CN109545276A - 一种基于表观基因组的药物发现方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种基于表观基因组的药物发现方法及其应用，属于生物医药技术领域。本发明从药物作用的基本原理出发，结合病人样本的DNA甲基化芯片数据和基因间相互作用网络，使用修订的PageRank算法来挖掘疾病发病过程中的关键致病基因，从而根据药物靶标对应关系，寻找潜在治疗疾病的药物。该方法具有理论基础扎实、易于实现、效率高的特点，在药物发现中具有广泛的应用前景。

Description

一种基于表观基因组的药物发现方法及其应用

技术领域

本发明涉及一种基于表观基因组的药物发现方法及其应用，属于生物医药技术领域。

背景技术

药物研究与开发是一项周期长、耗资大、风险高、竞争激烈、利润高的过程。据统计，一个新药从概念产生、实验室先导化合物的确定、优化、临床试验到最终上市，需要花费10-15年的时间，研发费用高达8亿美元以上(DiMasi,J.A.,Hansen,R.W.,and Grabowski,H.G.(2003).The price of innovation：new estimates of drug developmentcosts.J.Health Econ.22:151-185.)，并且这个费用仍在逐年增长。然而，如此巨大的投资却没有获得相应的回报。1996年FDA批准上市的药物有53个，2007年却降到15个，创历史新低(Hughes,B.(2008).2007FDA drug approvals:a year of flux.Nat.Rev.DrugDiscov.7:107–109；Editorial.(2008).Raising the game.Nat.Biotech.26:137.)。药物发现亟待系统化的理论指导，从而降低风险，缩短周期，节约成本。

继人类基因组计划(HGP)完成后，人类表观基因组协会(Human EpigenomeConsortium，HEC)于2003年宣布正式启动人类表观基因组计划(HEP)。HEP是在基因组水平对表观遗传学改变的研究，而表观遗传学的兴起为进一步理解疾病的致病机理提供可能。表观遗传学是指基于非基因序列改变所致基因表达水平的变化，如DNA甲基化就是其中一种重要的表观遗传修饰，它是指在DNA甲基化转移酶(Dnmt)的作用下，将甲基选择性的添加到胞嘧啶鸟嘌呤二核苷酸(cytosine-phosphate-guanine,CpG)中胞嘧啶上形成5-甲基胞嘧啶的过程，刚被发现时被定义为底五种碱基，实际上它是一种重要的表观遗传学标记，在调控基因表达、维持染色体结构、基因印记、X染色体失活以及胚胎发育等生物学过程中发挥着重大的作用(Nakao M.(2001).Epigenetics:interaction of DNA methylation andchromatin.Gene,27:25-31.)。已有研究表明，很多复杂疾病，如癌症、糖尿病、动脉粥样硬化和系统性红斑狼疮等，均与DNA甲基化的改变有关。除此之外，生物网络由于可以反映基因间的相互调控关系而被广泛用于生物问题的研究(Barabási AL,Oltvai ZN.(2004).Network Biology:Understanding the Cells's Functional Organization.NatureReviews Genetics,5:101-113.)。基于这些信息，我们可以利用相关疾病群体的DNA甲基化数据以及生物网络，并通过一种修订的PageRank算法(Morrison J L,Breitling R,HighamD J,et al.GeneRank:using search engine technology for the analysis ofmicroarray experiments[J].BMC bioinformatics,2005,6(1):1.)来挖掘发病过程中的关键致病基因，再根据药物靶标关系，寻找潜在治疗疾病的药物。

发明内容

本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种基于表观基因组的药物发现方法及其应用，本发明的方法具有理论基础扎实、易于实现、效率高的特点，在药物发现中具有广泛的应用前景。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案如下：一种基于表观基因组的药物发现方法，包括以下步骤：

