CN109524064B - 一种多酚氧化酶抑制剂的虚拟筛选方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种多酚氧化酶抑制剂的虚拟筛选方法。多酚氧化酶是造成烤烟挂灰的主要因素，抑制多酚氧化酶的活性可显著降低烤烟过程中出现的挂灰情况。本发明采用基于支持向量机算法的机器学习，对多酚氧化酶的抑制剂进行虚拟筛选。与传统的基于药理活性实验的高通量筛选等方法相比，本发明利用计算机将抑制剂筛选的过程在计算机上模拟，对化合物可能的活性作出预测，进而筛选多酚氧化酶的潜在抑制剂，具有成本低、速度快、效率高的特点。

Description

一种多酚氧化酶抑制剂的虚拟筛选方法

技术领域

本发明属于多酚氧化酶抑制剂筛选技术领域，具体涉及一种多酚氧化酶抑制剂的虚拟筛选方法。

背景技术

挂灰烟是我国烤烟烘烤过程中极易产生的一类烤坏烟叶。它也是烟叶烘烤过程中无法避免的烤坏烟叶之一。尽管挂灰烟形成的因素复杂，既有栽培条件的复杂性，也有烟叶烘烤过程的复杂性，但从烤烟过程中的分子层面来看，烘烤过程中发生的酶促棕色化反应是发生挂灰的根本原因。在多酚氧化酶的作用下，烟叶中的多酚类物质经氧化产生淡红色至黑褐色的醌类物质，使烟叶颜色由黄转变为不同程度的褐色，从而导致烤烟挂灰。

因此，研发能抑制多酚氧化酶的抑制剂可以显著降低烤烟挂灰的发生。传统的抑制剂研发方法主要依赖大量的合成及生物活性测试，成本很高。特别注意的是，用于烟草的抑制剂分子有可能会被摄入人体，所以对抑制剂分子的安全性要求也很高。综上，研发一种能解决上述问题的技术是非常必要的。

发明内容

本发明的目的在于提供一种多酚氧化酶抑制剂的虚拟筛选方法。

本发明的目的是这样实现的，包括以下步骤：

S1、 训练预测模型：以多酚氧化酶抑制剂的生物活性数据为训练集，利用实现了支持向量机算法的libsvm程序，训练得到多酚氧化酶抑制剂的预测模型；

S2、准备筛选数据库：从数据库中获得已上市药物化合物数据，并计算每个药物化合物分子的分子描述符；

S3、用预测模型对数据进行筛选：用S1步骤中训练得到的预测模型对S2步骤中准备好的化合物数据库进行筛选，得到潜在的多酚氧化酶抑制剂；

S4、多酚氧化酶抑制剂预筛选：先将潜在的多酚氧化酶抑制剂进行预筛选，筛除带负电荷的抑制剂；

S5、将经过预筛选的多酚氧化酶抑制剂进行生物活性实验测量IC₅₀值，最终得到筛选出的多酚氧化酶抑制剂。

与现有技术相比，本发明具有以下技术效果：

1、本发明利用支持向量机算法的机器学习方法开展多酚氧化酶抑制剂的虚拟筛选，速度快、效率高，极大的降低了研发成本。

2、本发明在虚拟筛选的基础上结合实际筛选，筛除带负电荷的抑制剂并优选对铜离子有亲和性的同时使分子为电中性的抑制剂，进一步缩小需要做生物活性实验的潜在多酚氧化酶抑制剂的范围，大大缩短筛选周期，降低成本，提高筛选准确性。

3、本发明以已上市药物作为筛选数据库，是老药新用在烤烟领域的应用，保障了多酚氧化酶抑制剂的使用对人体的安全性。

4、本发明能够快速筛选出适用于烤烟领域的多酚氧化酶抑制剂，针对性强，有效解决现有烤烟在烘烤过程中容易出现挂灰烟的问题。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但不以任何方式对本发明加以限制，基于本发明教导所作的任何变换或替换，均属于本发明的保护范围。

