CN109536573A - 一种大肠杆菌检测试剂盒及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及水质微生物检测技术领域，公开了一种大肠杆菌检测试剂盒及其制备方法和应用。本发明所述试剂盒包括裂解液和检测试纸条；所述裂解液由脱水剂、渗透剂和表面活性剂组成，其中所述脱水剂为氯化钠、EDTA‑2Na或氢氧化钠；所述渗透剂为甘油、聚乙二醇2000、吐温80或曲拉通‑100；所述表面活性剂为聚乙烯吡咯烷酮或乙基纤维素；所述检测试纸条的一端有显色块，所述显色块含有X‑GAL。本发明以干化学试纸方法，利用大肠杆菌裂解释放半乳糖酶，与半乳糖苷显色剂(X‑GAL)反应显蓝色来制作干化学试纸，结合本发明特有的快速裂解液可将整个检测过程缩短至30min以内，相比现有产品至少24小时的检测时间，显著提高了水质和食品中大肠杆菌的检测效率。

Description

一种大肠杆菌检测试剂盒及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及水质微生物检测技术领域，具体涉及一种大肠杆菌检测试剂盒及其制备方法和应用。
背景技术
大肠埃希氏菌通常被称为大肠杆菌，是Escherich在1885年发现的，大肠杆菌属于革兰氏阴性细菌，大小0.5×1～3微米，周生鞭毛，能运动，无芽孢。能发酵多种糖类产酸、产气，是人和动物肠道中的正常栖居菌，婴儿出生后即随哺乳进入肠道，与人终身相伴，几乎占粪便干重的1/3。
国家规定，每毫升饮用水中的菌落总数小于100，每100毫升水中不得检出总大肠杆菌群。
大肠菌群数是污水水质分析中常用的细菌学指标，用每升水中的大肠菌群数表示。大肠菌群包括大肠杆菌等几种大量存在于人体肠道中的细菌，因此粪便中大量存在大肠菌群。在一般情况下，大肠菌群属于非致病菌。如在水样中检测出大肠菌群，表明水被粪便所污染。由于水致传染病菌和病毒的生长环境与大肠菌群基本相同，而对水致传染病菌和病毒的检测又比较困难，因此通常用大肠菌群作为间接的检测指标。如果水中的大肠菌群数超过规定的指标，就认为这些水中可能含有水致传染病菌和病毒，如人体直接接触这些水就可能会被传染上疾病。
目前市场上有水质粪大肠菌群检验纸片、大肠杆菌O157:H7快速检测试纸条。此两种产品使用过程中都需要采样，利用恒温培养箱培养24小时，不仅操作不方便，而且检测时间长(大于24小时)，两种产品均是利用微生物检测(国标)方法原理制备。而且上述产品使用领域局限性大，只能用于食品、餐具表面微生物测试，或者致病性大肠杆菌的测试，不具备普遍适用性。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种大肠杆菌检测试剂盒及其制备方法，使得所述试剂盒能够快速检测水质或食品中是否存在大肠杆菌污染，并可应用于水质或食品大肠杆菌的检测中。
为了实现上述发明目的，本发明提供了如下技术方案：
一种大肠杆菌检测试剂盒，包括裂解液和检测试纸条；
所述裂解液由脱水剂、渗透剂和表面活性剂组成，其中所述脱水剂为氯化钠、EDTA-2Na或氢氧化钠；所述渗透剂为甘油、聚乙二醇(优选聚乙二醇2000)、吐温(优选吐温80)或曲拉通-100；所述表面活性剂为聚乙烯吡咯烷酮(优选K30)或乙基纤维素；
所述检测试纸条的一端有显色块，所述显色块含有X-GAL。
作为优选，所述脱水剂的质量百分比浓度为0.1-30％，更优选为1-2％；所述渗透剂的质量百分比浓度为0.1-10％，更优选为0.1-0.2％；所述表面活性剂的质量百分比浓度为0.01-5％。在本发明具体实施方式中，所述脱水剂的质量百分比浓度为1％或2％，所述渗透剂的质量百分比浓度为0.1％或0.2％，所述表面活性剂的质量百分比浓度为0.01％。
