CN109529005A - 人丹用于治疗ras原癌基因过表达肿瘤的新用途 - Google Patents

人丹用于治疗ras原癌基因过表达肿瘤的新用途 Download PDF

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Abstract

本发明公开了人丹在制备治疗ras原癌基因过表达的肿瘤的药物中应用的新用途，具体为人丹用于治疗肝癌、胰腺癌、肺癌和结肠癌的新用途。人丹为治疗中暑头晕的中成药，本发明实验结果显示，人丹可显著抑制let‑60突变导致的ras原癌基因过表达的秀丽隐杆线虫肿瘤样多阴门表型，使其扭转为具有真阴门的野生型表型。说明人丹具备治疗ras基因过表达的肿瘤的潜力，可被用于制备治疗ras原癌基因过表达肿瘤的药物。

Description

人丹用于治疗ras原癌基因过表达肿瘤的新用途
技术领域
本发明涉及人丹用于治疗ras原癌基因过表达肿瘤的新用途，属于抗肿瘤药 物领域。
背景技术
目前，恶性肿瘤已经成为人类的头号杀手，严重的危害着人类的健康，世 界卫生组织的资料表明，每年全世界肿瘤的发病为1000万人，死亡约700万人。
约30％的人类肿瘤是由于ras原癌基因突变后导致RAS蛋白过度激活造成 的。在30％的人类肿瘤中存在ras基因的突变和RAS蛋白的过度激活，其中约 90％的胰腺癌，50％左右的结肠癌和20％左右的急性白血病存在ras基因突变 (Hara and Han,1995)在40％的遗传性非息肉病性结直肠癌中检测到KRAS突 变，49％的常规滤泡性甲状腺癌有RAS突变，48％的Hurthle细胞甲状腺肿瘤 有RAS突变。83％的胰腺癌和85％胆管癌中发生KRAS密码子12突变。除此 以外，肺癌、胃癌、乳腺癌、膀胱癌以及黑色素瘤等癌症都与ras基因的突变密 切相关(杨麒巍等，2018)。Ras-MAPK信号转导通路异常参与了肝癌的进程(李 蕊等，2016)。以Ras信号通路为靶标的抗肿瘤治疗也成为肿瘤治疗学的研究热 点，因此，ras已成为公认的筛选相关恶性癌药物靶点(刘雪梅等,2008)。Ras信 号通路从线虫到人高度保守，在秀丽隐杆线虫中let-60基因编码保守的RAS蛋 白，它与人类的RAS蛋白相比具有83％的同源性。如果ras基因突变，在秀丽 隐杆线虫中会引起线虫产生多阴门，在人类中则是引起细胞的恶性增殖，导致 肿瘤的发生。因此，模式生物秀丽隐杆线虫(Caenorhabditiselegans)Ras/MAPK 信号通路过度激活型突变体被作为肿瘤模型广泛应用于筛选抑制Ras通路过度 激活的抗肿瘤药物(Hara and Han,1995；王昉,2005；刘雪梅等,2008)。本发明采用秀丽隐杆线虫为筛选工具，进行下调Ras/MAPK信号通路过度激活抗肿瘤药 物候选物的筛选。
传统的化学药物治疗和手术、放疗等结合，虽成功提高了多种恶性肿瘤的 治疗率，但由于较强的副作用以及耐药性，使得寻找新的治疗肿瘤的研究刻不 容缓(张秀云，2012)。我国的中药在治疗癌症中具有多方位、多靶点、不易产 生耐药等优势，符合肿瘤多因素、多环节致病的机理，其抗肿瘤的有效部位、 有效成分及作用机理研究已成为目前国内外研究的热点，并在临床肿瘤治疗方 面取得了一定疗效，且毒性较低，为肿瘤预防和治疗开辟了一条新路，近年来 中药及其有效成分抗肿瘤研究工作取得了一系列的成果，有的成果已经转化为 临床上广泛使用的抗肿瘤药物(尹龙等，2006；张秀云，2012；朱元章等，2017)。
人丹最早源自于中国古有的成方“诸葛行军散”，几经改进，得到现有的处 方。人丹主要由薄荷脑、冰片、丁香、砂仁、八角茴香、肉桂、胡椒、木香、 干姜、儿茶、甘草组成。可以开窍醒神，祛暑化浊，和中止呕，主要用于中暑 头晕，恶心呕吐，腹泻及晕车，晕船。
本发明发现了人丹用于治疗ras原癌基因过表达的肿瘤的新用途，具体涉及 的肿瘤为肝癌、胰腺癌、肺癌和结肠癌。
参考文献：
王明政，我国恶性肿瘤预防与控制策略探索[J].中医药管理杂志，2017,25(06):8-9
刘雪梅，邓平等，基于Ras信号转导途径的药物靶标研究进展[J].药学进展，2008,32(11):481-485
王昉(2005).利用线虫作为模式生物筛选能够抑制癌基因ras活性的药物.复旦大学博士后出站报告.