(1)获取疾病的病人样本及对照样本的DNA甲基化芯片数据；

(2)根据步骤(1)获得的疾病的病人样本及对照样本的DNA甲基化芯片数据，计算与疾病相关每个基因的差异甲基化值；

(3)获取人类基因间相互作用信息，构建基因间相互作用网络；

(4)根据步骤(2)中与疾病相关每个基因的差异甲基化值和步骤(3)中的基因间相互作用网络，使用修订的PageRank算法对疾病基因按照重要性进行排序，对排名靠前的基因进行疾病致病基因富集分析，再根据药物靶标关系，选择排名靠前的基因中的致病基因作为靶标进行药物发现。

作为本发明所述基于表观基因组的药物发现方法的优选实施方式，所述步骤(1)中，DNA甲基化芯片数据中的基因甲基化程度由β值表示。

作为本发明所述基于表观基因组的药物发现方法的优选实施方式，所述步骤(2)中，与疾病相关每个基因的差异甲基化值的计算方法为：将病人样本及对照样本的基因甲基化程度β值转化成基因甲基化M值，转化公式如下：

然后，将病人样本的基因甲基化M值取中值后，减去对照样本的基因甲基化M值的中值，得到与疾病相关每个基因的差异甲基化值。

作为本发明所述基于表观基因组的药物发现方法的优选实施方式，所述步骤(3)的具体操作为：在STRING数据库中搜集人类基因间相互作用信息，选择综合打分在400以上的基因间相互作用，构建基因间相互作用网络。

作为本发明所述基于表观基因组的药物发现方法的优选实施方式，所述步骤(4)中，修订的PageRank算法的公式如下：

其中，ex_i为基因的初始重要性；w_ij为基因间相互作用网络，如果基因i与基因j间有相互作用，那么W_ij＝1，否则为0；为第i个基因在第n-1次迭代后的值；deg_i为顶点i的出度；参数d(0≤d<1)是一个常量，d为基因间相互作用关系在计算过程中的比重。

PageRank算法的核心思路是网络中的一个顶点的重要性依赖于指向它的顶点的重要性。由公式可知，顶点j的重要性取决于两部分的值：基因的初始重要性和指向顶点j的所有顶点的重要性值。如果d越大，说明基因的重要性越依赖于基因间相互作用，d越小说明基因的重要性越依赖于基因的初始重要性。在本研究中，基因的初始重要性是基因在病人样本和对照样本中甲基化程度的差值，基因间相互作用来源于STRING数据库中综合打分大于400的，d值选0.5。

作为本发明所述基于表观基因组的药物发现方法的优选实施方式，所述步骤(4)中，排名靠前的基因为排名前100的基因。

作为本发明所述基于表观基因组的药物发现方法的优选实施方式，所述步骤(4)中，疾病致病基因来源于GAD、OMIM、Clinvar、Orphanet、DisGeNET、INTREPID、GWASdb和HGMD数据库，药物靶标关系来源于TCMID数据库。

作为本发明所述基于表观基因组的药物发现方法的优选实施方式，所述步骤(4)中，疾病致病基因富集分析方法为超几何检验方法。

本发明药物发现方法的有效性可采用以下方法进行验证：

(1)计算特定病人的关键基因列表：根据特定病人的DNA甲基化芯片数据及对照样本数据，计算特定病人每个基因的差异甲基化值；使用修订的PageRank算法对每个病人的基因进行重新排序，得到每个特定病人的关键基因列表；

特定病人的差异甲基化值的计算方法为：将病人样本和对照样本的基因甲基化程度β值转化成基因甲基化M值，再将每个病人对应的基因甲基化M值取中值后，减去对照样本对应的基因甲基化M值的中值，得到每个病人基因的差异甲基化值；再结合基因间相互作用网络，采用修订的PageRank算法，对每个病人的基因进行重要性排序，得到每个特定病人的关键基因列表；

(2)比较批准药物和临床药物的适用度：根据药物靶标数据库中的信息，获取疾病相关的批准药物和临床药物的靶标，使用统计分析方法查看药物靶标是否显著靶向了特定病人发病过程中的关键基因，并评价疾病批准药物的靶标是否明显比临床药物的靶标显著地靶向病人发病过程中的关键基因列表；

