CN109486975A - 鼠伤寒沙门氏菌的分子分型方法和特异snp位点组合 - Google Patents

鼠伤寒沙门氏菌的分子分型方法和特异snp位点组合 Download PDF

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Abstract

本发明公开了鼠伤寒沙门氏菌的分子分型方法和特异SNP位点组合。本发明提供了检测待测鼠伤寒沙门氏菌的基因组中16个SNP位点核苷酸的物质在制备检测或辅助检测鼠伤寒沙门氏菌分子分型情况产品中的应用；或，检测待测鼠伤寒沙门氏菌的基因组中16个SNP位点核苷酸的物质在对待测鼠伤寒沙门氏菌进行分子分型中的应用；本发明的实验证明，本发明针对临床常见的血清型鼠伤寒沙门氏菌，研发样本量超过6000株，进行分子分型，得到用于分子分型的SNP位点集合，用该集合可以设计相应探针，在实验上对鼠伤寒沙门氏菌进行快速分型，时间短，耗材低；另外，鼠伤寒沙门genotyping难度大于伤寒沙门氏菌，因此，研发出一套针对鼠伤寒沙门的分子分型技术极具价值。

Description

鼠伤寒沙门氏菌的分子分型方法和特异SNP位点组合
技术领域
本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种鼠伤寒沙门氏菌的分子分型方法和特异SNP位点组合。
背景技术
目前，病原菌分子分型技术有PFGE、变性凝胶电泳、质粒DNA图谱分型技术、核糖体分型、扩增片段长度多态、Rep-PCR和DNA测序技术分型等，其中，基于测序技术的分型方法中，发展较快的有单一位点测序分型(SLST)和多位点测序分型(MLST)，最早用于脑膜炎奈瑟球菌的毒株分型，现已广泛应用于金黄色葡萄球菌、肠球菌和肺炎链球菌等病原菌的分型。理论上使用全基因组测序技术进行分子分型的分辨率大大高于PFGE、Rep-PCR等技术的分辨率，但目前基于测序位点的分型方法比使用全基因组PFGE的分型技术比分辨率较低，需要找出基于全基因组SNP位点(wgSNP)进行快速、准确的分型，使分辨率大大提高。
wgSNP是在全基因组序列的水平上选择一定数目的SNP，比较不同细菌基因组中SNP的信息，从而达到将同一个种内的不同菌株进行分型的目的。wgSNP基于基因组重测序的方法进行，可以根据参考序列进行比对搜索SNP，也可以不根据参考序列只在样本之间进行两两或者多重比对搜索SNP，根据不同个体间的所有SNP或者经过一定条件筛选后的SNP(剔除疑似的重组)进行比对，从而实现分型。wgSNP已被用于多起传染病暴发事件中分离菌株的分型和分子流行病学分析。
目前wgSNP运用于伤寒沙门氏菌分析，具体为将覆盖六十多个国家的约两千株菌株，基于系统发育和群体结构对伤寒沙门氏菌进行分组(16个clades和49个subclades)，各组随机筛选1个特异SNP，达到68个精简SNP区分65个分组，从而对伤寒沙门氏菌进行分型(图1)。现有技术仅针对伤寒沙门氏菌，且使用菌株不到2000株，构建位点集所使用的数据量少，数据来源不齐全，沙门氏菌有2500个血清型，不同血清型的致病类型和机制，传播分布均有很大差异，仅针对一个血清型---伤寒沙门氏菌，使用菌株不到2000株，且缺少中国的菌株数据；后续使用旅行后携带沙门氏菌的人群分离菌株进行验证，且验证通过率仅在71％(95％置信值)，敏度和特异度低；而且仅用组特异SNP进行识别各分组，无法解决由于变异引起的SNP不匹配导致无法分型。
发明内容
为了对鼠伤寒沙门氏菌进行分子分型，本发明筛选到了16个SNP位点作为检测位点，用这16个SNP位点对鼠伤寒沙门氏菌分成15个分子分型型别。具体如下：
本发明一个目的是提供检测待测鼠伤寒沙门氏菌的基因组中16个SNP位点核苷酸的物质的用途。
本发明提供了检测待测鼠伤寒沙门氏菌的基因组中16个SNP位点核苷酸的物质在制备检测或辅助检测鼠伤寒沙门氏菌分子分型情况产品中的应用；
或，检测待测鼠伤寒沙门氏菌的基因组中16个SNP位点核苷酸的物质在对待测鼠伤寒沙门氏菌进行分子分型中的应用；
所述16个SNP位点为如下：
76338位点，该位点为鼠伤寒沙门氏菌NC_016810.1染色体76338物理位置的SNP位点；该位点的多态形式为G/A；