Hara M，Han M et al.Ras farnesyltransferase inhibitors suppress thephenotype resulting from an activated ras mutation in Caenorhabditis elegans.[J].Developmental Biology，1995,92(4):3333-3337
张秀云等，抗肿瘤中药有效部位及化学成分研究进展[J].科技视界，2012,7(3):177-178
尹龙，徐亮等，抗肿瘤中药及其有效成分的作用研究现状[J].动物医学进展，2006,27(1):39-43
朱元章，张贵彪等，中药挥发油抗肿瘤机制研究进展[J].中国实验方剂学杂志，16(8):227-234
杨麒巍,隋玉杰,杜珍武,张桂珍.RAS基因家族在实体瘤中突变率的研究进展[J].中国体视学与图像分 析,2018(03):303-310.
李蕊,宋威江,张少鹏,姚树坤.Ras-MAPK通路在肝癌发病机制中的作用[J].中日友好医院学 报,2016,30(01):47-49+54.
发明内容
本发明的目的是提供人丹在治疗ras原癌基因过表达肿瘤的新用途，具体涉 及该人丹在肝癌、胰腺癌和结肠癌中的应用。
本发明通过下述技术方案予以实施。
本发明所述的人丹由下述重量份的药味组成：薄荷脑40份，冰片30份， 丁香25份、砂仁25份、八角茴香15份、肉桂40份、白胡椒15份、木香15 份、干姜25份，儿茶200份，甘草364.1份。
本发明提供的人丹可以特异性下调ras原癌基因突变后所致的过表达，可在 制备治疗由ras原癌基因突变后过表达引起的相关恶性肿瘤药物中应用，提供了 一种靶标明确的治疗肿瘤的药物。
由于Ras信号通路从线虫到人高度保守，在秀丽隐杆线虫中，let-60基因编 码保守的RAS蛋白，它与人类的RAS蛋白相比具有83％的同源性。如果ras 基因突变，在秀丽隐杆线虫中会引起线虫的多阴门表型，在人类中则是引起细 胞的恶性增殖，导致肿瘤的发生。因此，模式生物秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)Ras/MAPK信号通路过度激活型突变体被作为肿瘤模型广泛应用于筛 选抑制Ras通路过度激活的抗肿瘤药物。
因此，本发明采用了秀丽隐杆线虫突变体作为评估抑制ras原癌基因通路过 度激活药物的模型，并得出了人丹对ras原癌基因过表达有明显的下调作用、具 有抑制ras原癌基因通路过度激活的作用，并且人丹仅仅对let-60突变导致的ras 过度激活引起的肿瘤细胞起作用，而对lin-15缺失突变导致的野生型ras过度激 活引起的肿瘤细胞不起作用，应用安全，即它仅作用于癌细胞，而不会作用于 正常细胞，可显著下调ras原癌基因过表达，并不导致基因突变，不致畸。因此， 人丹可以在制备治疗ras原癌基因过表达肿瘤的药物中应用。
有益效果：
本发明涉及人丹在治疗ras原癌基因过表达肿瘤的新用途，人丹可以显著抑 制ras原癌基因过表达，具体涉及的肿瘤为肝癌、胰腺癌、肺癌和结肠癌。人丹 对ras基因过表达肿瘤的治疗作用不是依赖于广泛的细胞毒作用，而是特异性下 调ras原癌基因的过表达；人丹仅对let-60突变导致的ras过度激活引起的肿瘤 细胞起作用，而对lin-15缺失突变导致的野生型ras过度激活引起的肿瘤细胞不 起作用，即人丹仅作用于癌细胞，不作用于正常细胞，不致畸，应用安全。
具体实施方式
以下提供具体实施例来说明本发明，但不限于这些实施例。
实施例一 人丹提取物的制备
本发明对所述龙虎人丹的来源没有特别限定，可以从市场购买获得。在本 发明的实施例中，所述龙虎人丹购买自上海中华药业有限公司，【生产批号】 160507。
