CN109536517B - 家蚕微粒子假定蛋白nb29及其重组表达载体和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了家蚕微粒子假定蛋白NB29及其重组表达载体和应用，假定蛋白基因NB29的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其表达的蛋白具有分泌性，根据家蚕微粒子假定蛋白(NB29)筛选出截短体形式N3，其融合Cas9蛋白在家蚕细胞质中稳定表达，当感染家蚕微粒子，微粒子的分泌蛋白NB29‑B与NB29‑N3相互作用，将Cas9拖入宿主细胞核中，达到宿主基因编辑的目的。本发明的Cas9介导的诱导型基因编辑载体可以稳定编辑宿主基因，为制备昆虫家蚕微粒子致死模型和家蚕微粒子防控提供了新思路，且对可感染人类的微粒子和家蚕其他病原防控提供借鉴，同时为相关基因的功能研究奠定基础。

Description

家蚕微粒子假定蛋白NB29及其重组表达载体和应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及家蚕微粒子假定蛋白NB29，还涉及分泌蛋白NB29的截短片段及其重组表达载体和应用。
背景技术
家蚕是鳞翅目的模式昆虫，具有重要的经济价值。家蚕微粒子可以通过水平与垂直传播对家蚕造成毁灭性打击，是蚕种检疫过程中唯一的检测对象。当前家蚕微粒子防控最常用的方法是母蛾镜检法、药物处理以及通过PCR等分子生物学检测最终进行烧种处理。但是，不同的方法都存在不同的优缺点，比如母蛾镜检对操作人员技术要求较高，且无法对子代带毒做出充分分析；药物处理也只能规模化处理，无法精确判定带毒个体；PCR等分子生物学检测操作相对较为简单，但往往比较费时且工作量比较大。
CRISPR/Cas9技术是细菌和古细菌在长期演化过程中形成的一种适应性免疫防御，可用来对抗入侵的病毒及外源DNA。通过一段RNA碱基互补配对识别DNA，指引Cas9核酸内切酶识别并切割双链DNA，诱发同源重组或非同源末端连接达到基因编辑的目的。作为一种RNA导向的dsDNA结合蛋白，可以共定位RNA、DNA、蛋白质。将蛋白与无核酸酶的Cas9融合，并表达适当的sgRNA，可靶定任何dsDNA序列，而sgRNA的末端可连接到目标DNA，不影响Cas9的结合。因此，Cas9能在任何dsDNA序列处带来任何融合蛋白及RNA，这为生物体的研究和改造带来巨大潜力。
利用家蚕微粒子感染家蚕的分泌蛋白，将其截短体融合Cas9蛋白表达，利用CRISPR/Cas9基因编辑技术，以宿主关键必需基因为靶基因构建家蚕微粒子诱导型基因编辑载体，将其导入家蚕细胞并持续表达。当家蚕微粒子入侵后，使宿主基因发生插入或缺失从而丧失功能，是防控家蚕微粒子病并及时阻止其大范围扩散的有效手段。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种家蚕微粒子假定蛋白基因NB29；本发明的目的之二在于提供家蚕微粒子假定蛋白基因NB29的信号肽；本发明的目的之三在于提供家蚕微粒子假定蛋白基因NB29的截短片段；本发明的目的之四在于提供含有所述假定蛋白基因NB29或所述假定蛋白基因NB29的信号肽的重组表达载体；本发明的目的之五在于提供含有所述假定蛋白基因NB29的截短片段的重组表达载体；本发明的目的之六在于提供所述假定蛋白基因NB29的截短片段在构建家蚕微粒子(Nosema bombycis)诱导型Cas9编辑系统中的应用；本发明的目的之七在于提供所述重组表达载体在制备昆虫家蚕微粒子致死模型和家蚕微粒子防控中的应用。
为实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案：
1、一种家蚕微粒子假定蛋白基因NB29，所述假定蛋白基因NB29的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2、一种家蚕微粒子假定蛋白基因NB29的信号肽，所述信号肽的核苷酸序列如SEQID NO.5所示。
3、一种家蚕微粒子假定蛋白基因NB29的截短片段，所述截短片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。
4、含有所述假定蛋白基因NB29或所述假定蛋白基因NB29的信号肽的重组表达载体。
优选的，所述的重组表达载体，所述重组表达载体由SEQ ID NO.1所述序列连入pIZ-DsRed载体的Kpn I和BamHⅠ酶切位点处；或所述重组表达载体由SEQ ID NO.5所述序列连入诱捕载体pSUC2T7M13ORI的Xba I和Kpn I酶切位点处。