114468位点，该位点为鼠伤寒沙门氏菌NC_016810.1染色体114468物理位置的SNP位点；该位点的多态形式为T/C；
845276位点，该位点为鼠伤寒沙门氏菌NC_016810.1染色体845276物理位置的SNP位点；该位点的多态形式为T/C；
207875位点，该位点为鼠伤寒沙门氏菌NC_016810.1染色体207875物理位置的SNP位点；该位点的多态形式为G/A；
719622位点，该位点为鼠伤寒沙门氏菌NC_016810.1染色体719622物理位置的SNP位点；该位点的其他多态形式为G/T；
178930位点，该位点为鼠伤寒沙门氏菌NC_016810.1染色体178930物理位置的SNP位点；该位点的多态形式为T/C；
525595位点，该位点为鼠伤寒沙门氏菌NC_016810.1染色体525595物理位置的SNP位点；该位点的多态形式为A/G；
302985位点，该位点为鼠伤寒沙门氏菌NC_016810.1染色体302985物理位置的SNP位点；该位点的多态形式为T/C；
111877位点，该位点为鼠伤寒沙门氏菌NC_016810.1染色体111877物理位置的SNP位点；该位点的多态形式为C/T；
151916位点，该位点为鼠伤寒沙门氏菌NC_016810.1染色体151916物理位置的SNP位点；该位点的多态形式为T/C；
165413位点，该位点为鼠伤寒沙门氏菌NC_016810.1染色体165413物理位置的SNP位点；该位点的多态形式为A/G；
668906位点，该位点为鼠伤寒沙门氏菌NC_016810.1染色体668906物理位置的SNP位点；该位点的多态形式为T/C；
153823位点，该位点为鼠伤寒沙门氏菌NC_016810.1染色体153823物理位置的SNP位点；该位点的多态形式为T/C；
276334位点，该位点为鼠伤寒沙门氏菌NC_016810.1染色体276334物理位置的SNP位点；该位点的多态形式为G/A；
99426位点，该位点为鼠伤寒沙门氏菌NC_016810.1染色体99426物理位置的SNP位点；该位点的多态形式为A/C；
24555位点，该位点为鼠伤寒沙门氏菌NC_016810.1染色体24555物理位置的SNP位点；该位点的多态形式为T/C。
或，本发明提供了检测待测鼠伤寒沙门氏菌的基因组中16个SNP位点核苷酸的物质在制备检测或辅助检测待测鼠伤寒沙门氏菌耐药性产品中的应用；
或，本发明提供了检测待测鼠伤寒沙门氏菌的基因组中16个SNP位点核苷酸的物质制备检测或辅助检测待测鼠伤寒沙门氏菌耐药性产品中的应用。
本发明的另一个目的是提供一种对待测鼠伤寒沙门氏菌进行分子分型的方法。
本发明提供的方法，包括如下步骤：
检测待测鼠伤寒沙门氏菌基因组中上述16个SNP位点核苷酸(16个SNP位点核苷酸都检测)，按照如下方式进行分子分型：
1)若所述待测鼠伤寒沙门氏菌基因组中76338位点的核苷酸为G，则所述待测鼠伤寒沙门氏菌属于4.4分子分型组；
2)若所述待测鼠伤寒沙门氏菌基因组中114468位点的核苷酸为T，且845276位点的核苷酸为T，则所述待测鼠伤寒沙门氏菌属于4.2分子分型组；
3)若所述待测鼠伤寒沙门氏菌基因组中114468位点的核苷酸为T，且845276位点的核苷酸不为T，则所述待测鼠伤寒沙门氏菌属于4分子分型组；
4)若所述待测鼠伤寒沙门氏菌基因组中207875位点的核苷酸为G，且719622位点的核苷酸为G，且178930位点的核苷酸为T，则所述待测鼠伤寒沙门氏菌属于China&IndiaMDR分子分型组；
5)若所述待测鼠伤寒沙门氏菌基因组中207875的核苷酸为G，且719622位点的核苷酸为G，且525595位点的核苷酸为A，则所述待测鼠伤寒沙门氏菌属于India MDR分子分型组；
6)若所述待测鼠伤寒沙门氏菌基因组中302985位点的核苷酸为T，则所述待测鼠伤寒沙门氏菌属于europe MDR分子分型组；
7)若所述待测鼠伤寒沙门氏菌基因组中111877位点的核苷酸为C，则所述待测鼠伤寒沙门氏菌属于3.5分子分型组；
8)若所述待测鼠伤寒沙门氏菌基因组中151916位点的核苷酸为T，则所述待测鼠伤寒沙门氏菌属于3.3分子分型组；