疾病相关的批准药物及临床药物治疗活性信息从DrugBank、TTD和ClinicalTrials数据库中获得，药物靶标信息来源于DGIdb、TTD和DrugBank三个数据库，批准药物及临床药物对应的靶基因为DGIdb、TTD和DrugBank三个数据库中靶基因的并集；使用的统计分析方法为Kolmogorov-Smirnov检验和Mann-Whitney-Wilcoxon检验；

通过Kolmogorov-Smirnov检验查看这些药物的靶基因是否显著地分布在病人的关键基因列表的靠前部分，即查看这些药物的靶基因是否靶向了这个病人发病过程中较为重要的基因。如果该统计的p-value越小，就说明这个药物对于此病人越合适。再分别取每种批准药物和临床药物在人群中p-value的中值作为评价该药物在人群中适用度的指标，并用Mann-Whitney-Wilcoxon检验批准药物的适用度是否显著优于临床药物的适用度。如果批准药物的适用度显著优于临床药物的，即批准药物的Kolmogorov-Smirnov检验p-value显著小于临床药物的Kolmogorov-Smirnov检验p-value值，则能够证明本方法在药物药效预测方面的有效性。

本发明还提供了上述基于表观基因组的药物发现方法在医药开发领域的应用。

相对于现有技术，本发明的有益效果为：本发明从药物作用的基本原理出发，结合病人样本的DNA甲基化芯片数据和基因间相互作用网络，使用修订的PageRank算法来挖掘疾病发病过程中的关键致病基因，从而根据药物靶标对应关系，寻找潜在治疗疾病的药物。该方法具有理论基础扎实、易于实现、效率高的特点，在药物发现中具有广泛的应用前景。

附图说明

图1为本发明基于表观基因组的药物发现方法的流程图。

图2为本发明实施例1中批准药物和临床药物的适用度统计分析图。

图3为本发明实施例2中批准药物和临床药物的适用度统计分析图。

具体实施方式

为更好地说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。

为了更好地理解本发明，下面提供相关的解释和说明：

GEO：芯片数据下载数据库；

STRING：蛋白互作网络数据库；

GAD：遗传相关数据库；

OMIM：疾病相关基因数据库；

Clinvar：遗传变异数据库；

Orphanet：稀有疾病相关数据库；

DisGeNET：疾病相关基因数据库；

INTREPID：疾病相关基因数据库；

GWASdb：全基因关联分析数据库；

HGMD：人类基因突变数据库；

TCMID：中药综合数据库；

DrugBank：药物靶标数据库；

TTD：药物靶标数据库；

ClinicalTrials：美国临床试验数据库；

DGIdb：药物靶标数据库。

实施例1使用本发明方法对Ⅱ型糖尿病进行药物发现

本发明基于表观基因组的药物发现方法的流程图如图1所示。

使用本发明方法对Ⅱ型糖尿病进行药物发现包括以下步骤：

(1)获取Ⅱ型糖尿病病人样本、对照样本的DNA甲基化芯片数据

从GEO数据库中获取Ⅱ型糖尿病病人样本及对照样本的DNA甲基化芯片数据(数据集ID：GSE34008，Illumina HumanMethylation27芯片)。该数据集包含12个Ⅱ型糖尿病病人样本，12个正常对照样本，样本的组织为全血组织。删除样本中存在“NA”标记的探针，每个样本得到27,070个DNA甲基化探针值，即β值，代表每个位点的DNA甲基化程度，再根据平台(GPL8490)探针和基因间的对应关系，将样本数据探针名称对应到基因名称。如果存在多个探针对应同一基因的情况，则取这些探针β值的均值作为此基因的β值，最后每个样本均得到14,407个基因的β值。

