CN109517051A

CN109517051A - 人表皮干细胞诱导为角膜上皮细胞的方法

Info

Publication number: CN109517051A
Application number: CN201811468651.8A
Authority: CN
Inventors: 杨骏; 余兵生
Original assignee: Luoyang Xuan Zhi Biological Technology Co Ltd
Current assignee: Raphael (Shenzhen) Investment Consulting Co., Ltd
Priority date: 2018-12-03
Filing date: 2018-12-03
Publication date: 2019-03-26
Anticipated expiration: 2038-12-03
Also published as: CN109517051B

Abstract

本发明提供了一种人表皮干细胞的体外诱导向角膜上皮样细胞分化的方法，其中使用了特定的角膜促进肽，能够显著提高角膜上皮细胞的分化效率。

Description

人表皮干细胞诱导为角膜上皮细胞的方法

技术领域

本发明涉及一种人表皮干细胞诱导为角膜上皮细胞的方法。

背景技术

干细胞，起源细胞，是具有增殖和分化潜能的细胞，具有自我更新复制的能力，能够产生高度分化的功能细胞。简单来讲，它是一类具有多向分化潜能和自我复制能力的原始未分化细胞，是形成哺乳类动物的各组织器官的原始细胞。此外，干细胞具有再生各种组织器官潜在功能，所以，其在医学界又被称为“万用细胞”。也正是因为干细胞这一特点，使其成为了21世纪再生医学的基础，更是成为当前科技的前沿和热点。

干细胞的研究是继人类基因组大规模测序之后最具活力、最有影响和最有应用前景的生命学科研究领域之一。1999年末，干细胞研究被美国《科学》杂志评为1999年度世界十大科学之冠；在2000年，干细胞研究再次被《科学》杂志评为该年度世界十大科学成就之一。

组织工程是以干细胞研究为基础发展起来的，以研究干细胞增殖和分化机制的最终目的，即是应用干细胞治疗疾病。理论上来讲，干细胞可用于多种疾病的治疗，如糖尿病、心肌梗死、肝功能衰竭等。也正是干细胞这种潜在的价值，引起了各国学者研究探索的兴趣。

干细胞按照分化潜能大小大致可以分为三类：一.全能干细胞：全能干细胞具有形成完整个体的分化潜能，可直接克隆人体，如受精卵、胚胎干细胞等。二.多能干细胞：多能干细胞具有分化出多种组织细胞的潜能，但却失去了发育成完整个体的能力，可直接复制各种脏器和修复组织，如骨髓多能造血干细胞，它可分化出至少十二种血细胞。三.单能干细胞：单能干细胞，又称为专能干细胞，这类干细胞只能向一种类型或密切相关的两种类型的细胞分化，如上皮组织基底层干细胞、肌肉中的成肌细胞等。

2012年，我国的科研团队成功利用核移植和干细胞技术建立了小鼠孤雄单倍体胚胎干细胞系，这些单倍体胚胎干细胞不仅具有典型的小鼠胚胎干细胞特征和发育潜能，同时还能够代替精子完成受精并产生健康可育的小鼠。

这一成果不仅为获取遗传操作的动物模型提供了一种新的手段；同时也为哺乳动物生殖、遗传与发育调控机理研究提供了新的体系。孤雄单倍体胚胎干细胞和半半克隆小鼠的建立和获得途径。

随着对干细胞研究的愈加深入，人类寄希望于利用干细胞的分离和体外培养，在体外繁育出组织或器官，并通过组织或器官移植，实现对临床疾病的治疗。而且随着科学技术水平的不断进步，干细胞研究的不断深入，相信断臂重生等科幻能力也将成为可能。

角膜上皮损伤是指由于各种因素导致的角膜上皮屏障功能与完整性被破坏，引起角膜上皮细胞层部分或全层缺失的病理状态，重者可严重影响视功能。角膜上皮损伤的病因可分为先天性和后天性两大类，可以是局部因素或全身因素所致，如外伤、感染性损伤、泪膜功能异常、角膜神经功能异常、眼表炎性反应、眼睑或睑缘病变、角膜变性与内皮损伤、药物及其他配戴角膜接触镜者及全身代谢性疾病(如糖尿病)等。严重的角膜疾病需要通过手术的方法，去除病人混浊部分的角膜，用同样形状的健康透明的角膜来代替病变或损伤的角膜，以达到恢复视力或治疗角膜疾病的目的。