9)若所述待测鼠伤寒沙门氏菌基因组中165413位点的核苷酸为A，则所述待测鼠伤寒沙门氏菌属于3.1分子分型组；
10)若所述待测鼠伤寒沙门氏菌基因组中668906位点的核苷酸为T，则所述待测鼠伤寒沙门氏菌属于1.2分子分型组；
11)若所述待测鼠伤寒沙门氏菌基因组中153823位点的核苷酸为T，则所述待测鼠伤寒沙门氏菌属于3.2分子分型组；
12)若所述待测鼠伤寒沙门氏菌基因组中276334位点的核苷酸为G，则所述待测鼠伤寒沙门氏菌属于1.3分子分型组；
13)若所述待测鼠伤寒沙门氏菌基因组中99426位点的核苷酸为A，则所述待测鼠伤寒沙门氏菌属于1.5分子分型组；
14)若所述待测鼠伤寒沙门氏菌基因组中207875位点的核苷酸为G，且719622位点的核苷酸为G，且符合如下：178930位点的核苷酸不为T或且525595位点的核苷酸不为A；则所述待测鼠伤寒沙门氏菌属于2.3分子分型组；
15)若所述待测鼠伤寒沙门氏菌基因组中24555位点的核苷酸为T，则所述待测鼠伤寒沙门氏菌属于2.1分子分型组。
本发明还有一个目的是提供一种检测或辅助检测待测鼠伤寒沙门氏菌耐药性的方法。
本发明提供的方法，包括如下步骤：
检测待测鼠伤寒沙门氏菌基因组中上述16个SNP位点核苷酸，按照如下方式进行判断：
1)若所述待测鼠伤寒沙门氏菌基因组中76338位点的核苷酸为G，则所述待测鼠伤寒沙门氏菌属于中等耐药性；
2)若所述待测鼠伤寒沙门氏菌基因组中114468位点的核苷酸为T，且845276位点的核苷酸为T，则所述待测鼠伤寒沙门氏菌属于高等耐药性；
3)若所述待测鼠伤寒沙门氏菌基因组中114468位点的核苷酸为T，且845276位点的核苷酸不为T，则所述待测鼠伤寒沙门氏菌属于高等耐药性；
4)若所述待测鼠伤寒沙门氏菌基因组中207875位点的核苷酸为G，且719622位点的核苷酸为G，且178930位点的核苷酸为T，则所述待测鼠伤寒沙门氏菌属于高等耐药性；
5)若所述待测鼠伤寒沙门氏菌基因组中207875的核苷酸为G，且719622位点的核苷酸为G，且525595位点的核苷酸为A，则所述待测鼠伤寒沙门氏菌属于高等耐药性；
6)若所述待测鼠伤寒沙门氏菌基因组中302985位点的核苷酸为T，则所述待测鼠伤寒沙门氏菌属于高等耐药性；
7)若所述待测鼠伤寒沙门氏菌基因组中111877位点的核苷酸为C，则所述待测鼠伤寒沙门氏菌属于不耐药；
8)若所述待测鼠伤寒沙门氏菌基因组中151916位点的核苷酸为T，则所述待测鼠伤寒沙门氏菌属于不耐药；
9)若所述待测鼠伤寒沙门氏菌基因组中165413位点的核苷酸为A，则所述待测鼠伤寒沙门氏菌属于不耐药；
10)若所述待测鼠伤寒沙门氏菌基因组中668906位点的核苷酸为T，则所述待测鼠伤寒沙门氏菌属于中等耐药性；
11)若所述待测鼠伤寒沙门氏菌基因组中153823位点的核苷酸为T，则所述待测鼠伤寒沙门氏菌属于不耐药；
12)若所述待测鼠伤寒沙门氏菌基因组中276334位点的核苷酸为G，则所述待测鼠伤寒沙门氏菌属于不耐药；
13)若所述待测鼠伤寒沙门氏菌基因组中99426位点的核苷酸为A，则所述待测鼠伤寒沙门氏菌属于低等耐药性；
14)若所述待测鼠伤寒沙门氏菌基因组中207875位点的核苷酸为G，且719622位点的核苷酸为G，且符合如下：178930位点的核苷酸不为T或且525595位点的核苷酸不为A；则所述待测鼠伤寒沙门氏菌属于中等耐药性；
15)若所述待测鼠伤寒沙门氏菌基因组中24555位点的核苷酸为T，则所述待测鼠伤寒沙门氏菌属于中等耐药性。
上述检测待测鼠伤寒沙门氏菌的基因组中16个SNP位点核苷酸的物质和记载上述方法的可读载体在制备检测或辅助检测待测鼠伤寒沙门氏菌分子分型产品中的应用也是本发明保护的范围；
或，上述检测待测鼠伤寒沙门氏菌的基因组中16个SNP位点核苷酸的物质和记载上述方法的可读载体在制备检测或辅助检测待测鼠伤寒沙门氏菌耐药性产品中的应用也是本发明保护的范围。
本发明第4个目的是提供检测或辅助检测待测鼠伤寒沙门氏菌分子分型产品。
本发明提供的产品，包括上述检测待测鼠伤寒沙门氏菌的基因组中16个SNP位点核苷酸的物质；还包括记载上述检测或辅助检测待测鼠伤寒沙门氏菌分子分型方法的可读载体。
本发明第5个目的是检测或辅助检测待测鼠伤寒沙门氏菌耐药性产品.
