CN109504685A - E93基因及其dsRNA在害虫防治中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种昆虫E93基因全长cDNA序列及其dsRNA在害虫防治中的应用。具体为通过生物信息学方法，从飞蝗转录组数据库中获取序列为SEQ ID NO：1的E93基因全长cDNA序列。依据SEQ ID NO：1，设计并合成该基因的dsRNA，将其注射进入飞蝗体腔后可以特异性沉默靶标基因，从而使飞蝗生长发育受阻导致死亡。多次实验表明其致死率达到100%。由于本发明的特异性及高效的致死率，对于害虫防治具有重要的现实意义，可以为害虫防治提供新的途径。

Description

E93基因及其dsRNA在害虫防治中的应用

技术领域

本发明涉及生物技术及农业害虫防治领域。具体涉及飞蝗E93基因及其dsRNA在害虫防治中的应用。

背景技术

飞蝗Locusta migratoria，是一种洲际性的农业害虫，主要分布于亚、欧、非、澳四大洲。它具有暴发性、群集性和迁飞性的特点，一旦发生，不仅涉及面广，而且来势凶猛，致灾严重。目前在蝗虫防治工作中，仍以化学杀虫剂为主要手段，化学杀虫剂的大量使用，不仅容易导致昆虫产生抗药性，并且给生态环境带来严重污染，对人类的健康也构成威胁，因此研发绿色新型农药对我国防治蝗虫工作具有重要意义。

RNA干扰（RNAi）是一种由双链RNA分子引起的特异性转录后基因沉默的现象，自2006年获得诺贝尔奖以来，RNAi技术一直跻身于科技前沿。RNAi不仅是研究基因功能的有力工具，同时在害虫防治方面也具有极大潜力。通过RNAi进行害虫防治具有如下特点：1）杀虫具有专一性，对非靶标生物无杀伤作用；2）RNA在自然界极易降解，无残留；3）对环境无毒无害，相对安全。目前国际上已将基于RNAi的害虫防治称为第四代杀虫剂。筛选和鉴定对害虫生长发育至关重要的基因是应用RNAi技术开发新型杀虫剂的关键环节，因为不是所有的dsRNA都能有效的沉默靶基因的表达，也不是所有的dsRNA都能杀死害虫

E93是昆虫变态发育的关键转录因子之一，采用RNA干扰技术，本课题组首次证实注射飞蝗E93基因dsRNA至5龄若虫后出现100%致死现象。因此，E93基因可作为基于RNAi的害虫防治技术的高致死靶标基因。

发明内容

本发明的目的提供一种昆虫E93基因全长cDNA序列及其dsRNA在致死飞蝗中的应用。

本发明提供一种飞蝗E93基因全长cDNA序列，其核苷酸序列为SEQ ID NO：1。该基因全长cDNA序列是基于飞蝗转录组数据库搜索获得，该核苷酸长度为3378 bp，其核苷酸序列为SEQ ID NO：1。

本发明提供飞蝗E93基因dsRNA在害虫防治中的应用，基于飞蝗E93基因cDNA序列，通过primer premier 5.0 软件设计含有T7启动子的上游引物和下游引物，通过PCR扩增获得两端为T7启动子的模板。试剂盒纯化后按照T7 RiboMAX™ Express RNAi System（Promega）试剂盒说明体外转录合成dsRNA。通过微量注射器将合成的dsRNA注射进入飞蝗体腔内。结果表明：注射dsRNA后飞蝗E93基因的mRNA表达显著降低，飞蝗出现生长发育受阻并导致100%的死亡。

附图说明

图1： 注射E93基因的dsRNA进入5龄飞蝗体内后对E93基因mRNA表达的影响。β-actin为内参基因。其中*P<0.05。

图2：注射E93基因的dsRNA对5龄飞蝗若虫生长发育的影响。注射E93基因的dsRNA飞蝗出现生长发育受阻并导致100%的死亡。A：左侧为注射水的对照，右侧为注射SEQ IDNO：2合成的dsRNA，即dsLmE93。