本发明所述的多酚氧化酶抑制剂的虚拟筛选方法，包括以下步骤：

S1、训练预测模型：以多酚氧化酶抑制剂的生物活性数据为训练集，利用实现了支持向量机算法的libsvm程序，训练得到多酚氧化酶抑制剂的预测模型；

S2、准备筛选数据库：从数据库中获得已上市药物化合物数据，并计算每个药物化合物分子的分子描述符；

S3、用预测模型对数据进行筛选：用S1步骤中训练得到的预测模型对S2步骤中准备好的化合物数据库进行筛选，得到潜在的多酚氧化酶抑制剂；

S4、多酚氧化酶抑制剂预筛选：先将潜在的多酚氧化酶抑制剂进行预筛选，筛除带负电荷的抑制剂；

S5、将经过预筛选的多酚氧化酶抑制剂进行生物活性实验测量IC₅₀值，最终得到筛选出的多酚氧化酶抑制剂。

进一步的，步骤S1中所述的多酚氧化酶抑制剂的生物活性数据的获取方法包括以下步骤：

1）从文献和/或ChEMBL数据库中收集已知活性的多酚氧化酶抑制剂及其IC50数据；

2）以IC₅₀=10uM为分界线，将这些抑制剂标记为有活性、无活性两大类，其中IC₅₀≥10uM的标记为无活性，IC₅₀＜10uM的标记为有活性；

3）接着通过Openbabel程序，将所有抑制剂分子转化为SDF格式的三维分子结构；并对每个抑制剂分子，用分子描述符程序计算获得分子描述符；

4）得到的所有抑制剂分子的分子描述符连同有活性、无活性的标记信息一起作为多酚氧化酶抑制剂的生物活性数据。

进一步的，步骤（1）中所述的已知活性的多酚氧化酶抑制剂为已知活性的烤烟多酚氧化酶抑制剂。

进一步的，步骤（1）中所述的已知活性的多酚氧化酶抑制剂为已知活性的酪氨酸酶抑制剂。

进一步的，步骤S1中所述的训练还包括随机将数据集分为训练集和测试集，对预测模型结果进行5倍交叉验证，保证预测模型的可靠性。

进一步的，步骤S2中所述的数据库为ZINC、PubChem、Drugbank、TargetMol数据库中的任一种或多种；所述的分子描述符的获取方法为先将每个药物化合物分子转化为SDF格式的三维结构，接着用分子描述符程序对每个化合物计算尽可能多的分子描述符。

进一步的，所述的分子描述符程序为PaDEL、Dragon、MOE、Marvin、PowerMV程序中的任一种。

进一步的，步骤S4中所述的多酚氧化酶抑制剂预筛选还包括筛选出对铜离子有亲和性且分子整体为电中性的多酚氧化酶抑制剂，所述的铜离子有亲和性是指分子含有带负电荷的极性基团。

进一步的，步骤S5中所述的生物活性实验包括以下步骤：

A、以左旋多巴作为底物，以100μM作为抑制剂浓度，将20μL所需浓度抑制剂溶液，20μL 2500U/ml蘑菇酪氨酸酶和140μL pH5.5磷酸钾缓冲液混合并加入到96孔板的每个孔中，在37°C下孵育10分钟；此外，通过酶标仪在475nm下对体系进行测定，共反应10分钟，每30秒记录一次吸光度，根据吸光度筛选高抑制活性的抑制剂；同时，使用曲酸在相同条件下作为阳性对照；

B、接着，分别在1μM，5μM，25μM，50μM，100μM，150μM，200μM的浓度梯度下，分别对高抑制活性的抑制剂进行测试，获取各浓度抑制剂下体系吸光度，绘制IC₅₀曲线，得到IC₅₀值；每种浓度三个平行样本，测定多个浓度的抑制剂抑制效果以确定测试化合物的IC50；

C、酪氨酸酶活性按如下公式计算：

其中S表示OD 475试验体系的吸光度，B是OD 475空白的吸光度，C表示OD 475控制组的吸光度。

进一步的，步骤S5中所述的筛选出的多酚氧化酶抑制剂在缓解烤烟挂灰烟上的应用。

实施例1

一种多酚氧化酶抑制剂的虚拟筛选方法，包括以下步骤：

A、训练预测模型：

1. 从文献中、ChEMBL等数据中获取酪氨酸酶（一种多酚氧化酶）抑制剂的IC₅₀活性数据；

2. 以IC₅₀=10uM为分界线，将这些抑制剂标记为有活性、无活性两大类；

3. 将所有抑制剂分子转化为SDF格式的三维分子结构；

4. 对每个抑制剂分子，用PaDEL程序计算获得多个分子描述符；

5. 将所有分子的描述符连同是否为活性分子的信息一同作为数据集，用libsvm程序进行支持向量机算法的模型训练，通过随机将数据集分为训练集和测试机，对结果进行5倍交叉验证，保证预测模型的可靠性；