本发明提供的产品，包括上述检测待测鼠伤寒沙门氏菌的基因组中16个SNP位点核苷酸的物质；还包括记载上述检测或辅助检测待测鼠伤寒沙门氏菌耐药性方法的可读载体。
本发明第5个目的是提供一种获得鼠伤寒沙门氏菌分子分型SNP集的方法。
本发明提供的方法，包括如下步骤：
1)从http://ncbi.nlm.nih.gov/网站和/或深圳疾病控制预防中心获得全球鼠伤寒沙门菌株的全基因组测序数据或样品，样品经处理测序得出fastq格式序列，将这些数据格式处理至fastq或fasta格式；
2)对传统检测出为鼠伤寒的沙门氏菌全基因组进行SeqSero软件预测血清型，筛除预测类型和表型不一致的数据，保留预测类型和表型一致的全球鼠伤寒沙门菌株的全基因组测序数据，得到来源于美洲、欧洲、非洲、澳大利亚和亚洲的6828株鼠伤寒沙门菌株全球菌株全基因组测序数据；
3)Call SNP和构建进化树
所述Call SNP为以鼠伤寒标准菌株的accession:NC_016810为参考序列，对所述2得到的6828株鼠伤寒沙门菌株全球菌株全基因组测序数据，用snippy pipeline构建变异位点集合，得到所有SNP位点；
所述构建进化树为将所述2)得到的6828株鼠伤寒沙门菌株全球菌株全基因组测序数据使用fasttree软件对所有菌株进行系统发育树构建；
4)建立分型分组和筛选保守SNP
所述建立分型分组为利用群体结构分析系统hierBAPS软件将6828株鼠伤寒沙门菌株所有菌株在clades和subclades水平上进行分组，对进化树的分支进行合理调整和分组；
所述筛选保守SNP为将所述3)获得的所有SNP位点按照如下4个标准进行筛选，得到保守SNP；
①保留同义突变SNP；
②通过abacas.1.3.1对6828株鼠伤寒沙门氏菌全球菌株所有全基因组测序数据进行序列对齐，进而利用gubbins软件得出重组区域并过滤重组区域SNP；
③RepeatMasker软件预测重复序列并去除重复序列中的SNP；
④进入PHAST网页预测噬菌体片段并去除噬菌体片段中的SNP；
5)筛选分组特异SNP，所述方法如下：
(1)从所述保守SNP中筛选具有分辨力的分组特异的单个SNP；
(2)若根据4)得到的各分组无法筛选出特异SNP的分组，通过该分组在对应的上一级分组中的特异SNP，与上一级分组的特异SNP组合，从而形成一套分组特异的层级组合SNP；
6)上述5)得到的分组特异的单个SNP和分组特异的层级组合SNP，经鼠伤寒沙门菌株基因组序列验证，根据特异性和灵敏度挑选一组特异性和灵敏度最高的SNP集，作为鼠伤寒沙门氏菌分子分型SNP集。
上述所述耐药性为低等耐药性、中等耐药性或高耐药；
或，所述低等耐药性为80％以上菌株对多种药中1-2种耐药；
所述中等耐药性为80％以上菌株对多种药中3-4种耐药；
所述高耐药性为80％以上菌株对多种药中5-6种耐药；
和/或，所述多种药具体为氯霉素、链霉素、甲氧苄氨嘧啶、氨苄青霉素、磺胺类和四环素。
上述中，所述物质均为：通过下述至少一种方法确定各组SNP位点组合的各位点核苷酸所用的试剂、芯片、试剂盒和/或仪器：DNA特异性杂交法或以PCR为基础的测序分型法。
本发明的实验证明，本发明针对临床常见的血清型鼠伤寒沙门氏菌，研发样本量超过6000株，进行分子分型，得到用于分子分型的SNP位点集合，用该集合可以设计相应探针，在实验上对鼠伤寒沙门氏菌进行快速分型，时间短，耗材低；另外，鼠伤寒沙门genotyping难度大于伤寒沙门氏菌，因此，研发出一套针对鼠伤寒沙门的分子分型技术极具价值。
附图说明
图1为伤寒沙门氏菌分型图。
图2为鼠伤寒沙门氏菌分子分型的流程图。