5、含有所述假定蛋白基因NB29的截短片段的重组表达载体。
所述的重组表达载体，所述重组表达载体由SEQ ID NO.8所述序列连入pIZ载体的Kpn I和BamHⅠ酶切位点处。
优选的，所述重组表达载体包括U6启动子调控sgRNA表达的表达框U6-sgRNA和IE1启动子调控的Cas9表达框，所述Cas9表达框的Cas9下游融合有假定蛋白基因NB29的截短片段。
6、所述假定蛋白基因NB29的截短片段在构建家蚕微粒子(Nosema bombycis)诱导型Cas9编辑系统中的应用。
7、所述重组表达载体在制备昆虫家蚕微粒子致死模型和家蚕微粒子防控中的应用。
本发明的有益效果在于：本发明提供了家蚕微粒子假定蛋白基因NB29，该蛋白具有分泌性，根据家蚕微粒子假定蛋白(NB29)筛选出截短体形式N3，其融合Cas9蛋白在家蚕细胞质中稳定表达，当感染微孢子后，家蚕微粒子的分泌蛋白NB29-B与NB29-N3相互作用，将Cas9拖入宿主细胞核中，达到宿主基因编辑的目的。因此将截短体形式N3构建Cas9介导的诱导型基因编辑载体可以稳定编辑宿主基因，能够用于家蚕微粒子致死模型的构建，适用于家蚕微粒子的及时防控。也可为感染人类的微孢子和家蚕其他病原防控提供借鉴，同时为相关基因的功能研究奠定基础。
附图说明
为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：
为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图：
图1为家蚕微粒子NBO_29g0041(NB29)基因氨基酸序列图；
图2为酵母YTK12菌株检测图(M：Marker；1：阳性对照；2分别为Ps87、Mg87和NB29检测结果。
图3为空白菌株YTK12、pSUC2-NB29、pSUC2-Ps87和pSUC2-Mg87在CMD-W、YPDA、YPRAA培养基中的生长情况图；
图4为空白菌株YTK12、pSUC2-NB29、pSUC2-Ps87和pSUC2-Mg87能否水解蔗糖生成单糖与TTC发生显色反应示意图；
图5为根据NBO_29g0041基因相应结构域构建截短示意图；
图6为将NB29-A(全长)、NB29-B、NB29-C、NB29-D四种截短体分别连接于表达载体pIZ-DsRed中，转染BmN-SWU1细胞后，基因荧光定位示意图及蛋白定位表达图(A：荧光图；B：蛋白定位表达图)；
图7为NB29-B自身相互作用的免疫共沉淀蛋白图以及双分子荧光互补系统(BiFC)图(A：免疫共沉淀蛋白图；B：BiFC荧光图)；
图8为NB29截短体N3连接pIZ载体转染BmN-SWU1细胞后，基因定位示意图；
图9为NB29截短体N3分别与NB29-B分别连接pIZ载体共转BmN-SWU1细胞后基因定位示意图；
图10为pIZ-NB29-N3与pIZ-NB29-B共转BmN-SWU1细胞后，二者存在相互作用的免疫共沉淀蛋白图；
图11为过表达Cas9和U6-sgRNA串联载体pSL1180-Cas9-N3-U6-sgRNA示意图；
图12为表达载体pSL1180-Cas9-N3-U6-sgRNA和pIZ-NB29-B共转不同时间点Cas9入核情况荧光图及荧光强度统计图(A：荧光图；B：荧光强度统计图)；
图13为EGFP基因靶序列EGFP-sgRNA骨架结构示意图；
图14为过表达靶序列为sgEGFP的串联基因编辑载体并感染病原Nosemabombycis后，基因编辑效果示意图。
图15病原入侵细胞后NB29截短体N3作用原理图。
图16为病原入侵细胞后利用该编辑系统敲除BmRpn3对家蚕微粒子增殖有抑制作用。
具体实施方式
以下将结合附图，对本发明基于家蚕微粒子分泌蛋白构建诱导型编辑系统的实施例进行详细描述。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南(第三版，J.萨姆布鲁克等著)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1、家蚕微粒子NB29的生物信息分析及分泌性验证
获得家蚕微粒子假定蛋白基因NB29的核苷酸序列，其序列如SEQ ID No.1所示。利用相应网站对核定位信号、信号肽预测及跨膜结构域分析。
根据生物信息分析，NB29含有信号肽序列，具有两个核定位信号，如图1所示。设计NB29、Ps87、Mg87信号肽序列，其序列分别为SEQ ID No.2、SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示，然后送Gensript公司合成序列。