现有技术中角膜移植主要有三种方式，传统角膜移植、自体缘移植和异体缘移植，其主要特点如下：1.传统角膜移植主要用于治疗各种原因引起的中央角膜混浊，其优点在于术后角膜光学区透明，缺点是仅为中央φ6-7mm光学区移植，对于干细胞缺失者无效，角膜很快再混浊，另外需要长期的免疫抑制治疗。

自体缘移植的优点是不需要免疫抑制治疗，但健眼有发生干细胞缺失危险，且不能360°环状移植，效果受到一定的限制。

异体缘移植是目前比较成熟的治疗干细胞缺失的手术方法，但供体材料极为有限，治疗机会非常少；有免疫排斥，术后用药至少一年，费用很高。

随着干细胞技术的发展，近年来，人们提出了采用培养干细胞角膜进行移植的方法，如CORNEA 2000；19(4)：421-42中公开了Schwab IR等的采用生物工程组织代替病变角膜的方法，其中角膜皮膜的细胞培养是采用自体或亲属的角膜皮膜，以保存人羊膜(HAM)为载体，传代后在HAM上分化培养细胞，滋养细胞为3T3，采用KGM培养基，无血清培养。这种方法的缺点是虽然在3T3滋养细胞上培养细胞可大量增殖，但因用鼠细胞作滋养细胞而有异源污染危险；另外在羊膜上分化培养使干细胞数量减少，无法保证长期有效性。

现有技术中，针对角膜损伤治疗有很多方法，特别是采用干细胞对角膜进行治疗也有很多的形式。比如CN102952779A中公开了一种诱导人胚胎干细胞定向分化为角膜缘干细胞的培养方法，步骤如下：首先，采用DMEM/F12条件培养基培养人原代角膜缘干细胞，制备角膜缘干细胞条件培养基；然后，利用该角膜缘干细胞条件培养基联合IV型胶原体外培养诱导人胚胎干细胞定向分化为角膜缘干细胞。利用本发明的方法得到的角膜缘干细胞，经体外光学显微镜观察、电子显微镜观察、实时定量聚合酶链式反应、免疫荧光、流式细胞分析及克隆形成率测定等证实诱导细胞具有与正常角膜缘干细胞相似的形态和表型，并表现出良好的体外分化增殖能力，可体外传代4代以上，可以作为种子细胞用于制备角膜移植物。

CN1398644A中一种干细胞再生表层角膜，取胚胎角膜上皮或成人角膜缘上皮，剪碎后用含酶的消化液消化，终止消化后，离心制备单细胞悬液并用于培养；将单细胞悬液置于培养皿或培养瓶中，加入培养基在5％CO2、37℃条件下培养；培养细胞每2-3天换液一次，当细胞汇聚达80-90％时传代，第2-6代细胞直接传代至经过处理的羊膜上，同样培养条件再非分化培养8-20天后即得到可以作为移植治疗角膜疾病的材料的干细胞再生表层角膜。

CN106167790A提供人胚胎干细胞定向诱导分化为角膜内皮细胞的方法，包括人胚胎干细胞诱导分化为人神经嵴干细胞以及人神经嵴干细胞诱导分化为人角膜内皮细胞等步骤。本发明利用原代人角膜基质细胞培养上清液、人角膜内皮细胞培养上清液以及人晶状体细胞培养上清液作为条件培养基，通过向培养基中添加维甲酸和多种重组蛋白，结合三维培养和二维培养方法，模拟角膜内皮细胞发育进程诱导人胚胎干细胞定向诱导分化为人角膜内皮细胞，能够获得形态结构与正常人角膜内皮细胞相似的人角膜内皮细胞，体外传代培养结果显示其增殖能力与正常人角膜内皮细胞一致。