作为优选，所述显色块由含有X-GAL的无水乙醇浸润试纸后烘干获得；其中，X-GAL的浓度为(0.01-2)g/100mL无水乙醇。进一步优选地，所述含有X-GAL的无水乙醇中还含有(0.01-5)g聚乙烯吡咯烷酮、(0.1-2)mL甘油、(1-5)mL Tris-Hcl溶液(pH7.4)中的一种或两种以上组分，其中聚乙烯吡咯烷酮和甘油用作表面活性剂，Tris-Hcl溶液(pH7.4)用作pH值调节剂。具体地，每100mL无水乙醇中可含有0.02g聚乙烯吡咯烷酮(例如K30)；每100mL乙醇中可含有0.2mL甘油；每100mL乙醇中可含有1mL的Tris-Hcl溶液(pH7.4)。
此外，为了方便检测，所述试剂盒还包括干燥剂、反应试管和吸管中的一种或两种以上。
同时，本发明还提供了所述试剂盒的制备方法，包括：
称取脱水剂、渗透剂和表面活性剂，加水配制成裂解液；
称取X-GAL，加入乙醇配制成显色液，然后浸润试纸并烘干，获得显色块；显色块固定于基片一端，获得检测试纸条。
其中，所述基片为聚氯乙烯胶片、聚乙烯胶片或者硬纸片；基片长度是6-10cm，宽度是0.3-1cm，显色试纸块面积是0.09-1cm2。
在本发明具体实施方式中，所述制备方法具体如下：
称取X-GAL 0.01-2g，可选择性地加入聚乙烯吡咯烷酮0.01-5g、甘油0.1-2ml、Tris-hcl(ph7.4)溶液1-5ml的一种或多种组分，加入乙醇100mL，获得显色液。
准备中性层析滤纸或其他任何种类的试纸，将试纸浸润上述配制的显色液，在常温至100℃之间的温度烘干，获得显色块；将显色块裁剪成(2-6mm)×(2-8mm)通过双面胶，固定至基片的一端，获得检测试纸条，其结构示意图见图1。
称取脱水剂、渗透剂和表面活性剂，加水，使脱水剂、渗透剂和表面活性剂的浓度依次为0.1-30％、0.1-10％和0.01-5％，获得裂解液；
将检测试纸条、裂解液、反应管、吸管、干燥剂包装成试剂盒。
采用本发明试剂盒对大肠杆菌菌液、无菌水以及其他菌落菌液进行检测，结果显示，采用裂解液进行10min裂解并保持检测试纸条浸入待测样品10min后，只有大肠杆菌菌液显示蓝色，无菌水和其他菌落菌液均无色，这说明本发明试剂盒不仅耗时短，而且准确度高，不易出现假阳性结果。基于优异的试验结果，本发明提出了所述试剂盒在检测水质或食品中大肠杆菌中的应用。
根据所述应用，本发明对应提供了一种检测水质或食品中大肠杆菌的方法，向待测样品中加入所述试剂盒中的裂解液，静置10-20min；然后用所述试剂盒中的检测试纸条浸入待测水样，保持10min后，若检测试纸条显示任意程度的蓝色，即为阳性，检测试纸条无色或其他颜色为阴性。
由以上技术方案可知，本发明以干化学试纸方法，利用大肠杆菌裂解释放半乳糖酶，与半乳糖苷显色剂(X-GAL)反应显蓝色来制作干化学试纸，结合本发明特有的快速裂解液可将整个检测过程缩短至30min以内，相比现有产品至少24小时的检测时间，显著提高了水质和食品中大肠杆菌的检测效率。
附图说明
图1所示为所述试剂盒中检测试纸条结构示意图；
图2所示为不同样品经过本发明试剂盒检测后的显色结果；其中，A为大肠杆菌菌液显色结果；B为无菌水显色结果；C为霉菌菌液显色结果；D为葡萄球菌菌液显色结果。
具体实施方式
本发明公开了一种大肠杆菌检测试剂盒及其制备方法和应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明所述试剂盒及其制备方法和应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述试剂盒及其制备方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明所述水质包括生活饮用水、自来水、海水、渔业用水、泳池用水、农田灌溉水、地下水、地表水、工业污水、试验用水等；食品包括液态食品和固态食品；液态食品主要包括果汁、牛奶、饮料、食品汤、液体原料等，用于检测前，需要先过滤掉不溶物，使用活性炭脱色，然后再检测；而固态食品需要先用水溶解，过滤掉不溶物，使用活性炭脱色后方可检测。
以下就本发明所提供的一种大肠杆菌检测试剂盒及其制备方法和应用做进一步说明。
实施例1：本发明所述试剂盒
1、裂解液
按照表1中任意一行的浓度加水配制裂解液。
表1
2、检测试纸条
称取X-GAL 0.02g，加入聚乙烯吡咯烷酮0.02g，加入无水乙醇100mL，获得显色液。