将合成的信号肽序列同时通过Xba I和Kpn I酶切位点酶切后连接到经过同样酶切的酵母信号序列诱捕载体pSUC2T7M13ORI上，连接产物转化到SUC2缺乏的酵母菌株YTK12中，如图2所示。在CMD-W培养基(0.67％不含氨基酸的酵母氮源、0.075％tryptophandropout supplement、2％蔗糖、0.1％葡萄糖和2％琼脂)上培养2-5天筛选转化子。把转化子点样到含棉籽糖的YPRAA培养基上(1％酵母提取物、2％蛋白胨、2％棉籽糖、2μg/L的抗霉素A、2％琼脂)，通过酵母菌对棉籽糖的利用情况来验证NB29信号肽的功能。同时把转化子点样到YPDA(1％酵母、2％蛋白胨、2％葡萄糖、0.003％硫酸腺嘌呤、2％琼脂)和CMD-W培养基作为对照。其中调至相同浓度的酵母菌液按照1:1、1:10、1:100稀释后点样。结果显示，重组体pSUC2-NB29、阳性对照pSUC2-Ps87、阴性对照pSUC2-Mg87的酵母转化子可以在CMD-W培养基上生长，而野生型酵母菌株YTK12无法在CMD-W培养基中生长；在YPDA和YPRAA培养基中，转化子pSUC2-NB29和阳性对照pSUC2-Ps87的3种浓度菌液均可以生长，且长势与浓度呈正相关；而阴性对照pSUC2-Mg87和野生型菌株YTK12不具有信号肽序列，长势明显受到了抑制，如图3所示，表明NB29信号肽序列具有分泌性。
在含有5mL CMD-W液体培养基的离心管中分别接种转化酵母菌株YTK12-pSUC2-NB29、YTK12-pSUC2-Ps87、YTK12-pSUC2-Mg87，在YPDA培养基中接种野生型YTK12菌株，利用250r/min 30℃摇菌24h，13000r/min离心5min收集沉淀。利用无菌超纯水清洗2次后，重悬于5mL无菌水中。吸取1mL液体测A600值，稀释至A600为0.6。取1mL的稀释菌液于含有5mL蔗糖溶液的15mL离心管中并颠倒混匀，加入1％TTC溶液，放置于35℃的水浴锅中30min，室温放置10min。结果如图4所示，转化子YTK12-pSUC2-NB29和阳性对照YTK12-pSUC2-Ps87溶液变红，说明信号肽可以分泌，蔗糖酶水解蔗糖生成单糖，单糖与TTC反应生成红色不溶于水的沉淀。
实施例2、分泌蛋白NB29自身相互作用的鉴定
由实施例1验证了家蚕微粒子NB29是一种分泌蛋白，满足分泌进入宿主细胞的要求。为了进一步构建系统，首先依据结构域对NB29进行截短，设计截短NB29-A(全长)、NB29-B、NB29-C、NB29-D序列，序列分别如SEQ ID No.1、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.7所示，然后送Gensript公司合成序列。NB29-A、NB29-B、NB29-C和NB29-D利用Kpn I和BamH I连接于pIZ-DsRed载体(将如SEQ ID No.9所示DsRed荧光蛋白序列连入pIZ载体的Hind III和Kpn I酶切位点处)，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，然后用含有博来霉素(Zeocin)的LB平板筛选阳性克隆，挑取阳性克隆单菌落，酶切验证正确后使用。NB29-N3利用Kpn I和BamH I连接于pIZ载体，得到pIZ-NB29-N3，构建一系列截短载体如图5所示，所有载体测序正确后使用。
将以上构建载体pIZ-DsRed-NB29-A、pIZ-DsRed-NB29-B、pIZ-DsRed-NB29-C和pIZ-DsRed-NB29-D利用脂质体转染试剂分别转染到24孔板的BmN-SWU1细胞中，转染48h后，用1×PBST轻洗细胞3次，加入250μL质量分数为4％的多聚甲醛溶液，室温固定15min，用1×PBST轻洗细胞3次，每次5min；再加入质量分数为0.1％的Triton-100通透细胞10min，用1×PBST轻洗细胞3次，每次5min；用封闭液(含10％的羊血清和3％的牛血清的PBS配制)封闭1h，用1×PBST轻洗细胞3次，每次5min；加入细胞核染料DAPI，37℃避光处理1h，用1×PBST轻洗细胞3次，每次5min。最后取出盖玻片在Olympus激光共聚焦扫描显微镜下拍照观察，结果如图6中的A所示，其中pIZ-DsRed-NB29-B有明显的点状聚集现象。同时利用细胞核蛋白与细胞浆蛋白抽提试剂盒分离转染后的浆蛋白和核蛋白，Western blotting验证定位，结果如图6中的B所示，结果表明与荧光定位结果相一致，pIZ-DsRed-NB29-A、pIZ-DsRed-NB29-B、pIZ-DsRed-NB29-D核质均有分布，pIZ-DsRed-NB29-C定位于细胞核中。