(2)计算与疾病相关每个基因的差异甲基化值

将病人样本和对照样本的基因甲基化程度β值转化成基因甲基化M值，转化公式如下：

然后，将病人样本的基因甲基化M值取中值后，减去对照样本的基因甲基化M值的中值，作为与疾病相关基因的差异甲基化值。

(3)构建疾病基因间相互作用网络

在STRING数据库中搜集人类基因间相互作用信息，选择综合打分在400以上的基因间相互作用，构建步骤(1)中得到的14,407个基因之间相互作用的网络。

(4)计算疾病相关基因重要性列表并进行致病基因富集分析及药物发现

使用修订的PageRank算法对疾病相关基因进行重要性计算，该算法的输入为基因的初始重要性与基因间相互作用的网络，基因初始重要性即为步骤(2)中与疾病相关的每个基因的差异甲基化值；基因间相互作用网络为步骤(3)中构建的网络。最后，将所有基因按照其重要性降序排列。

在数据库GAD、OMIM、Clinvar、Orphanet、DisGeNET、INTREPID、GWASdb和HGMD中，搜集到人类致病基因共19,238个基因，其中与Ⅱ型糖尿病相关的致病基因有4,971个；选择步骤(4)中得到的基因重要性列表中排名前100的基因，与Ⅱ型糖尿病的致病基因做交集，得到59个，做超几何检验得到p-value为2.27E-12，即通过这种修订的PageRank算法将基因进行重新排序后可以显著富集到Ⅱ型糖尿病的致病基因。如果采用不进行修订的PageRank算法进行计算，直接将步骤(2)中得到的疾病相关基因的差异甲基化值取绝对值后按照从高到低排序，同样选取排名前100的基因与Ⅱ型糖尿病的致病基因做交集，得到24个基因，超几何检验得到p-value为0.699，此结果证明了本方法的有效性。

将得到的59个基因作为靶标，根据TCMID数据库中的中药成分与靶标的对应关系，找到445个中药成分，再根据TCMID数据库中的成分与中药的对应关系，寻找潜在治疗Ⅱ型糖尿病的中药。最终找到20种中药成分在10个以上的中药，分别为：熟地黄干根、人参、茵陈蒿、当归、麻黄、枸杞子、川芎、独活、生姜、大蒜、羌活、党参、橘皮、桑叶、陈皮、香薷、辛夷、关木通、醋柳果、细辛。其中，熟地黄干根和人参在TCMID数据库中标注具有降血糖的功效；茵陈蒿、当归、麻黄、枸杞子、川芎、独活、生姜、大蒜、羌活、党参、橘皮和桑叶均有文献报道可以治疗糖尿病及其并发症；其他六味中药(陈皮、香薷、辛夷、关木通、醋柳果和细辛)暂时没有被报道具有降血糖的功效，但具有很大的研究潜力。这些结果初步证明了本方法的有效性。

对本实施例Ⅱ型糖尿病药物发现的有效性进行验证：

(1)计算每个病人独特的基因重要性列表

特定病人的差异甲基化值的计算方法为：将病人样本和对照样本的基因甲基化程度β值转化成M值，转化方法与步骤(2)相同，再将每个病人样本的基因甲基化M值取中值后，减去对照样本的基因甲基化M值的中值，得到每个病人基因的差异甲基化值；再结合步骤(3)中构建的基因相互作用网络，采用步骤(4)中修订的PageRank算法，对每个病人的基因按照其重要性降序排列，得到每个特定病人的关键基因列表。

(2)批准药物和临床药物的适用度比较

在数据库DrugBank、TTD和ClinicalTrials中搜集具有Ⅱ型糖尿病治疗活性的批准药物及临床药物，并从数据库DrugBank、TTD和DGIdb中找出每种药物对应的靶基因的集合。通过Kolmogorov-Smirnov检验查看这些药物的靶基因是否显著地分布在病人关键基因列表的靠前部分，即查看这些药物的靶基因是否靶向了这个病人发病过程中较为重要的基因。如果该统计的p-value越小，就说明这个药物对于此病人越合适。再分别取每种批准药物和临床药物在人群中p-value的中值作为评价该药物在人群中适用度的指标，并用Mann-Whitney-Wilcoxon检验批准药物的适用度是否显著大于临床药物的适用度。如果批准药物的适用度显著高于临床药物的，即批准药物的Kolmogorov-Smirnov检验p-value显著小于临床药物的Kolmogorov-Smirnov检验p-value值，则能够证明本方法在药物药效预测方面的有效性。