具体实施方式

实施例一：飞蝗E93基因全长cDNA及基因片段的获得

基于飞蝗的转录组数据库，采用生物信息学方法对飞蝗E93基因进行搜索，获得飞蝗E93基因（LmE93）全长cDNA序列，采用primer premier 5.0 软件设计上下游引物用于验证全长cDNA序列，并送往上海英潍捷基生物有限公司合成。选取生长健康，大小一致雌雄各半的5龄飞蝗若虫3头，在体式显微镜下将其体壁快速解剖下来，并冷冻于液氮中。依照TaKaRaRNAiso Plus试剂盒提取RNA。采用Reverse Transcriptase M-MLV (RNase H-)说明书将所提RNA反转录成第一链cDNA，以此做为模板，结合设计的上下游引物，通过PCR扩增LmE93基因全长序列。将得到的产物进行纯化、克隆转化到大肠杆菌中，并送往上海英潍捷基生物有限公司进行测序，其序列为SEQ ID NO：1。

实施例二：飞蝗E93基因特异性dsRNA合成

1）飞蝗E93基因dsRNA引物的设计

基于飞蝗E93基因全长cDNA序列，采用primer premier 5.0 软件设计dsRNA引物，其序列分别为SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4。上下游引物均携带T7启动子序列。所有引物均由上海英潍捷基生物有限公司合成。

2）飞蝗E93基因dsRNA的合成

以上述序列为SEQ ID NO：1的E93基因提取质粒为模板，SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4做为上下游引物，进行PCR扩增。将扩增的PCR产物，其序列为SEQ ID NO：2，经FastPure GelDNA Extraction Mini Kit（Vazyme）试剂盒纯化后按照T7 RiboMAX™ Express RNAiSystem（Promega）试剂盒说明体外转录合成dsRNA。 使用 NANODROP 2000（Thermoscientific）进行定量，使其终浓度达到2 μg/μL。保存于-80℃超级低温冰箱备用。

实施例三：飞蝗E93基因dsRNA致死飞蝗实验

1、飞蝗E93基因dsRNA的注射

选取生长健康、大小一致、雌雄各半共48头5龄2天若虫进行实验组dsLmE93基因的注射，用于观察表型。将合成的dsLmE93使用微量注射器将5 µL（10 μg dsLmE93）轻轻注射进入若虫侧腹部的二、三腹节之间。同时注射相同体积水至对照组（48头，雌雄各半）。另选取生长健康、大小一致共9头5龄2天若虫进行实验组dsLmE93基因的注射，用于检测基因的沉默效率，同时注射相同体积水至对照组（9头）。将注射后飞蝗置于人工气候箱中饲养（光照：黑暗时间=14 h: 10 h，温度30±2 ℃，湿度60％），每天饲喂新鲜小麦幼苗和麦麸。

2、飞蝗E93基因沉默检测

分别收集注射水和dsLmE93 48 h后若虫虫体进行总RNA提取，对照和注射dsLmE93组各3个生物学重复，每个生物学重复3头试虫，并反转录成第一链cDNA，采用RT-qPCR方法分别检测目的基因（LmE93）和管家基因（β-actin）的相对表达量，从而对其沉默效率进行计算。结果表明，与对照组比较，注射dsLmE93组试虫LmE93基因表达显著降低（图1）。

3、注射E93基因dsRNA后若虫表型观察

5龄若虫注射dsLmE93后，对照组虫体全部成功蜕皮至成虫，且蜕皮后成虫发育状态良好。与对照组比较，注射dsLmE93后试虫先于对照24 h开始下一次蜕皮，当对照组成虫雌雄抱对产卵时，注射dsLmE93试虫又一次蜕皮，其中37.5%蜕皮前死亡，62.5%蜕皮困难而死亡，如图2所示。

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。

序列表

<110> 山西大学

<120> E93基因及其dsRNA在害虫防治中的应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 3378

<212> DNA

<213> 飞蝗(Locusta migratoria)