为了进一步验证NB29-B的点状聚集可能由其自身相互作用引起，通过免疫共沉淀进行验证。把pIZ-NB29-B:Flag和pIZ-NB29-B:cMYC共转染到BmN-SWU1细胞中，转染48h后收集细胞，向其中加入1mL含PMSF的细胞IP裂解液重悬细胞，冰浴裂解30min；吸出100μL含胞内蛋白的混合物作总蛋白组，另取两个1.5mL的离心管，每管加入60μL的A+G蛋白磁珠，利用PBST轻洗一次后，每管加入250μL PBST，并分别加入2μL小鼠Flag标签抗体(实验组)和2μL兔IgG(对照组)，4℃轻微摇晃孵育30min；利用磁力架固定磁珠，吸弃上清后PBST清洗2-3次；把剩余的900μL均分转到两个含有磁珠的1.5mL的离心管中，每个离心管中含有450μL的胞内蛋白混合物，4℃轻微摇晃孵育1h，同样吸弃上清后PBST清洗2-3次，每管加入30μL含PMSF的细胞IP裂解液，并加入8μL SDS-PAGE蛋白上样缓冲液，沸水浴12min，做Westblotting验证，反钓利用相应抗体同理进行，结果如图7中A所示，pIZ-NB29-B:Flag和pIZ-NB29-B:cMYC具有相互作用。
为了再次验证上述自身互作，利用双分子荧光互补技术(BiFC)验证上述结果，把NB29-B通过Kpn I和BamH I分别连接于pIZ-VC155和pIZ-VN173载体中，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，然后用含有博来霉素(Zeocin)的LB平板筛选阳性克隆，挑取阳性克隆单菌落，酶切验证正确后使用。共同转染BmN-SWU1细胞(实验组)，以及二者分别与空白载体共转染(对照组)。转染48h后通过共聚焦显微镜观察是否有黄色荧光激发，结果如图7中B所示，表明pIZ-VC155-NB29-B可以与pIZ-VN173-NB29-B激发出黄色荧光，而对照组无荧光激发，表明分泌蛋白NB29-B之间确实存在相互作用。
实施例3、分泌蛋白NB29最优截短体的筛选
在分泌蛋白NB29-B自身相互作用的基础上，进一步筛选出截短体NB29-N3(SEQ IDNO.8)，送Gensript公司合成序列，以期为融合Cas9奠定基础。首先pIZ-NB29-N3转染于BmN-SWU1细胞，方法类似实施例2，区别是封闭液封闭后，用1×PBST轻洗细胞3次，每次5min；鼠源Myc抗体室温孵育1h，用1×PBST轻洗细胞3次，每次5min；加入Alexa555标记的山羊抗小鼠的二抗IgG和细胞核染料DAPI，37℃避光处理1h，用1×PBST轻洗细胞3次，每次5min。取出盖玻片荧光观察其在细胞中的定位情况，结果如图8所示，NB29-N3单独转染定位于细胞质中，满足筛选条件。
把pIZ-NB29-N3与pIZ-NB29-B共转染于BmN-SWU1细胞，方法类似实施例2，区别是封闭液封闭后，用1×PBST轻洗细胞3次，每次5min；鼠源Myc抗体、兔源Flag抗体室温孵育1h，用1×PBST轻洗细胞3次，每次5min；加入Alexa555标记的山羊抗小鼠和Alexa488标记的山羊抗兔的二抗IgG以及细胞核染料DAPI，37℃避光处理1h，用1×PBST轻洗细胞3次，每次5min。取出盖玻片荧光观察它们在细胞中的定位情况，结果如图9所示，NB29-N3有不同程度的入核现象。
NB29-B与NB29-N3共同转染BmN-SWU1细胞后，定位均发生明显变化；利用免疫共沉淀，方法同实施例2，结果如图10所示，表明NB29-B与NB29-N3之间存在相互作用。NB29-N3作为筛选得到的截短体可以进行后期应用。
实施例4、基于分泌蛋白NB29的诱导型Cas9编辑系统构建及应用
利用公开号为CN105132460A的中国专利Cas9介导的家蚕基因编辑载体，设计Cas9相应引物Cas9-F(5’-ccgctcgagatggattacaaggatgacgacgataaggacaagaagtacagcatcggc-3’(SEQ ID NO.10)，下划线为Xho I酶切位点)和Cas9-R(5’-aaggaaaaaagcggccgcgtcgcctcccagctgaga-3’(SEQ ID NO.11)，下划线为Not I酶切位点)，两段NB29-N3引物N-NB29-N3-F(5’-aaggaaaaaagcggccgccatgattaatccgcatataatattt-3’(SEQ ID NO.12)，下划线为NotI酶切位点)和N-NB29-N3-R(5’-ggggtaccattatcttttttattatttttctttg-3’(SEQIDNO.13)，下划线为Kpn I酶切位点)，C-NB29-N3-F(5’-ggggtaccatgattaatccgcatataatattt-3’(SEQ ID NO.14)，下划线为Kpn I酶切位点)和C-NB29-N3-R(5’-gctctagattaattatcttttttattatttttctttg-3’(SEQ ID NO.15)，下划线为Xba I酶切位点)，载体构建方法同实施例1，载体见图11，载体命名为pSL1180-Cas9-N3-U6-sgRNA。