除上述明确用于指代产品名称外，本发明所述“人丹”特指其中的中药组 份。
人丹成药单位处方组成：薄荷脑40份，冰片30份，丁香25份、砂仁25 份、八角茴香15份、肉桂40份、白胡椒15份、木香15份、干姜25份，儿茶 200份，甘草364.1份。
由于本发明采用秀丽隐杆线虫为筛选工具，进行下调Ras/MAPK信号通路 过度激活抗肿瘤药物候选物的筛选，因此将人丹成药制成人丹醇提物和人丹挥 发油提取物进行秀丽隐杆线虫的抗肿瘤药物筛选。
人丹醇提物：将人丹成药粉碎，加10倍量75％乙醇，回流提取1小时，得 到人丹75％醇提物溶液；人丹75％醇提物溶液用纱布过滤两次，滤液10000rpm 离心10min，取上清液，减压蒸干溶剂，干燥，得到人丹75％醇提物浸膏。
人丹挥发油提取物：将人丹成药粉碎，加入蒸馏水，采用水蒸气蒸馏法提 取，得到挥发油提取物粗品，所述挥发油提物粗品再用有机溶剂萃取，萃取所 得的有机相挥干溶剂，脱水干燥，得到人丹挥发油提取物。
实施例二 人丹对秀丽隐杆线虫MT2124(let-60突变)的作用
ras过度激活在线虫中会引起线虫产生多阴门，在人类中则是引起细胞的恶 性增殖，如果受试药物能够抑制受试线虫多阴门表型的产生，促使它们发育成 为野生型，则说明药物作用于Ras通路，下调了该通路的过度激活，具有抗肿 瘤活性。MT2124是let-60/ras过度激活的秀丽隐杆线虫，该株系线虫为多阴门 表型，相当于罹患了人类ras原癌基因突变的难治性肿瘤。采用受试药物处理秀 丽隐杆线虫MT2124，如果受试药物能够抑制受试线虫多阴门表型的产生，促使 它们发育成为野生型，则说明药物作用于Ras通路，下调了该通路的过度激活， 具有抗肿瘤活性。野生型线虫在受试线虫群体中所占的比例越高，表明受试药 物作用效果越好。
实验材料：秀丽隐杆线虫MT2124，基因型：let-60(n1046sd,gf)IV，购自 CGC；大肠杆菌OP50，尿嘧啶渗漏突变株，作为秀丽隐杆线虫的食物，购自CGC。
S基础液：氯化钠2.925g，磷酸氢二钾0.5g，磷酸二氢钾3g，蒸馏水500 mL，震摇使溶解，于121℃灭菌20min；
1M柠檬酸缓冲液：柠檬酸2g，柠檬酸钾29.35g，蒸馏水100mL，震摇使 溶解，于121℃灭菌20min；
Trace液：EDTA0.186g，FeSO4·7H2O 0.06g，MnCl2·4H2O 0.02g，CuSO4·5H2O0.0025g，ZnSO4·7H2O 0.029g，蒸馏水100mL，震摇使溶解，于121℃灭菌20 min；
1M硫酸镁溶液：MgSO4·7H2O 24.647g，蒸馏水100mL，震摇使溶解，于 121℃灭菌20min；
1M氯化钙溶液：CaCl2·2H2O 14.702g，蒸馏水100mL，震摇使溶解，于121℃ 灭菌20min；
5mg/mL胆固醇溶液：胆固醇0.05g，无水乙醇10mL，震摇使溶解，置4℃ 保存备用；
S液培养基：S基础液100mL，1M柠檬酸缓冲液1mL，Trace液1mL，1M 硫酸镁溶液0.3mL，1M氯化钙溶液0.3mL，5mg/mL胆固醇溶液0.1mL，混 合均匀即可。
M9缓冲液：氯化钠2.486g，磷酸氢二钠2.982g，磷酸二氢钾1.496g，硫 酸镁0.06g，蒸馏水500mL，震摇使溶解，于121℃灭菌20min；
具体实验步骤：
线虫的培养：将线虫接在涂有大肠杆菌OP50的固体NGM板上，然后将放 在20℃的培养箱中培养，当线虫长到成虫，并且板子上有卵和幼体线虫的时候 进行线虫同步化。
线虫同步化：用M9缓冲液将平板上的线虫冲下来，将冲洗液吸入离心管； 4000rpm离心3min，去除上清，然后在加入M9缓冲液，离心，重复几次，目 的是将大肠杆菌洗干净；加入裂解液(终浓度：3.2％NaClO和1M NaOH)；在 涡旋仪上震荡7min，使线虫破裂，得到卵；4000rpm离心3min，去除上清， 收集沉淀获得大量的线虫卵；M9缓冲液冲洗两次，加入1mLM9缓冲液，置于 20℃培养箱中孵化48小时。