在数据库中搜集到了具有Ⅱ型糖尿病治疗活性的批准药物有89个，临床在研药物有281个，经过Mann-Whitney-Wilcoxon检验得到统计值p-value为7.55E-4，并且批准药物在人群中的Kolmogorov-Smirnov检验p-value值，小于临床药物的Kolmogorov-Smirnov检验p-value值，这显示了本发明药物发现方法的有效性。本实施例中得到的批准药物在人群中的Kolmogorov-Smirnov检验的p-value值与临床药物在人群中的Kolmogorov-Smirnov检验p-value值的统计分析图如图2所示。图2中，横坐标分为批准药物和临床药物两类，纵坐标是批准药物和临床药物在人群中Kolmogorov-Smirnov检验p-value的中值，以此作为适用度，p-value越小，就说明这个药物越有效。由图2可知，经过Mann-Whitney-Wilcoxon检验是显著的，说明批准药物的适用度显著地优于临床药物的，证明了本发明方法的有效性。

实施例2使用本发明方法对动脉粥样硬化进行药物发现

使用本发明方法对动脉粥样硬化进行药物发现包括以下步骤：

(1)获取动脉粥样硬化病人样本、对照样本的DNA甲基化芯片数据

从GEO数据库中获取动脉粥样硬化病人样本及对照样本的DNA甲基化芯片数据(数据集ID：GSE46394，Illumina HumanMethylation450芯片)。该数据集包含34个动脉粥样硬化病人样本，15个正常对照样本，样本的组织为颈动脉组织。删除样本中存在“NA”标记的探针，每个样本得到473,291个DNA甲基化探针值，即β值，代表每个位点的DNA甲基化程度，再根据平台(GPL13534)探针和基因间的对应关系，将样本数据探针名称对应到基因名称。如果存在多个探针对应同一基因的情况，则取这些探针β值的均值作为此基因的β值，最后每个样本均得到20,151个基因的β值。

(2)计算疾病相关每个基因的差异甲基化值

使用与实施例1中步骤(2)相同的方法，计算与动脉粥样硬化相关的每个基因的差异甲基化值。

(3)构建疾病基因间相互作用网络

在STRING数据库中搜集人类基因间相互作用信息，选择综合打分在400以上的基因间相互作用，构建步骤(1)中得到的20,151个基因之间相互作用的网络。

(4)计算疾病相关基因重要性列表并进行致病基因富集分析及药物发现

计算动脉粥样硬化相关基因重要性列表的方法同实施例1中的步骤(4)。

在数据库GAD、OMIM、Clinvar、Orphanet、DisGeNET、INTREPID、GWASdb和HGMD搜集到人类致病基因共19,238个基因，其中与动脉粥样硬化相关的致病基因有1,128个；选择步骤(4)得中到的基因重要性列表中排名前100的基因，与动脉粥样硬化的致病基因做交集，得到16个，做超几何检验得到p-value为2.24E-4，即通过这种修订的PageRank算法将基因进行重新排序后可以显著富集到动脉粥样硬化的致病基因。如果不进行修订的PageRank算法进行计算，直接将步骤(2)中得到的疾病相关基因的差异甲基化值取绝对值后按照从高到低排序，同样选取排名前100的基因与动脉粥样硬化的致病基因做交集，得到5个基因，超几何检验得到p-value为0.705，此结果证明了本方法的有效性。

将得到的16个基因作为靶标，根据TCMID数据库中的中药成分与靶标的对应关系，找到319个中药成分，再根据TCMID数据库中的成分与中药的对应关系，寻找潜在治疗动脉粥样硬化的中药。最终找到3种中药成分在10个以上的中药，分别为：羌活、人参和生姜。这些中药都有一定治疗动脉粥样硬化的疗效，初步证明了本方法的有效性。

