根系生长所需营养和/或激素为1/2MS培养基，以及激素浓度 NAA 0.1-0.4mg/L溶胶。
优选地，所述的内核直径0.3-0.5cm。
优选地，凝胶为海藻酸钠，使用浓度3-5％。
优选地，所述释氧剂为过氧化氢、过硫酸铵、过氧化尿素、过碳酸钠中的至少一种。
优选地，活性炭含量为0.1-0.2％。
优选地，所述胶黏剂为魔芋胶、瓜尔豆胶、阿拉伯胶的至少一种。
优选地，步骤1)混匀后，调pH5-6。步骤2)溶解后，调pH5-6。
本发明还提供一种兰科植物种子球粒，它包括内核和外壳，其中，所述的内核直径0.1-1cm，含凝胶、释氧剂0.01-1％、活性炭0.05-0.5％以及植物根系生长所需营养和/或激素：
外壳含凝胶、胶黏剂、种子及附加成分的外壳胶液，所述的附加成分包含种子萌发所需营养和激素。
本发明制作的球粒含内核和外壳两层，种子播种在外壳，外壳接触空气，供氧充分，种子可正常萌发。(2)种子在外层萌发，根系插进内核生长，内核附加成分和外壳附加成分不同，达到分别有益种子萌发和根系生长的目的。(3)颗粒内部的内核因氧气不足而影响呼吸代谢，本发明内核附加成分含释氧剂，可逐渐释放氧气供内部根系呼吸，有利根系伸展。如果释氧剂含量小于0.01％，则释放的氧气不足，不利于根系生长，如果大于1％，则可能会对种子有毒害作用；(4)内核附加黑色的活性炭有遮光作用，有利根系生长，活性炭含量如果少于 0.05％，则遮光效果不佳，如果大于0.5，则过多吸附内核营养成分和激素,根系营养吸收不良,而且影响胶凝剂的固化性能。(5)为了使外壳溶胶易于沾附在内核表面，本发明的外壳溶胶包含天然胶黏剂。
本发明综合无菌播种和人工种子的特点，有益效果(1)本发明天然种子播种在球粒表面萌发成原球茎并出叶长根，省去人工培育原球茎(才应用于制作人工种子)步骤，节省大量培养基成本；(2)一般的兰科植物人工种子只包埋一粒原球茎，该原球茎一旦死亡，则整粒人工种子都不萌发而作废。本发明每粒附着一定量天然种子，这样(大田)播种时每粒都有种子萌发，所以萌发率可能较常规人工种子高，降低了育苗用种成本；(3)球粒表面的种子要经历吸涨膨大发育成原球茎，不是马上出叶长根，所以较常规人工种子，本发明球粒有较长的常温保存运输时间。本发明制作工艺简单、成本低廉，使用方便，可推广应用。
附图说明
下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
图1至图3为实施例1铁皮石斛种子球粒的实物图，其中：
图1为球粒内核；
图2为表面粘附铁皮石斛种子的球粒；
图3为每粒铁皮石斛种子球粒都能萌发
图4和图5为实施例2白芨种子球粒的实物图，其中：
图4为每粒白芨种子球粒都能萌发
图5为白芨种子球粒萌发的幼苗。
具体实施方式
本发明采用的技术方案是：
(1)内核制作方法：所述的胶凝剂为海藻酸钠，使用浓度3-5％。所述的营养成分为低无机盐的1/2MS等培养基，激素浓度NAA 0.1-0.4mg/L内核溶胶，活性炭0.1-0.2％，上述成分高压灭菌(121℃，持续20-30分钟)得溶胶，冷却，在无菌条件下加入释氧剂，浓度0.03-0.3％，混匀，调pH约5.6，用吸管吸取少量溶胶，滴入2％氯化钙无菌溶液，静置10-40分钟，颗粒硬化，无菌水荡洗两次成内核。
(2)外壳制作方法：所述的胶凝剂为海藻酸钠，使用浓度3-5％，天然胶黏剂为瓜尔豆胶魔芋胶、阿拉伯胶的至少一种，使用浓度0.3-1.0％，所述的营养成分为种子培养常用的MS、 Nistch、N6等培养基，含大量元素、微量元素、有机物(氨基酸、维生素、糖等)，细胞分裂素浓度0-0.8mg/L溶胶，调pH约5.8，高压灭菌(121℃，持续20-30分钟)得外壳溶胶，在无菌条件倒入宽口径低矮容器备用。
兰科植物果实水洗净，浸泡在70-75％酒精瞬间杀菌，随后浸泡10％次氯酸钙溶液15-30 分钟，无菌水冲洗2次。在无菌条件刨开果实，取出种子投入外壳溶胶，每升溶胶投入种子 0.1-0.4克，把内核倒入溶胶，搅动使种子均匀悬浮在溶胶中，逐个镊取表面沾附溶胶和种子的内核投入2％氯化钙无菌溶液，静置10-40分钟，硬化成外壳，无菌水荡洗两次，得到表面附着多粒兰科植物种子的球粒。制作过程间隔一定时间搅动外壳溶胶，以保持种子较均匀悬浮在外壳溶胶中。
实施例1