药物作用：将同步化好的线虫稀释到80条/20μL左右，在96孔板中，每个 孔中加入上述线虫液20μL，S液120μL，10mg/mL的大肠杆菌OP50 20μL，5 mg/mL的胆固醇20μL，药液20μL，分别评估人丹醇提物、人丹挥发油提取物 的药理作用，设置浓度梯度，每个浓度设置五个平行，具体药液浓度设置如表1。 空白对照组不加药液，将药液换成等体积的S液。20℃恒温培养至线虫成熟， 在显微镜下检测线虫的野生型比例(即只有一个真阴门的线虫比例)。与空白对 照组相比，野生型的比例越高，说明药物抑制ras激活的作用更强。结果如下表所示：
表1人丹醇提物(75％)和人丹挥发油提取物的浓度设置
表2人丹醇提物(75％)对秀丽隐杆线虫MT2124(let-60突变)野生型比例的影响
*为与空白组比较P＜0.05
从表2可以看出，人丹醇提物(75％)使秀丽隐杆线虫MT2124的野生型比 例明显增加，并呈浓度依赖关系，说明人丹醇提物(75％)作用于RAS通路， 对Ras/MAPK通路过度激活有明显下调作用，使突变体变为野生型。
表3人丹挥发油提取物对秀丽隐杆线虫MT2124(let-60突变)野生型比例的影响
从表3可以看出，人丹挥发油提取物使秀丽隐杆线虫MT2124的野生型比 例明显增加，并呈浓度依赖关系，说明人丹挥发油提取物作用于RAS通路，对 Ras/MAPK通路过度激活有明显下调作用，使突变体变为野生型。
从表2-3可以看出，人丹醇提物和人丹挥发油提取物均使秀丽隐杆线虫 MT2124的野生型比例增加，并呈浓度依赖关系，说明人丹提取物作用于RAS 通路，对Ras/MAPK通路过度激活有下调作用，使突变体变为野生型。其中75％ 的人丹醇提物在0.5mg/ml时，秀丽隐杆线虫MT2124(let-60突变)野生型比例 最大，对Ras/MAPK通路过度激活有明显下调作用。
因此，人丹能够作用于Ras通路，下调了该通路的过度激活，具有抗肿瘤 活性，可以在制备治疗ras原癌基因过表达肿瘤的药物中应用。
实施例三 人丹对秀丽隐杆线虫MT8189(lin-15突变)的作用
lin-15位于ras的上游，是ras的抑制基因，lin-15缺失突变后，对ras的抑 制作用消失，线虫表现出多阴门表型。MT8189(lin-15)线虫中包含的是野生型 let60/ras拷贝，当人丹能够使秀丽隐杆线虫MT2124(let-60)的野生型比例明显 增加，而不能抑制MT8189(lin-15)线虫的多阴门表型时，说明人丹仅对let-60 突变导致的ras过度激活引起的肿瘤细胞起作用，而对lin-15缺失突变导致的野 生型ras过度激活引起的肿瘤细胞不起作用。因此，证明人丹提取物仅仅作用于 let-60突变导致的ras过度激活引起的肿瘤细胞，而不作用于正常的细胞。
实验材料：秀丽隐杆线虫MT8189，多阴门表型，基因型:lin-15(n765ts)X， 购自CGC；大肠杆菌OP50，尿嘧啶渗漏突变株，作为秀丽隐杆线虫的食物，购 自CGC。
具体实验步骤：同实施例二。
表4人丹醇提物(75％)对秀丽隐杆线虫MT8189(lin-15缺失突变)的作用
lin-15(n765)位于ras的上游，作为合成多产卵器的基因(SynMuv)。