CN102952777A公开了一种人胚胎干细胞定向分化为角膜内皮细胞的诱导方法：在小鼠胚胎成纤维细胞饲养层上培养人胚胎干细胞，分选状态良好的人胚胎干细胞克隆团，接种于经丝裂霉素C处理过的人角膜基质成纤维细胞层上，培养7天，人胚胎干细胞分化成菊形团，将菊形团从人角膜基质成纤维细胞层分离移至培养瓶内，采用神经嵴干细胞培养基继续培养7天，流式细胞仪分选出人神经嵴干细胞，加入培养瓶内，采用人角膜内皮细胞条件培养基置于37℃、5％CO2孵箱内孵育培养，隔天换液，培养10天左右，即得角膜内皮细胞，其增殖能力类似正常人角膜内皮细胞,体外最多能传1～2代，可以作为种子细胞用于组织工程角膜构建及移植。

以上的方法虽然都可以转换为角膜细胞，但是转换的速度以及转换的成功率还有待提高。

发明内容

本发明一个目的是提供一种转基因的表皮干细胞的构建方法。该转基因的表皮干细胞可以促进表皮干细胞内基因的分化，能够促进向角膜上皮细胞的分化。

具体的转基因的表皮干细胞的构建方法为，利用基因工程技术，成功构建EEFSEC过表达载体，转染干细胞(NSCs)后获得基因工程化干细胞EEFSEC。EEFSEC过表达载体能安全、有效地对干细胞进行基因修饰，获得的基因工程化干细胞EEFSEC，不仅通过过表达EEFSEC提升了干细胞的抗凋亡及生存能力，增加有效存活干细胞数量，提高干细胞向角膜分化效率的效果；

本发明的一个技术方案是提供一种基因工程化的干细胞的制备方法，包括以下步骤：

S1.合成基因EEFSEC，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；

S2.将基因EEFSEC插入表达载体，得到重组质粒；

S3.将重组质粒转染干细胞，得到基因工程化的干细胞。

优选地，表达载体为pIRESneo3载体。

最优选地，所述制备方法包括以下步骤：

S1.以化学合成方法合成基因EEFSEC，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；

S2.以步骤S1中合成的基因EEFSEC为模板，以SEQ ID NO：2-3所示核苷酸序列为引物，进行PCR扩增，扩增的到的片段经过回收纯化后与已经线性化的表达载体pIRESneo3进行连接反应，将载体转染干细胞，得到基因工程化的干细胞EEFSEC-干细胞。

本发明的一个技术方案是，将上述基因工程化的干细胞进行体外诱导向角膜上皮样细胞分化。

具体的，转基因的人表皮干细胞的体外诱导向角膜上皮样细胞分化的方法，取干细胞在6孔板中进行细胞爬片，细胞种植密度控制在5-9X 10⁴个/cm²，零添加的DMEM/F12培养液30摄氏度静饲3天。更换为角膜上皮细胞培养液，于孵箱中25摄氏度降温培养孵育，每2天半量换液，低温诱导，培养5天后即可。

其中角膜上皮细胞培养液组成为：每100mL角质细胞培养液(ScienCell)加入1mL100X CEpiCGS(Corneal Epithelial Cell Growth Supplement)角膜上皮细胞生长添加物5ml(ScienCell)，5pg/mL BSA，1pg/mL胰岛素，25ng/mL FGF，500ng/mL肾上腺素，0.5μg/mL氢化可的松，0.5nmo1/L前列腺素E2及30nmol/L的三碘甲状腺原氨酸，优选地，还含有角膜促进肽0.5μg/mL。角膜促进肽序列可以是QVYSRADSRNRAYWPPWHITPFVLPCY或RTQWWTKIAVWSMQRNHHHHALCWDWM或TTHGECWHWDYFMRRHHYMYMNKQKQT。

本发明的一个技术方案是提供一种角膜促进肽，其序列是QVYSRADSRNRAYWPPWHITPFVLPCY或RTQWWTKIAVWSMQRNHHHHALCWDWM或TTHGECWHWDYFMRRHHYMYMNKQKQT。

本发明的一个技术方案是上述角膜促进肽在用于促进人表皮干细胞的体外诱导向角膜上皮样细胞分化中的用途。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