(1)内核制作方法：海藻酸钠浓度4％。营养成分为大量元素减半的1/2MS培养基，NAA 0.2mg/L溶胶，活性炭0.1％，上述成分高压灭菌得溶胶，冷却，在无菌条件下加入过氧化氢，浓度0.15％，混匀，调pH约5.6，用吸管吸取少量溶胶，滴入2％氯化钙无菌溶液，静置20 分钟，颗粒硬化，直径约0.4cm，无菌水荡洗两次成内核。
(2)外壳制作方法：海藻酸钠浓度4％，胶黏剂魔芋胶0.8％，营养成分为MS培养基成分，细胞分裂素浓度0.5mg/L溶胶，调pH约5.8，加盖高压灭菌得溶胶，在超净台倒入培养皿成一薄层。
铁皮石斛(Dendrobium officinale)果实水洗净，在超净工作台用75％酒精浸泡瞬间杀菌，随后浸泡10％次氯酸钙溶液20分钟，无菌水冲洗2次。刨开果实，取出种子投入外壳溶胶，每升溶胶投入种子0.2克，把内核倒入溶胶，搅动使种子均匀悬浮在溶胶中，逐个镊取表面沾附溶胶和种子的内核投入2％氯化钙无菌溶液，静置20分钟，硬化成外壳，无菌水荡洗两次，得到表面附着多粒铁皮石斛种子的球粒。制作过程间隔一定时间搅动外壳溶胶，以保持种子较均匀悬浮在外壳溶胶中。
铁皮石斛种子球粒在瓶内无菌培养，常规温度、光照，30天后芽点突破种皮，每个种子球粒都有发芽，每粒能萌发3芽或更多，几乎都能继续长叶生根成嫩苗。包埋铁皮石斛原球茎的常规人工种子，约10天就可抽芽突破种皮，所以，种子球粒可较常规人工种子常温下多贮存约 20天。
实施例2
(1)内核制作方法：海藻酸钠浓度3％。营养成分为大量元素减半的1/2MS培养基，NAA 0.1mg/L溶胶，活性炭0.1％，上述成分高压灭菌得溶胶，冷却，在无菌条件下加入过硫酸铵，浓度0.2％，混匀，调pH约5.6，用吸管吸取少量溶胶，滴入2％氯化钙无菌溶液，静置25分钟，颗粒硬化，直径约0.4cm，无菌水荡洗两次成内核。
(2)外壳制作方法：海藻酸钠浓度3％，胶黏剂瓜尔豆胶胶1.0％，营养成分为MS培养基成分，调pH约5.8，加盖高压灭菌得溶胶，在超净台倒入培养皿成一薄层。
白芨(Bletilla striata)果实水洗净，在超净工作台用75％酒精浸泡瞬间杀菌，随后浸泡10％次氯酸钙溶液20分钟，无菌水冲洗2次。刨开果实，取出种子投入外壳溶胶，每升溶胶投入种子0.3克，把内核倒入溶胶，搅动使种子均匀悬浮在溶胶中，逐个镊取表面沾附溶胶和种子的内核投入2％氯化钙无菌溶液，静置15分钟，硬化成外壳，无菌水荡洗两次，得到表面附着多粒白芨种子的球粒。制作过程间隔一定时间搅动外壳溶胶，以保持种子较均匀悬浮在外壳溶胶中。
白芨种子球粒在瓶内无菌培养，常规温度、光照，35天后绿色芽点突破种皮，每个种子球粒都有发芽，每粒能萌发3芽或更多，几乎都能继续长叶生根成嫩苗。包埋白芨原球茎的常规人工种子，约10天就可抽芽突破种皮，所以，新型人工种子可较常规人工种子常温下多贮存约 25天。
Claims (2)
1.一种兰科植物种子球粒的制备方法，包括如下步骤：
1)内核制作：将凝胶、活性炭以及植物根系生长所需营养和激素用水溶解，高压灭菌得溶胶，冷却后加入释氧剂，将溶胶滴入氯化钙无菌溶液，静置，至颗粒硬化；所述的凝胶为海藻酸钠，使用浓度3-5％；所述的营养成分为1/2MS培养基，激素为NAA，激素浓度为0.1-0.4mg/L内核溶胶；活性炭0.1-0.2％，上述成分高压灭菌得溶胶，冷却，在无菌条件下加入释氧剂，浓度0.03-0.3％，混匀，调pH5.6，用吸管吸取少量溶胶，滴入2％氯化钙无菌溶液，静置10-40分钟，颗粒硬化，无菌水荡洗两次成内核；所述释氧剂为过氧化氢、过硫酸铵、过氧化尿素、过碳酸钠中的至少一种；
(2)外壳制作方法：将含凝胶、胶黏剂、附加成分的外壳胶液高压灭菌得外壳溶胶，所述附加成份包括营养成分和细胞分裂素；所述的凝胶为海藻酸钠，使用浓度3-5％，胶黏剂为瓜尔豆胶、魔芋胶、阿拉伯胶中的至少一种，使用浓度0.3-1.0％，所述的营养成分为种子培养常用的MS、Nistch或N6培养基，细胞分裂素浓度为0-0.8mg/L溶胶，调pH5.8，高压灭菌得外壳溶胶，在无菌条件倒入宽口径低矮容器备用；
(3)兰科植物种子投入外壳溶胶，每升溶胶投入种子0.1-0.4克，把内核倒入溶胶，搅动使种子均匀悬浮在溶胶中，将表面沾附溶胶和种子的内核投入氯化钙无菌溶液，硬化成外壳，得到外壳含有多粒兰科植物种子的球粒。
2.根据权利要求1所述的一种兰科植物种子球粒的制备方法，其特征在于：所述的内核直径0.3-0.5cm。
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