如表4所示，人丹醇提物(75％)不能抑制lin-15(n765)的多阴门表型，根 据遗传上位的原则，实施例二实验结果显示人丹醇提物(75％)可逆转其下游的 let60/ras原癌基因过度激活导致的多阴门表型，即人丹醇提物(75％)不能抑制 let60/ras上游基因lin-15(n765)的多阴门表型。这是由于lin-15(n765)线虫中包含 的是野生型let60/ras拷贝，人丹醇提物(75％)仅仅对let-60突变导致的let60/ras 过度激活的肿瘤起作用，对lin-15缺失突变导致的let60/ras过度激活的肿瘤不 敏感，即该人丹提取物仅仅作用于let-60突变导致的ras过度激活引起的肿瘤细 胞，而不作用于正常的细胞。
实施例四人丹对秀丽隐杆线虫CB1275(lin-1缺失突变)的作用
lin-1是ras下游的一个基因，是可被MAPK磷酸化的核转录因子，是阴门 发育的负调节因子，可以调节let-60下游的阴门发育的信号通路。lin-1与lin-31 组成复合体，lin-1编码ETS家族成员，而lin-31编码带翼螺旋转录因，ras信号 未激活时，lin-1与lin-31相互作用组成复合体，这个复合体与产卵器功能基因 的起动部分结合而阻止它们的表达。lin-1缺失突变后，复合体就无法形成，复 合体不能形成，无法与产卵器功能基因的起动部分结合，产卵器基因表达，进 而产生假阴门发育形成多阴门表型(Ferguson,1989)。
即lin-1是ras下游的一个基因，是阴门发育的负调节因子，lin-1缺失突变 后，产卵器基因表达，线虫表现出多阴门表型。当人丹能够使秀丽隐杆线虫 MT2124(let-60)的野生型比例明显增加，而不能抑制lin-1的多阴门表型时， 说明药物作用位点在lin-1上游，而不是lin-1，即药物下调了ras的过度激活而 不是直接抑制了阴门细胞的发育起作用。
实验材料：秀丽隐杆线虫基因型：lin-1(e1275)IV来源于CGC (CaenorhabditisGenetics Center)，购自CGC；大肠杆菌OP50，尿嘧啶渗漏突 变株，作为秀丽隐杆线虫的食物，购自CGC。
具体实验步骤：同实施例二
表5人丹醇提物(75％)对秀丽隐杆线虫CB1275(lin-1缺失突变)的作用
如表5所示，CB1275株系线虫的多阴门表型未受到人丹醇提物(75％)的 影响，这表明药物作用于Ras信号通路可抑制let-60突变导致的ras过度激活形 成的多阴门表型，不能抑制lin-1缺失突变形成的多阴门表型，说明人丹醇提物 (75％)作用于ras而不作用于lin-1，证明药物下调了ras的过度激活而不是直 接抑制了细胞的增殖分化起作用的，即人丹醇提物(75％)起作用是Ras通路 机制依赖地，而非广泛的细胞毒作用。
因此，本发明所述的人丹可用于治疗ras原癌基因过表达肿瘤，可以显著抑 制ras原癌基因过表达，具体涉及的肿瘤为肝癌、胰腺癌、肺癌和结肠癌。人丹 对ras基因过表达肿瘤的治疗作用不是依赖于广泛的细胞毒作用，而是特异性下 调ras原癌基因的过表达；人丹仅对let-60突变导致的ras过度激活引起的肿瘤 细胞起作用，而对lin-15缺失突变导致的野生型ras过度激活引起的肿瘤细胞不 起作用，即人丹仅作用于癌细胞，不作用于正常细胞，不致畸，应用安全。

Claims (3)

1.人丹在制备治疗ras原癌基因过表达肿瘤药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的人丹在治疗ras原癌基因过表达的肿瘤药物中的应用，其特征在于，所述肿瘤为肝癌、胰腺癌、肺癌和结肠癌。
3.根据权利要求1所述的人丹在治疗ras原癌基因过表达的肿瘤药物中的应用，其特征在于，所述人丹由下述重量份的药味组成：薄荷脑40份，冰片30份，丁香25份、砂仁25份、八角茴香15份、肉桂40份、白胡椒15份、木香15份、干姜25份，儿茶200份，甘草364.1份。
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