人表皮干细胞向角膜上皮细胞分化，在现有技术中基本没有研究，或者即使有研究其技术背景也较为薄弱。本发明出人意料的提供一种诱导表皮干细胞向角膜上皮细胞的方法，该方法不需要像现有技术的细胞分化那样需要较为复杂的培养条件，只需要一步诱导，即可实现高效率的诱导效果，具有显著的提高。另外，发明人在通过大数据分析和基因库诱导筛选，分离得到了能够促进表皮干细胞向角膜上皮细胞分化的EEFSEC基因。通过，将EEFSEC过表达载体构建成功，并转入干细胞。EEFSEC过表达载体能安全、有效地对干细胞进行EEFSEC基因修饰，不仅能够增加干细胞的活性，还能够提高角膜上皮细胞的分化效率，具有极高的应用价值。另外，本发明还筛选获得了3个对分化有很好促进作用的角膜促进肽，通过在培养基中添加这些角膜促进肽，能够提高角膜上皮细胞的分化效率。

附图说明

图1是转基因阳性细胞克隆PCR结果图，其中箭头指示的1791bp左右的为EEFSEC基因大小。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明。

实施例1人表皮干细胞的分离

采用本领域常规的表皮干细胞分离方法进行分离，也可以直接采用商用的购买的表皮干细胞进行直接培养即可。

具体的，本发明展示其中之一的表皮干细胞的获得方法如下：

取健康男性包皮环切术后的包皮皮肤，制备表皮细胞和成纤维细胞。

1.表皮细胞的分离：取2cm长、2mm左右宽的皮肤，以含抗菌素的PBS清洗3次；置蛋白酶液中，4℃消化16小时；取出皮肤，剥离表皮与真皮层；收集表皮皮片，置0.25％胰酶/0.02％EDTA(1∶1)混合液中，37℃消化15分钟，终止消化，稍加吹打后过滤，收集细胞悬液，离心弃上清，加入新鲜培养液，重悬细胞，调整细胞浓度至1×10³/ml。

2.滋养层细胞的制备：收集上述表皮与真皮层剥离后的真皮皮片，置于625U/ml胶原酶液中，消化后收集成纤维细胞悬液，将成纤维细胞培养至铺展80％左右，加丝裂霉素C至终浓度为10-6mol/L，37℃孵育12小时取出，用0.25％胰酶37℃消化5分钟，终止消化，离心5分钟(1000r/分钟)，弃上清，重悬细胞，备用。

3.细胞外基质覆盖平皿的预备：在平皿内将上述表皮细胞培养至汇合13天；表皮细胞汇合后，吸去培养液，用无菌PBS清洗；加入乙二胺四乙酸(10mmol/L)和三羟甲基氨基甲烷盐酸(25mmol/L)和曲拉通(1％(w/v))混合液，37℃孵育(30分钟)至镜下可见细胞裂解；用PBS清洗；再加入0.5mg/ml变性的牛血清白蛋白，置37℃孵育1小时，以封闭非特异性粘附；PBS清洗，加入无血清培养液，置37℃孵箱至应用。

4.表皮干细胞的筛选及培养：取预备好的覆盖有细胞外基质的平皿，加入2ml表皮细胞悬液，37℃培养10分钟取出，吸弃液体，PBS清洗至无细胞悬浮，贴壁细胞为表皮干细胞。加入滋养层细胞(4×10³/cm²)，用KSC培养液培养，第2天换液，后每3天换液一次。其中KSC培养液含5％胎牛血清和1ng/ml碱性成纤维生长因子。

5.传代培养：上述表皮干细胞长至汇合，以0.25％胰酶/0.02％EDTA(1∶1)混合液，37℃消化6分钟，终止消化；收集细胞悬液入离心管，离心5分钟，弃上清，加入新鲜培养液，重悬细胞，以2×105/ml的密度接种于预先铺加有滋养层细胞的培养瓶中，置37℃、5％CO2孵箱中培养，之后，经过免疫组化检测结果：细胞β1整合素100％表达、角蛋白19有98.5％表达，角蛋白10、抗波形丝蛋白阴性，确定获得了表皮干细胞。

实施例2人表皮干细胞的转基因制备

首先，根据EEFSEC基因，设计了上下游引物，具体引物如下(Ncol和Hindlll这连个酶切位点分别添加在引物上下游)：F1：atggcagggcggcgggtgaa(SEQ ID NO：2)；R1：tcagggagactgaaccatgc(SEQ ID NO：3)。以人基因组DNA模板，以F1和R1为引物进行PCR扩增，扩增体系和条件分别为：