B、准备筛选数据库：

1. 从ZINC数据库下载FDA批准上市的药物信息；

2. 将所有药物分子转化为SDF格式的三维分子结构；

3. 对每个分子，用PaDEL程序计算获得多个分子描述符；

C、用预测模型对数据进行筛选：

1. 将步骤B中的每一个分子的分子描述符放入步骤A得到的预测模型中用于预测该分子是否具有多酚氧化酶的抑制活性；

2. 先在潜在的多酚氧化酶抑制剂中筛除带负电荷的抑制剂，优选对铜离子有亲和性且分子为电中性的多酚氧化酶抑制剂；

3. 将所有预测为有活性的化合物进行生物活性测试，最终确定具有多酚氧化酶抑制活性的化合物。

实施例2

一种多酚氧化酶抑制剂的虚拟筛选方法，包括以下步骤：

S1、训练预测模型：以多酚氧化酶抑制剂的生物活性数据为训练集，利用实现了支持向量机算法的libsvm程序，训练得到多酚氧化酶抑制剂的预测模型；所述的训练还包括随机将数据集分为训练集和测试集，对预测模型结果进行5倍交叉验证，保证预测模型的可靠性；

所述的多酚氧化酶抑制剂的生物活性数据的获取方法包括以下步骤：

1）从文献中收集已知活性的多酚氧化酶抑制剂及其IC50数据；所述的已知活性的多酚氧化酶抑制剂为已知活性的烤烟多酚氧化酶抑制剂；

2）以IC₅₀=10uM为分界线，将这些抑制剂标记为有活性、无活性两大类，其中IC₅₀≥10uM的标记为无活性，IC₅₀＜10uM的标记为有活性；

3）接着通过Openbabel程序，将所有抑制剂分子转化为SDF格式的三维分子结构；并对每个抑制剂分子，用分子描述符程序计算获得分子描述符；

4）得到的所有抑制剂分子的分子描述符连同有活性、无活性的标记信息一起作为多酚氧化酶抑制剂的生物活性数据。

S2、准备筛选数据库：从数据库中获得已上市药物化合物数据，并计算每个药物化合物分子的分子描述符；所述的数据库为ZINC；

所述的分子描述符的获取方法为先将每个药物化合物分子转化为SDF格式的三维结构，接着用分子描述符程序对每个化合物计算尽可能多的分子描述符；所述的分子描述符程序为Dragon程序；

S3、用预测模型对数据进行筛选：用S1步骤中训练得到的预测模型对S2步骤中准备好的化合物数据库进行筛选，得到潜在的多酚氧化酶抑制剂；

S4、多酚氧化酶抑制剂预筛选：先将潜在的多酚氧化酶抑制剂进行预筛选，先筛除带负电荷的抑制剂，再筛选出对铜离子有亲和性且分子整体为电中性的多酚氧化酶抑制剂，所述的铜离子有亲和性是指分子含有带负电荷的极性基团。

S5、将经过预筛选的多酚氧化酶抑制剂进行生物活性实验测量IC₅₀值，最终得到筛选出的多酚氧化酶抑制剂。

本实施例与常规方法相比，缩短筛选时间一半以上，速度快、效率高，极大的降低了研发成本。所述的筛选出的多酚氧化酶抑制剂能够应用在缓解烤烟挂灰烟上。

实施例3

一种多酚氧化酶抑制剂的虚拟筛选方法，包括以下步骤：

S1、训练预测模型：以多酚氧化酶抑制剂的生物活性数据为训练集，利用实现了支持向量机算法的libsvm程序，训练得到多酚氧化酶抑制剂的预测模型；所述的训练还包括随机将数据集分为训练集和测试集，对预测模型结果进行5倍交叉验证，保证预测模型的可靠性；

所述的多酚氧化酶抑制剂的生物活性数据的获取方法包括以下步骤：

1）从ChEMBL数据库中收集已知活性的多酚氧化酶抑制剂及其IC50数据；所述的已知活性的多酚氧化酶抑制剂为已知活性的烤烟多酚氧化酶抑制剂，且所述的已知活性的多酚氧化酶抑制剂为已知活性的酪氨酸酶抑制剂；