准备中性层析滤纸或其他任何种类的试纸，将试纸浸润上述配制的显色液，在常温至100℃之间的温度烘干，获得显色块；将显色块裁剪成(2-6mm)×(2-8mm)通过双面胶，固定至基片的一端，获得检测试纸条，其结构示意图见图1。
3、将检测试纸条、裂解液、反应管、吸管、干燥剂包装成试剂盒。
实施例2：本发明试剂盒检测试验
选取OD值为0.3的大肠杆菌菌液、无菌水、OD值为0.3的霉菌菌液以及OD值为0.3的葡萄球菌菌液作为试验对象进行检测；
向待测水样中加入实施例1中的裂解液4，静置10-20min；然后用所述试剂盒中的检测试纸条浸入待测水样，保持10min后，若检测试纸条显示任意程度的蓝色，即为阳性，检测试纸条无色或其他颜色为阴性。
检测结果见表2和图2；
表2
样品名 干化学试纸检测结果
大肠杆菌菌液(OD值0.3) 阳性(蓝色)20min
无菌水 阴性(无色)20min
霉菌菌液(OD值0.3) 阴性(无色)20min
葡萄球菌菌液(OD值0.3) 阴性(无色)20min
由上述结果可以看出，只有大肠杆菌菌液发生变色显示蓝色，其他三组均无显色，同时整个过程仅耗费20min(10min裂解+10min反应)，这说明本发明试剂盒不仅耗时短，而且准确度高，不易出现假阳性结果。此外，采用裂解液1-3进行检测，三者均只有大肠杆菌菌液发生变色显示蓝色，其他三组均无显色。
同时，依据上述试验方法，本发明采用不同OD值的大肠杆菌菌液进行检测，结果见表3。
表3
样品名 干化学试纸检测结果(20min裂解+10min反应)
大肠杆菌菌液(OD值0.3) 阳性(蓝色+)30min
大肠杆菌菌液(OD值0.6) 阳性(蓝色++)30min
大肠杆菌菌液(OD值0.9) 阳性(蓝色+++)30min
大肠杆菌菌液(OD值1.2) 阳性(蓝色++++)30min
大肠杆菌菌液(OD值1.5) 阳性(蓝色+++++)30min
由表3结果可以看出，不同OD值的大肠杆菌菌液均能够被本发明所述试剂盒检出，且随着OD值的增加，显色强度越来越明显。此外，采用裂解液1-3进行检测，三者表现出和表3相同的显色趋势。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种大肠杆菌检测试剂盒，其特征在于，包括裂解液和检测试纸条；
所述裂解液由脱水剂、渗透剂和表面活性剂组成，其中所述脱水剂为氯化钠、EDTA-2Na或氢氧化钠；所述渗透剂为甘油、聚乙二醇、吐温或曲拉通-100；所述表面活性剂为聚乙烯吡咯烷酮或乙基纤维素；
所述检测试纸条的一端有显色块，所述显色块含有X-GAL。
2.根据权利要求1所述试剂盒，其特征在于，所述脱水剂的质量百分比为0.1-30％。
3.根据权利要求1所述试剂盒，其特征在于，所述渗透剂的质量百分比为0.1-10％。
4.根据权利要求1所述试剂盒，其特征在于，所述表面活性剂的质量百分比为0.01-5％。
5.根据权利要求1所述试剂盒，其特征在于，所述显色块由含有X-GAL的无水乙醇浸润试纸后烘干获得。
6.根据权利要求5所述试剂盒，其特征在于，所述含有X-GAL的无水乙醇中还含有聚乙烯吡咯烷酮、甘油、Tris-HCl溶液(ph值7.4)中的一种或两种以上组分。
7.根据权利要求1-6任意一项所述试剂盒，其特征在于，还包括干燥剂、反应试管和吸管中的一种或两种以上。
8.权利要求1-7任意一项所述试剂盒在检测水质或食品中大肠杆菌中的应用。
9.权利要求1所述试剂盒的制备方法，其特征在于，包括：
称取脱水剂、渗透剂和表面活性剂，加水配制成裂解液；
称取X-GAL，加入乙醇配制成显色液，然后浸润试纸并烘干，获得显色块；显色块固定于基片一端，获得检测试纸条。
10.一种检测水质或食品中大肠杆菌的方法，其特征在于，向待测样品中加入权利要求1所述试剂盒中的裂解液，静置10-20min；然后用权利要求1所述试剂盒中的检测试纸条浸入待测水样，保持10min后，若检测试纸条显示任意程度的蓝色，即为阳性，检测试纸条无色或其他颜色为阴性。
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