PCR反应体系：终浓度为250μΜ的dNTP，10mMTris-Cl，pH8.0，50mM KCl,1.5mMMgCl2,2pM上游引物，2pM下游引物，2μl DNA，IU Taq DNA聚合酶，用ddH20补足至20μl；

PCR反应条件：94℃预变性5min，94℃变性30s，62.5℃复性35s，72℃延伸35s，40个循环，然后72℃延伸10min，最后4℃保温。

扩增结束后，取5μ1扩增产物进行琼脂糖胶分析。结果发现，在电泳分析时在1800bp左右有明显的PCR产物，通过胶回收，得到目的基因。

用Ncol和Hindlll进行双酶切,1％琼脂糖凝胶纯化回收目的DNA。同时,用Ncol和Hindlll双酶切p IRESneo3质粒片段,用1％琼脂糖凝胶纯化回收大片段,最后用T4DNA连接酶连接目的DNA和p IRESneo3片段,构建成重组表达质粒p IRESneo-EEFSEC,转化DH5α感受态,挑取阳性克隆，大量制备DNA后进行双酶切分析和DNA测序。通过测序发现和目的基因序列保持一致。载体构建成功。

细胞转染：按3×10²细胞/孔的量在6孔板中接种表皮细胞,37℃,5％CO₂培养箱培养过夜,至细胞密度约60％,进行细胞转染。转染质粒p IRES2neo-EEFSEC DNA量为4μg,转染48h后,将此转染细胞接种于浓度为400,600,800,1000(μg/ml)G418的DMEM/F12培养液,每3d更换一次G418DMEM/F12培养液,2周后可见抗性克隆出现。继续用半量G418培液培养2周后进行克隆的筛选。筛选到的克隆用无血清培养基继续培养并进行表达,72小时后收培养液上清,-80℃保存备用。

使用PCR方法对阳性克隆进行检测，结果如图1所示，可以扩增得到1791bp左右的目的基因，说明转染成功。

实施例3人表皮干细胞向角膜上皮细胞的诱导

分别取人表皮干细胞和实施例2得到的转基因的人表皮干细胞分别在6孔板中进行细胞爬片，细胞种植密度控制在6X 10⁴个/cm²的DMEM/F12培养液30摄氏度静饲3天。更换为角膜上皮细胞培养液，于孵箱中25摄氏度降温培养孵育，每2天半量换液，低温诱导，培养5天后即可。其中角膜上皮细胞培养液(不含角膜促进肽)组成为：每100mL角质细胞培养液(ScienCell)加入1mL 100X CEpiCGS(Corneal Epithelial Cell Growth Supplement)角膜上皮细胞生长添加物5ml(ScienCell)，5pg/mL BSA，1pg/mL胰岛素，25ng/mL FGF，500ng/mL肾上腺素，0.5μg/mL氢化可的松，0.5nmo1/L前列腺素E2及30nmol/L的三碘甲状腺原氨酸。其中角膜上皮细胞培养液(含角膜促进肽)组成为：每100mL角质细胞培养液(ScienCell)加入1mL 100X CEpiCGS(Corneal Epithelial Cell Growth Supplement)角膜上皮细胞生长添加物5ml(ScienCell)，5pg/mL BSA，1pg/mL胰岛素，25ng/mL FGF，500ng/mL肾上腺素，0.5μg/mL氢化可的松，0.5nmo1/L前列腺素E2及30nmol/L的三碘甲状腺原氨酸，角膜促进肽0.5μg/mL，角膜促进肽为QVYSRADSRNRAYWPPWHITPFVLPCY或RTQWWTKIAVWSMQRNHHHHALCWDWM或TTHGECWHWDYFMRRHHYMYMNKQKQT。其中针对转基因和非转基因的干细胞分别进行了含有3种促进肽以及不含促进肽的诱导条件进行诱导，相应的获得诱导后的角膜上皮细胞。以人骨髓间充质干细胞作为对照。

实施例4结果检测

将诱导后的角膜上皮细胞以CD200、SSEA4、ITGβ4作为细胞表面标志物，实施了FACS。可通过gating技术除去CD200阳性细胞，并在CD200阴性细胞中单独分离SSEA4阳性、ITGβ4阳性的细胞同时表达K12、p63、PAX6即为角膜上皮细胞。其中各方法的分化阳性细胞率(通过FACS分析最终细胞中具有角膜上皮细胞标志物的细胞占比)结果如下：