2）以IC₅₀=10uM为分界线，将这些抑制剂标记为有活性、无活性两大类，其中IC₅₀≥10uM的标记为无活性，IC₅₀＜10uM的标记为有活性；

3）接着通过Openbabel程序，将所有抑制剂分子转化为SDF格式的三维分子结构；并对每个抑制剂分子，用分子描述符程序计算获得分子描述符；

4）得到的所有抑制剂分子的分子描述符连同有活性、无活性的标记信息一起作为多酚氧化酶抑制剂的生物活性数据。

S2、准备筛选数据库：从数据库中获得已上市药物化合物数据，并计算每个药物化合物分子的分子描述符；所述的数据库为ZINC、PubChem、Drugbank和TargetMol数据库；

所述的分子描述符的获取方法为先将每个药物化合物分子转化为SDF格式的三维结构，接着用分子描述符程序对每个化合物计算尽可能多的分子描述符；所述的分子描述符程序为MOE程序；

S3、用预测模型对数据进行筛选：用S1步骤中训练得到的预测模型对S2步骤中准备好的化合物数据库进行筛选，得到潜在的多酚氧化酶抑制剂；

S4、多酚氧化酶抑制剂预筛选：先将潜在的多酚氧化酶抑制剂进行预筛选，先筛除带负电荷的抑制剂，再筛选出对铜离子有亲和性且分子整体为电中性的多酚氧化酶抑制剂，所述的铜离子有亲和性是指分子含有带负电荷的极性基团。

S5、将经过预筛选的多酚氧化酶抑制剂进行生物活性实验测量IC₅₀值，最终得到筛选出的多酚氧化酶抑制剂。

所述的生物活性实验包括以下步骤：

A、以左旋多巴作为底物，以100μM作为抑制剂浓度，将20μL所需浓度抑制剂溶液，20μL 2500U/ml蘑菇酪氨酸酶和140μL pH5.5磷酸钾缓冲液混合并加入到96孔板的每个孔中，在37°C下孵育10分钟；此外，通过酶标仪在475nm下对体系进行测定，共反应10分钟，每30秒记录一次吸光度，根据吸光度筛选高抑制活性的抑制剂；同时，使用曲酸在相同条件下作为阳性对照；

B、接着，分别在1μM，5μM，25μM，50μM，100μM，150μM，200μM的浓度梯度下，分别对高抑制活性的抑制剂进行测试，获取各浓度抑制剂下体系吸光度，绘制IC₅₀曲线，得到IC₅₀值；每种浓度三个平行样本，测定多个浓度的抑制剂抑制效果以确定测试化合物的IC50。

其中，酪氨酸酶活性按如下公式计算：

其中S表示OD 475试验体系的吸光度，B是OD 475空白的吸光度，C表示OD 475控制组的吸光度。

本实施例与常规方法相比，缩短筛选时间一半以上，速度快、效率高，极大的降低了研发成本。所述的筛选出的多酚氧化酶抑制剂能够应用在缓解烤烟挂灰烟上。

实施例4

一种多酚氧化酶抑制剂的虚拟筛选方法，包括以下步骤：

S1、训练预测模型：以多酚氧化酶抑制剂的生物活性数据为训练集，利用实现了支持向量机算法的libsvm程序，训练得到多酚氧化酶抑制剂的预测模型；所述的训练还包括随机将数据集分为训练集和测试集，对预测模型结果进行5倍交叉验证，保证预测模型的可靠性；

所述的多酚氧化酶抑制剂的生物活性数据的获取方法包括以下步骤：

1）从文献和ChEMBL数据库中收集已知活性的酪氨酸酶抑制剂及其IC₅₀数据；

2）以IC₅₀=10uM为分界线，将这些抑制剂标记为有活性、无活性两大类，其中IC₅₀≥10uM的标记为无活性，IC₅₀＜10uM的标记为有活性；

3）接着通过Openbabel程序，将所有抑制剂分子转化为SDF格式的三维分子结构；并对每个抑制剂分子，用分子描述符程序计算获得分子描述符；

4）得到的所有抑制剂分子的分子描述符连同有活性、无活性的标记信息一种作为多酚氧化酶抑制剂的生物活性数据。

S2、准备筛选数据库：从ZINC、PubChem、Drugbank和TargetMol等数据库中获得已上市药物化合物数据，并计算每个药物化合物分子的分子描述符；所述的分子描述符的获取方法为先将每个药物化合物分子转化为SDF格式的三维结构，接着用分子描述符程序对每个化合物计算尽可能多的分子描述符。所述的分子描述符程序为PaDEL。