把构建好的Cas9载体与pIZ-NB29-B共同转染BmN-SWU1细胞48h、60h、72h后，通过荧光观察Cas9进入细胞核的趋势逐渐增加，并对荧光强度进行统计，如图12所示。
利用如SEQ ID No.16所示外源EGFP蛋白基因作为sgRNA靶基因，并根据CRISPRdirect在线分析工具(https://crispr.dbcls.jp/)预测的egfp基因的sgRNA序列，同时根据软件分析靶序列在家蚕中的脱靶效率，最后选择高效编辑的sgRNA序列，其序列为：
sgEGFP-73F：5’-ggccacaagttcagcgtgtc-3’(SEQ ID NO.17)；
sgEGFP-73R：5’-ccggtgttcaagtcgcacag-3’(SEQ ID NO.18)；
sgEGFP-181F：5’-ctcgtgaccaccctgaccta-3’(SEQ ID NO.19)；
sgEGFP-181R：5’-gagcactggtgggtctggat-3’(SEQ ID NO.20)；
sgEGFP-339F：5’-gaagttcgagggcgacaccc-3’(SEQ ID NO.21)；
sgEGFP-339R：5’-cttcaagctcccgctgtggg-3’(SEQ ID NO.22)；
sgEGFP-361F：5’-gtgaaccgcatcgagctgaa-3’(SEQ ID NO.23)；
sgEGFP-361R：5’-cacttggcgtagctcgactt-3’(SEQ ID NO.24)；
按照实施例1的方法将egfp基因的sgRNA序列连接到进过Bbs I酶切的串联优化表达载体pSL1180-Cas9-N3-U6-sgRNA中，然后转化挑取阳性克隆，经测序正确后使用，其靶序列骨架结构如图13所示，载体命名为pSL1180-Cas9-N3-U6-sgEGFP。
将pSL1180-Cas9-N3-U6-sgEGFP载体转染到BmN-SWU1细胞48h后，Nosemabombycis感染细胞72h后利用DNA提取试剂盒提取基因编辑后的DNA。用egfp基因两端的序列设计引物，以提取的DNA模板进行扩增，胶回收后连接到PMD19-T载体上，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，用含有Amp的LB平板筛选阳性克隆，挑取阳性单菌落。测序后与正常基因序列比较，结果如图14所示，以敲除效率较高的sgEGFP-339为例在egfp基因靶位点附近缺失出现了基因的缺失，说明这一系统在Nosema bombycis病原入侵后可以编辑基因，进而达到防控Nosema bombycis的目的(图15)。
因此该Cas9载体转染BmN-SWU1细胞敲除宿主BmRpn3基因，通过定量验证敲除BmRpn3可抑制家蚕微粒子的增殖(图16)。
最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。
序列表
<110> 西南大学
<120> 微粒子感染家蚕的假定蛋白NB29及其重组表达载体和应用
<160> 22
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 459
<212> DNA
<213> 微孢子虫(Nosema bombycis)
<400> 1
atgattaatc cgcatataat attttccact ttaattactc ttgcctctct tgcgcacgtt 60
gggcataata aaaacaaaga tcgagtagat attaaaatac ctgcttatct ttttgataat 120
aatagaaaaa atgtatcggt tacggtcaca atagatctgg aaatagatca aacaaaagag 180
aaagaaaaca tatgtacatc gaattcagag gaatcagcac aattttttag aaaactctct 240
agtacaccac caccagaact tccaccaaaa aggcgaaatt ctccttttta tgaaaatgct 300