从以上结果可以看出，本发明的将表皮干细胞诱导分化为角膜上皮细胞的方法具有较高的转化率，其中加入的3种促进肽可以较好的提高转化率，而导入了基因的表皮干细胞能够加速刺激干细胞的分化，更好的提高的分化率。

实施例5分化后的角膜上皮细胞生长状况监测

将实施例4中的几种分化后的细胞以2*10²个/mL的数量接种于6孔板中贴壁培养2d，离心弃上清，洗涤，得到细胞进行细胞计数。结果如下：

从上述结果可以看出本发明诱导出的角膜上皮细胞具有较快的生长速率，比现有技术的角膜上皮细胞具有更快的生长速度。能够满足作为细胞模型等批量使用的要求。具有较好的医学应用前景。

实施例6角膜上皮细胞的软琼脂克隆形成实验

(1)用蒸馏水分别配制1.2％和0.8％两个浓度的低熔点琼脂糖液，高压灭菌后，维持在40℃的水浴中保证其不凝固。

(2)按照1:1的比例使1.2％的琼脂糖和2X DMEM或2X HL培养基(含有2X抗生素和20％的小牛血清)在无菌离心管中混匀，取3mL混合液注入6孔板中，冷却凝固，作为底层琼脂置37℃，5％C02培养箱中备用，每株细胞做三个复孔。

⑶再按照1:1的比例使0.8％的琼脂糖和2X DMEM或2X HL培养基在无菌离心管中混匀，再向管内加入2mL的细胞悬液(琼脂糖和2X DMEM混合液中加入含有HeLa细胞的琼脂糖细胞悬液，琼脂糖和2XHL培养基中加入含有前述各个条件制备得到的角膜上皮细胞的细胞悬液)，六孔板中每孔加3X 10⁴个细胞，充分混匀，注入铺有1.2％琼脂糖底层平皿中，形成双琼脂层。待上层琼脂凝固后，置入37℃，5％CO₂培养箱中培养30天。

⑷把平皿放置在倒置显微镜下，观察细胞克隆的形态与细胞的致瘤性。

HeLa细胞和角膜上皮细胞在软琼脂中的生长状态显示，HeLa细胞能在软琼脂中形成较大的细胞克隆，而人正常角膜上皮细胞在软琼脂中则不能形成克隆。说明本发明制备得到的角膜上皮细胞在体外无异常增殖和致瘤性，为正常细胞。