S3、用预测模型对数据进行筛选：用A步骤中训练得到的预测模型对B步骤中准备好的化合物数据库进行筛选，得到潜在的多酚氧化酶抑制剂；

S4、多酚氧化酶抑制剂预筛选：先将潜在的多酚氧化酶抑制剂进行预筛选，先筛除带负电荷的抑制剂，接着筛选出对铜离子有亲和性且分子整体为电中性的多酚氧化酶抑制剂，所述的铜离子有亲和性是指分子含有带负电荷的极性基团；

S5、将潜在的多酚氧化酶抑制剂进行生物活性实验测量IC₅₀值，得到IC₅₀值，优选其中IC₅₀值最低或者较低的，最终得到筛选出的多酚氧化酶抑制剂。

所述的生物活性实验包括以下步骤：

A、以左旋多巴作为底物，以100μM作为抑制剂浓度，将20μL所需浓度抑制剂溶液，20μL 2500U/ml蘑菇酪氨酸酶和140μL pH5.5磷酸钾缓冲液混合并加入到96孔板的每个孔中，在37°C下孵育10分钟；此外，通过酶标仪在475nm下对体系进行测定，共反应10分钟，每30秒记录一次吸光度，根据吸光度筛选高抑制活性的抑制剂；同时，使用曲酸在相同条件下作为阳性对照；

B、接着，分别在1μM，5μM，25μM，50μM，100μM，150μM，200μM的浓度梯度下，对高活性抑制剂进行测试，获取各浓度抑制剂下体系吸光度，绘制IC₅₀曲线，得到IC₅₀值；

C、酪氨酸酶活性按如下公式计算：

其中S表示OD 475试验体系的吸光度，B是OD 475空白的吸光度，C表示OD 475控制组的吸光度；每种浓度三个平行样本，测定多个浓度的抑制剂抑制效果以确定测试化合物的IC₅₀。

本实施例共筛选出6种多酚氧化酶抑制剂，与常规方法相比，缩短筛选时间一半以上，速度快、效率高，极大的降低了研发成本。

实验例1——多酚氧化酶抑制剂效果对比

以实施例4中筛选出的6种多酚氧化酶抑制剂，与现有技术中的8种广谱抑制剂进行PPO活性和相对活力对比，以磷酸盐缓冲溶液为对照。对比结果详见表1。

结果表明：本发明实施例4筛选出的6种多酚氧化酶抑制剂中，除了Prothionamide和Ethionamide抑制PPO活性的效果稍弱于聚乙烯吡咯烷酮 (PVP)，其余四种抑制剂降低PPO活性的效果均显著优于多酚氧化酶广谱抑制剂中效果最优的PVP，其中以Isoliquiritigenin的抑制效果最为明显，其处理后PPO的活性仅为对照的 15%。

表1 多酚氧化酶抑制剂效果对比

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实验例2——烟叶生产过程抑制挂灰烟效果对比

实验在玉溪市研和试验基地进行，烤烟品种为K326，部位均为上部叶（微受冷害易挂灰的烟叶），在烟叶进行初烤前，以磷酸盐缓冲溶液为对照，选用柠檬酸、EDTA、l-半胱氨酸和PVP四种广谱抑制剂以及本发明实施例4筛选出的6种抑制剂分别以0.5 mmol/L的浓度均匀喷洒在编于烟杆上的烟叶表面，每种抑制剂为一个处理，每个处理重复三次（三杆烟），各自做好标记，经过正常烘烤，最后对初烤烟叶进行挂灰程度、上中等烟比例和均价统计。统计结果见表2。

结果表明：本发明实施例4筛选的6种多酚氧化酶抑制剂在烘烤过程中能有效减缓挂灰烟的形成，增加上中等烟比例，提高均价，其中以Isoliquiritigenin抑制剂效果最优。