<400> 1

atggcggagt gctcctatgc tcgctgtgtt caggagcgcc gagcaatcaa aaaagagctg 60

caaagatgga cgaagaatat ggttttcgta gtaggtttgg aacgggtagc ggaggagtta 120

atgggcagaa gaaaatggaa acattatcaa gagtcagttt tgagaagtag accgcaagta 180

gagcaagaac ctagcagtag cgactggcaa gttgaagaca aatgctgctt ttgcgacggt 240

gggatgttcc taagaccagc aacaagtcca cagtcagaca gctgcagtag ctccaacagt 300

cacagcagtt ttcacgaaac tacatcagcg gtggcagcag acaattcacc tcccaggctg 360

gcgatgacaa cactcgagcc ggtcacgtcg ctggccgcgt ctctggcagc tatcgctacc 420

tacagcccgg ggcccacgca gggccagaga caggggcact ccgcaatggc aaccacccct 480

ccagcaggcc tctctctgta ccctccagta gcacgccatc ggactcccac aggtctcttc 540

cccccgtggt atttatcgcc gacggcacct gctccaaatg ttcagtcgga cgggaagact 600

gatccagaaa cgccgcccgt cgtcgtatcc ctccccgcat ccacaccact gtcggtagcg 660

tcggcagcgg caagtgagca gcctttggac ttgagtgcca aagccaagga agaagcatct 720

gccccgagca cttcgccagt acctcagcct ttgggactgg cgactattag tttggacagc 780

aagcagatat tcaaggcaaa accaagaatg agtgcagtgg caggtcgaag gacatacacg 840

gaagaagagc ttcaggctgc tctgagagat atccagagtg gaaaattagg aactcgccgt 900

gcagctgtta tctatggtat accacgttcc acacttcgca acaaagtgta caaattggct 960

atggagcgtg aacgtgacgc acacttagtg gttcctacag tagaggaaag agacctatct 1020

ggtgctgagg atgagaagga agttgaacgt gctttaagtc gtcctcttct ttctgttgac 1080

gatcttctgc gattatctgt actagatggg gatgctctta gagtttttct ggaggaagtt 1140

tctgcaggac acaatcgtga agcaaatgag tcagcatctt ccccagtgtt tccacagtct 1200

agtgaacttt ggcatggtct agaacagggt ccattgggac cttacatttc ccatcttttg 1260

gtatctggaa gtgttcaaga ttcttgccaa gctgaaagtg gaggttcgct tccaaaattt 1320

acttcccctc ttctcccaga acttgtccga cgtatgatgg cagaagaaca gcagcaacaa 1380

atcaagaagc aaggcagtgc cggtaatttg gaagcaaata caaaaataac attgaatggt 1440

gcttcagctg atgagataca gatgttaggt gacagcgaaa acagttctgg gccgccgaga 1500

gttccatcta cagcgtctca aacggactct gtgacagcta caacaaaagt tggggaaaca 1560

gaggaatcat ctgatacaga tgctacggct tccacttcga gagttgccac tccaccaaat 1620

gtgatactga gaattccgtc ctttaaacca actacgaaaa atggtgtggc tactccggga 1680

agtggaagtg tgccttctgg tgaagtgcca ttccagactg ttggagttcc tgcatttcct 1740

ggccaggaat ctagtcatgt attgaacagc agcagtaaca acagcaatga gtcttgttca 1800

ccaccaacat ctaacctagt aggaaaaggg attggtgtta gtttacgtga tgttatagcc 1860

aaaagcatta gtcagaagtt tcagccaact gatcttccaa tgtcacagaa gctcttacta 1920

tcagcagatg aacaaccccc ttttaagaga gttcgttgta cacctccttt aaatacaaat 1980

atctcaccat gtactataaa acacaacaac aacaacaata acactaatgt tgatgataaa 2040

aataagacat cgtctacaag tggaaaagct tcatcaaatt ctactggcaa agggacgcgg 2100

ccaaaacgtg ggaaataccg taattatgac cgggatagtt tggtggaagc tgtcagagca 2160

gtgcagaggg gtgaaatgag tgtccatcgt gcaggatcgt actatggtgt tccacattca 2220