最后所应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围。

序列表

<110> 洛阳轩智生物科技有限公司

<120> 人表皮干细胞诱导为角膜上皮细胞的方法

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1791

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 1

atggcagggc ggcgggtgaa cgtgaacgtg ggcgtgctgg gccacatcga cagcggcaag 60

acggcgctgg cgcgggcgct aagcaccaca gcctccaccg ccgcctttga caagcagccg 120

cagagccgcg agcgcggcat cacgctcgat ctgggcttct cgtgcttctc ggtgccgctg 180

cccgcgcgcc tgcggtcgtc tttgcccgag ttccaggcag cgcccgaggc cgagcccgag 240

cccggcgagc cactgcttca ggtcacgctg gtcgactgcc ccgggcacgc ctccctcatc 300

cggaccatca tcggcggggc ccagatcatt gatctgatga tgctggtcat cgatgtgacc 360

aaggggatgc agacccagtc agcggaatgc cttgtgatcg gccagattgc ctgccagaag 420

ctggtcgtgg tgctgaacaa aatagacctc ttacctgaag gaaagagaca ggcagcaatt 480

gataaaatga ccaagaaaat gcagaagacc ctagagaaca ccaagttccg aggtgcaccg 540

attatacccg tggcggccaa gccgggggga ccagaggccc ccgaaactga agctccacag 600

ggcattccag agctcattga gctcctgacg tcccagattt ccatcccaac gagagatccc 660

tcgggaccgt tcctcatgtc tgtggaccac tgtttctcca tcaaaggcca aggcactgtg 720

atgacaggga ccatcctttc aggctccatc agcctcggtg acagtgtgga gatccctgcc 780

ctcaaggtgg tgaagaaggt gaagtccatg cagatgttcc acatgcccat cacttcagcc 840

atgcaaggag accggctggg catctgcgtc acccagtttg accctaagct gctggagcgc 900

gggttggtgt gtgcccccga gtccctgcac actgtccatg cggccctcat ctctgtggaa 960

aagataccgt atttccgggg gcccctgcaa accaaggcca agttccacat tacagtgggc 1020

catgaaacag tcatgggccg gttgatgttc ttcagtcctg ctccagataa ctttgaccag 1080

gagcctatac tggactcttt caacttctct caagaatacc ttttccagga gcagtacctg 1140

tccaaggatt tgacaccagc agtgacagac aatgatgagg ccgacaagaa ggccggccag 1200

gccacagagg gccattgtcc tcggcagcag tgggccctgg tggagtttga gaagcccgtc 1260

acctgccctc ggctgtgcct ggtgattggc tccaggctag atgcggacat tcacaccaac 1320

acgtgccggc tagccttcca tggcatcctg ctccacgggc tagaggacag gaactacgcc 1380

gacagcttcc tgcccaggct gaaggtgtac aagctgaagc acaagcatgg ccttgtggag 1440

cgggcgatgg atgactacag tgtgatcggc cgctccctgt tcaaaaagga aaccaacatc 1500

cagctcttcg tggggctcaa ggtgcacttg tccactgggg aactgggcat catcgacagt 1560

gccttcggcc agagcggcaa gttcaagatc cacatcccag gtggcctcag ccccgagtcc 1620

aagaagatcc tgacacccgc cctcaagaag cgggcccggg ctggccgtgg ggaggccacc 1680

aggcaggagg agagcgccga gcggagcgag ccctcacagc atgtggtgct cagcctgact 1740

ttcaagcgtt atgtcttcga cacccacaag cgcatggttc agtctccctg a 1791

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 2

atggcagggc ggcgggtgaa 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 3

tcagggagac tgaaccatgc 20

<210> 4

<211> 27

<212> PRT

<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 4

Gln Val Tyr Ser Arg Ala Asp Ser Arg Asn Arg Ala Tyr Trp Pro Pro

1 5 10 15

Trp His Ile Thr Pro Phe Val Leu Pro Cys Tyr

20 25

<210> 5

<211> 27

<212> PRT

<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 5

Arg Thr Gln Trp Trp Thr Lys Ile Ala Val Trp Ser Met Gln Arg Asn

1 5 10 15

His His His His Ala Leu Cys Trp Asp Trp Met

20 25

<210> 6

<211> 27

<212> PRT

<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 6

Thr Thr His Gly Glu Cys Trp His Trp Asp Tyr Phe Met Arg Arg His

1 5 10 15

His Tyr Met Tyr Met Asn Lys Gln Lys Gln Thr

20 25

Claims

1.一种角膜促进肽，其特征在于：其能用于促进人表皮干细胞的体外诱导向角膜上皮样细胞分化。

2.如权利要求1所述的一种角膜促进肽，其特征在于：其序列如QVYSRADSRNRAYWPPWHITPFVLPCY或RTQWWTKIAVWSMQRNHHHHALCWDWM或TTHGECWHWDYFMRRHHYMYMNKQKQT任一所示。

3.一种人表皮干细胞的体外诱导向角膜上皮样细胞分化的方法，其特征在于取人表皮干细胞在6孔板中进行细胞爬片，细胞种植密度控制在5-9 X 10⁴个/cm²，零添加的DMEM/F12培养液30摄氏度静饲3天，更换为角膜上皮细胞培养液，于孵箱中25摄氏度降温培养孵育，每2天半量换液，低温诱导，培养5天后即可，其中角膜上皮细胞培养液组成为：每100mL角质细胞培养液(ScienCell)加入1mL 100X CEpiCGS角膜上皮细胞生长添加物5ml，5pg/mLBSA，1pg/mL胰岛素，25ng/mL FGF，500ng/mL肾上腺素，0.5μg/mL氢化可的松，0.5nmo1/L前列腺素E2及30nmol/L的三碘甲状腺原氨酸，权利要求1-2任一项所述的角膜促进肽0.5μg/mL。

4.权利要求1-2任一项所述的角膜促进肽在用于促进人表皮干细胞的体外诱导向角膜上皮样细胞分化中的用途。