aaaagatgca actctgtgga ttatgtttat gatgttccta aaaactataa cagcctgcaa 360
accgaaacag ctaatgaatc ccagaaacaa aatatttcag gaactttaag aaaagtagta 420
aagaatcttt caaagaaaaa taataaaaaa gataattaa 459
<210> 2
<211> 69
<212> DNA
<213> 微孢子虫(Nosema bombycis)
<400> 2
atgattaatc cgcatataat attttccact ttaattactc ttgcctctct tgcgcacgtt 60
gggcataat 69
<210> 3
<211> 66
<212> DNA
<213> 微孢子虫(Nosema bombycis)
<400> 3
atgccgatgc catgggaaac cttcataccc ctcggtctct tgacagtgat gtttggagcc 60
tccgga 66
<210> 4
<211> 75
<212> DNA
<213> 微孢子虫(Nosema bombycis)
<400> 4
atgcctgttc ccttcgagac cttgattccc tatgccatca tcacggctat gtttggcatt 60
tcgggtgccg gtatc 75
<210> 5
<211> 393
<212> DNA
<213> 微孢子虫(Nosema bombycis)
<400> 5
atgaaaaaca aagatcgagt agatattaaa atacctgctt atctttttga taataataga 60
aaaaatgtat cggttacggt cacaatagat ctggaaatag atcaaacaaa agagaaagaa 120
aacatatgta catcgaattc agaggaatca gcacaatttt ttagaaaact ctctagtaca 180
ccaccaccag aacttccacc aaaaaggcga aattctcctt tttatgaaaa tgctaaaaga 240
tgcaactctg tggattatgt ttatgatgtt cctaaaaact ataacagcct gcaaaccgaa 300
acagctaatg aatcccagaa acaaaatatt tcaggaactt taagaaaagt agtaaagaat 360
ctttcaaaga aaaataataa aaaagataat taa 393
<210> 6
<211> 240
<212> DNA
<213> 微孢子虫(Nosema bombycis)
<400> 6
atgtttttta gaaaactctc tagtacacca ccaccagaac ttccaccaaa aaggcgaaat 60
tctccttttt atgaaaatgc taaaagatgc aactctgtgg attatgttta tgatgttcct 120
aaaaactata acagcctgca aaccgaaaca gctaatgaat cccagaaaca aaatatttca 180
ggaactttaa gaaaagtagt aaagaatctt tcaaagaaaa ataataaaaa agataattaa 240
<210> 7
<211> 177
<212> DNA
<213> 微孢子虫(Nosema bombycis)
<400> 7
atgttttatg aaaatgctaa aagatgcaac tctgtggatt atgtttatga tgttcctaaa 60
aactataaca gcctgcaaac cgaaacagct aatgaatccc agaaacaaaa tatttcagga 120
actttaagaa aagtagtaaa gaatctttca aagaaaaata ataaaaaaga taattaa 177
<210> 8
<211> 303
<212> DNA
<213> 微孢子虫(Nosema bombycis)
<400> 8
atgattaatc cgcatataat attttccact ttaattactc ttgcctctct tgcgcacgtt 60
gggcataata aaaacaaaga tcgagtagat attaaaatac ctgcttatct ttttgataat 120