表2 烟叶生产过程抑制挂灰烟效果对比

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Claims (7)

1.一种多酚氧化酶抑制剂的虚拟筛选方法，其特征在于包括以下步骤：

S1、训练预测模型：以多酚氧化酶抑制剂的生物活性数据为训练集，利用实现了支持向量机算法的libsvm程序，训练得到多酚氧化酶抑制剂的预测模型；生物活性数据的获取方法包括以下步骤：

1）从文献和/或ChEMBL数据库中收集已知活性的多酚氧化酶抑制剂及其IC₅₀数据；

2）以IC₅₀=10μM为分界线，将这些抑制剂标记为有活性、无活性两大类，其中IC₅₀≥10μM的标记无活性，IC₅₀＜10μM的标记为有活性；

3）接着通过Openbabel程序，将所有抑制剂分子转化为SDF格式的三维分子结构；并对每个抑制剂分子，用分子描述符程序计算获得分子描述符；

4）得到的所有抑制剂分子的分子描述符连同有活性、无活性的标记信息一起作为多酚氧化酶抑制剂的生物活性数据；

S2、准备筛选数据库：从数据库中获得已上市药物化合物数据，所述数据库为ZINC、PubChem、Drugbank、TargetMol数据库中的任一种或多种；先将每个药物化合物分子转化为SDF格式的三维结构，接着用分子描述符程序对每个化合物计算尽可能多的分子描述符；

S3、用预测模型对数据进行筛选：用S1步骤中训练得到的预测模型对S2步骤中准备好的化合物数据库进行筛选，得到潜在的多酚氧化酶抑制剂；

S4、多酚氧化酶抑制剂预筛选：先将潜在的多酚氧化酶抑制剂进行预筛选，筛除带负电荷的抑制剂，以及筛选出对铜离子有亲和性且分子整体为电中性的多酚氧化酶抑制剂，所述的铜离子有亲和性是指分子含有带负电荷的极性基团；

S5、将经过预筛选的多酚氧化酶抑制剂进行生物活性实验测量IC₅₀值，最终得到筛选出的多酚氧化酶抑制剂。

2.根据权利要求1所述的虚拟筛选方法，其特征在于步骤1）中所述已知活性的多酚氧化酶抑制剂为已知活性的烤烟多酚氧化酶抑制剂。

3.根据权利要求1所述的虚拟筛选方法，其特征在于步骤1）中所述的已知活性的多酚氧化酶抑制剂为已知活性的酪氨酸酶抑制剂。

4.根据权利要求1所述的虚拟筛选方法，其特征在于步骤S1中所述训练还包括随机将数据集分为训练集和测试集，对预测模型结果进行5倍交叉验证，保证预测模型的可靠性。

5.根据权利要求1所述的虚拟筛选方法，其特征在于所述分子描述符程序为PaDEL、Dragon、MOE、Marvin、PowerMV程序中的任一种。

6.根据权利要求1所述的虚拟筛选方法，其特征在于步骤S5中所述的生物活性实验包括以下步骤：

A、以左旋多巴作为底物，以100μM作为抑制剂浓度，将20μL所需浓度抑制剂溶液，20μL2500U/ml蘑菇酪氨酸酶和140μL pH5.5磷酸钾缓冲液混合并加入到96孔板的每个孔中，在37°C下孵育10分钟；此外，通过酶标仪在475nm下对体系进行测定，共反应10分钟，每30秒记录一次吸光度，根据吸光度筛选高抑制活性的抑制剂；同时，使用曲酸在相同条件下作为阳性对照；

B、接着，分别在1μM，5μM，25μM，50μM，100μM，150μM，200μM的浓度梯度下，分别对高抑制活性的抑制剂进行测试，获取各浓度抑制剂下体系吸光度，绘制IC₅₀曲线，得到IC₅₀值；每种浓度三个平行样本，测定多个浓度的抑制剂抑制效果以确定测试化合物的IC₅₀；

C、酪氨酸酶活性按如下公式计算：

其中S表示OD 475试验体系的吸光度，B是OD 475空白的吸光度，C表示OD 475控制组的吸光度。

7.根据权利要求1所述的虚拟筛选方法，其特征在于步骤S5中所述筛选出的多酚氧化酶抑制剂在缓解烤烟挂灰烟上的应用。