对本实施例动脉粥样硬化药物发现的有效性进行验证：

(1)计算每个病人独特的基因重要性列表

特定病人的差异甲基化值的计算方法同实施例1。

(2)批准药物和临床药物的适用度比较

在数据库DrugBank、TTD和ClinicalTrials中搜集具有动脉粥样硬化治疗活性的批准药物及临床药物，并从数据库DrugBank、TTD和DGIdb中找出每种药物对应的靶基因的集合。评价标准同实施例1。

在数据库中搜集到了具有动脉粥样硬化治疗活性的批准药物有12个，临床在研药物有94个，经过Mann-Whitney-Wilcoxon检验得到统计值p-value为0.0367，并且批准药物在人群中的Kolmogorov-Smirnov检验p-value小于临床药物的Kolmogorov-Smirnov检验p-value值，这显示了本发明药物发现方法的有效性。本实施例中得到的批准药物在人群中的Kolmogorov-Smirnov检验的p-value值与临床药物在人群中的Kolmogorov-Smirnov检验p-value值的统计分析图如图3所示。图3中，横坐标分为批准药物和临床药物两类，纵坐标是批准药物和临床药物在人群中Kolmogorov-Smirnov检验p-value的中值，以此作为适用度，p-value越小，就说明这个药物越有效。由图3可知，经过Mann-Whitney-Wilcoxon检验是显著的，说明批准药物的适用度显著地优于临床药物的，证明了本发明方法的有效性。

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (9)

1.一种基于表观基因组的药物发现方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)获取疾病的病人样本及对照样本的DNA甲基化芯片数据；

(2)根据步骤(1)获得的疾病的病人样本及对照样本的DNA甲基化芯片数据，计算与疾病相关每个基因的差异甲基化值；

(3)获取人类基因间相互作用信息，构建基因间相互作用网络；

(4)根据步骤(2)中与疾病相关每个基因的差异甲基化值和步骤(3)中的基因间相互作用网络，使用修订的PageRank算法对疾病基因按照重要性进行排序，对排名靠前的基因进行疾病致病基因富集分析，再根据药物靶标关系，选择排名靠前的基因中的致病基因作为靶标进行药物发现。

2.如权利要求1所述的基于表观基因组的药物发现方法，其特征在于，所述步骤(1)中，DNA甲基化芯片数据中的基因甲基化程度由β值表示。

3.如权利要求1所述的基于表观基因组的药物发现方法，其特征在于，所述步骤(2)中，与疾病相关每个基因的差异甲基化值的计算方法为：将病人样本及对照样本的基因甲基化程度β值转化成基因甲基化M值，转化公式如下：

然后，将病人样本的基因甲基化M值取中值后，减去对照样本的基因甲基化M值的中值，得到与疾病相关每个基因的差异甲基化值。

4.如权利要求1所述的基于表观基因组的药物发现方法，其特征在于，所述步骤(3)的具体操作为：在STRING数据库中搜集人类基因间相互作用信息，选择综合打分在400以上的基因间相互作用，构建基因间相互作用网络。

5.如权利要求1所述的基于表观基因组的药物发现方法，其特征在于，所述步骤(4)中，修订的PageRank算法的公式如下：

其中，ex_i为基因的初始重要性；w_ij为基因间相互作用网络，如果基因i与基因j间有相互作用，那么w_ij＝1，否则为0；为第i个基因在第n-1次迭代后的值；deg_i为顶点i的出度；参数d(0≤d<1)是一个常量，d为基因间相互作用关系在计算过程中的比重。

6.如权利要求1所述的基于表观基因组的药物发现方法，其特征在于，所述步骤(4)中，排名靠前的基因为排名前100的基因。

7.如权利要求1所述的基于表观基因组的药物发现方法，其特征在于，所述步骤(4)中，疾病致病基因来源于GAD、OMIM、Clinvar、Orphanet、DisGeNET、INTREPID、GWASdb和HGMD数据库，药物靶标关系来源于TCMID数据库。

8.如权利要求1所述的基于表观基因组的药物发现方法，其特征在于，所述步骤(4)中，疾病致病基因富集分析方法为超几何检验方法。

9.如权利要求1～8中任一项所述的基于表观基因组的药物发现方法在医药开发领域的应用。