aatagaaaaa atgtatcggt tacggtcaca atagatctgg aaatagatca aacaaaagag 180
aaagaaaaca tatgtacatc gaattcagag gaatcagcac aattttatga aaatgctaaa 240
agatgcaact ctgtggatta tgtttataat ctttcaaaga aaaataataa aaaagataat 300
taa 303
<210> 9
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
ccgctcgaga tggattacaa ggatgacgac gataaggaca agaagtacag catcggc 57
<210> 10
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
aaggaaaaaa gcggccgcgt cgcctcccag ctgaga 36
<210> 11
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
aaggaaaaaa gcggccgcca tgattaatcc gcatataata ttt 43
<210> 12
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
ggggtaccat tatctttttt attatttttc tttg 34
<210> 13
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
ggggtaccat gattaatccg catataatat tt 32
<210> 14
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
gctctagatt aattatcttt tttattattt ttctttg 37
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
ggccacaagt tcagcgtgtc 20
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
ccggtgttca agtcgcacag 20
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
ctcgtgacca ccctgaccta 20
<210> 18
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
gagcactggt gggtctggat 20
<210> 19
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
gaagttcgag ggcgacaccc 20
<210> 20
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
cttcaagctc ccgctgtggg 20
<210> 21
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
gtgaaccgca tcgagctgaa 20
<210> 22
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
cacttggcgt agctcgactt 20

Claims (6)

1.一种家蚕微粒子假定蛋白基因NB29的截短片段，其特征在于：所述截短片段的核苷酸序列如SEQ ID NO. 8所示。
2.含有权利要求1所述假定蛋白基因NB29的截短片段的重组表达载体。
3.根据权利要求2所述的重组表达载体，其特征在于：所述重组表达载体由SEQ IDNO.8所述序列连入pIZ载体的KpnI和BamHⅠ酶切位点处。
4.根据权利要求2所述的重组表达载体，其特征在于：所述重组表达载体包括U6启动子调控sgRNA表达的表达框U6-sgRNA和IE1启动子调控的Cas9表达框，所述Cas9表达框的Cas9下游融合有假定蛋白基因NB29的截短片段。
5.权利要求1所述假定蛋白基因NB29的截短片段在构建家蚕微粒子（Nosema bombycis）诱导型Cas9编辑系统中的应用。
6.权利要求4所述重组表达载体在制备昆虫微粒子致死模型中的应用，所述昆虫为家蚕。
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