acattagaat acaaggtgaa ggagagacat ttgatgagac ctcggaagag agagcccaag 2280

caacaacagt ctgatgaagt taaaagaaaa gaggaatctg ggccttctgt tccaaggagt 2340

acagcaacat cctcatcagc actggcaaat gataaattaa aaactttgcc taaacctcct 2400

aagactgcat ataattcatc tgccccaatg cctggtgcac caaatggtct gaaaatacca 2460

cctttgtttg atcccagttt atctcttgca gcatatgcta acgttacaac agcttttcca 2520

ttttggcctg gtccttttca tgccttacca gttccagatt ttgccactcc tgctggtagt 2580

tttcctccaa atcctgaaca tttctttgct ccacaaatga tacacaggct acaagatgaa 2640

gctaggtctg tacctcgaac aagcccctct tcagtagtcc ctcctcttgg gaaaactgca 2700

cgagaaatgg cagcatcttt gtatgatgga acaggagcta atggtaactt ccttgacgga 2760

ataattcgtt caagtcttga gatgggcttg ccatcatctt cacccaaaga aggcagtaca 2820

ggtgtgggaa acagtggaaa aatgtctaac aaagcactca tcgaccagct ttgtcgcaat 2880

agttgtgtca ctcctctgcc caaagctccg acgcctttca gtacgaaaga ttgtagtacc 2940

agtgtaaata gtgaggatga ggaaactgta aagcaggaaa gtgttgttca ggataagact 3000

gtagaatctg tgtctccttc agaacctgta gttgatctat caaattcatc cagtggcctg 3060

ccagaacatg actgtagaat agatagtgaa catattactt caatttcgga tgaaaaaaat 3120

agcaaggaca gtgttttgtc actgtcagat gtgcactgtg tgacacaaaa cgaagataat 3180

tctgcattat ttgctaaaga ttcaagtgaa tttcataaag aaaaagttca taatccaact 3240

gatgaaagtg cctgtgatag taaaactgtt aaaaatcttg gtgatattga agctgccaaa 3300

gacttacttc ctaaagaaga aggcaatgaa gattctgaac aaactgagga taccaaatca 3360

atgacggtca actcatag 3378

<210> 2

<211> 497

<212> DNA

<213> 飞蝗(Locusta migratoria)

<400> 2

ccccagtgtt tccacagtct agtgaacttt ggcatggtct agaacagggt ccattgggac 60

cttacatttc ccatcttttg gtatctggaa gtgttcaaga ttcttgccaa gctgaaagtg 120

gaggttcgct tccaaaattt acttcccctc ttctcccaga acttgtccga cgtatgatgg 180

cagaagaaca gcagcaacaa atcaagaagc aaggcagtgc cggtaatttg gaagcaaata 240

caaaaataac attgaatggt gcttcagctg atgagataca gatgttaggt gacagcgaaa 300

acagttctgg gccgccgaga gttccatcta cagcgtctca aacggactct gtgacagcta 360

caacaaaagt tggggaaaca gaggaatcat ctgatacaga tgctacggct tccacttcga 420

gagttgccac tccaccaaat gtgatactga gaattccgtc ctttaaacca actacgaaaa 480

atggtgtggc tactccg 497

<210> 3

<211> 40

<212> DNA

<213> 飞蝗(Locusta migratoria)

<400> 3

taatacgact cactataggg ccccagtgtt tccacagtct 40

<210> 4

<211> 40

<212> DNA

<213> 飞蝗(Locusta migratoria)

<400> 4

taatacgact cactataggg cggagtagcc acaccatttt 40

Claims (6)

1.一种飞蝗E93基因，其特征是核苷酸序列为SEQ ID NO：1的序列。

2.一种飞蝗E93基因片段，其特征是核苷酸序列为SEQ ID NO：2的序列。

3.如权利要求2所述的一种飞蝗E93基因片段SEQ ID NO：2合成的dsRNA。

4.如权利要求3所述飞蝗E93基因的dsRNA在飞蝗防治中的应用。

5.如权利要求4所述飞蝗E93基因的dsRNA在飞蝗防治中的应用，其特征是：所述dsRNA制备成喷洒式杀虫剂，或者dsRNA制备成饵剂，或者将dsRNA转入飞蝗摄食植物体。

6.如权利要求3所述dsRNA的获得方法，步骤为：根据SEQ ID NO：1设计的上游引物SEQID NO：3和下游引物SEQ ID NO：4，通过PCR扩增获得SEQ ID NO：2，其产物含有T7启动子；产物经纯化后按照T7 RiboMAX™ Express RNAi System（Promega）试剂盒说明体外转录合成dsRNA。