图3为全球鼠伤寒进化树圈图。
图4为全球鼠伤寒沙门氏菌可检索的分型组别。
图5为China&India高耐药分组。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、全球鼠伤寒沙门氏菌的分子分型及特异SNP位点组合的筛选
鼠伤寒沙门氏菌分子分型的流程图如图2所示，具体流程如下：
1、获取数据
从http://ncbi.nlm.nih.gov/网站获得6637株全球鼠伤寒沙门菌株的全基因组测序数据，将这些数据格式处理至fastq或fasta格式；从深圳疾病预防控制中心获得的191株鼠伤寒沙门氏菌DNA样品，经华大测序后得出fastq格式数据。
2、验证血清型
上述1获得的鼠伤寒沙门菌株的全基因组测序数据进行SeqSero软件预测血清型，筛除预测类型和表型不一致的数据，保留预测类型和表型一致的全球鼠伤寒沙门菌株的全基因组测序数据，得到来源于5大区块(美洲，欧洲，非洲，澳大利亚，亚洲)的6828株鼠伤寒沙门菌株全球菌株全基因组测序数据。
3、变异检索
Call SNP：
以鼠伤寒标准菌株(accession:NC_016810，提交日为2010年7月23日，更新日期为2018年1月12日)为参考序列，对上述2得到的6828株鼠伤寒沙门菌株全球菌株全基因组测序数据，用snippy pipeline构建变异位点集合，得到所有SNP位点。
4、构建进化树
将上述2得到的6828株鼠伤寒沙门氏菌全球菌株全基因组测序数据使用fasttree软件(使用-gtr和-gamma参数)对所有菌株进行系统发育树构建。
全球鼠伤寒进化树圈图如图3所示，最外圈热图从黑色块逆时针开始的四个色块指：clade1、clade2、clade3、clade4；中间圈为地理分布热图；最内圈为关注的耐药种类数量；进化树树枝根据右下方图注的二级分类组别进行着色。右上方图注为热图色块注释(耐药种类和大陆区块)。
使用的是CARD数据库进行耐药基因预测，http://arpcard.mcmaster.ca/download；数据库在集群路径：/ldfssz1/ST_INFECTION/F16ZQSB1SY3030_Salmonella/USER/lindechun/database/card/。
统计的耐药药物有氯霉素(Chloramphenicol，CHL)，链霉素(Streptomycin，STR)，甲氧苄氨嘧啶(Trimethoprim-sulfamethoxazole，TMP)，氨苄青霉素(Ampicillin，blaTEM-1B，AMP)，磺胺类(Sulfonamide，SUL)，四环素(Tetracycline，TET)。
5、建立分型分组
利用群体结构分析系统(hierBAPS软件，参数分别设置30,30)将6828株鼠伤寒沙门菌株所有菌株在clades和subclades水平上进行分组(取level1作为clade分类依据)，对进化树的分支进行合理调整和分组，基于进化树结构，各clade的次级分类借鉴level4下的分类进行确定和调整。
全球鼠伤寒沙门氏菌可检索的分型组别如图4所示，进化树树枝根据右下方图注的二级分类组别以不同颜色标记；内圈热图为关注的耐药种类数量，统计的耐药药物有氯霉素(Chloramphenicol，CHL)，链霉素(Streptomycin，STR)，甲氧苄氨嘧啶(Trimethoprim-sulfamethoxazole，TMP)，氨苄青霉素(Ampicillin，blaTEM-1B，AMP)，磺胺类(Sulfonamide，SUL)，四环素(Tetracycline，TET)；外圈热图为可检索区域，即专利请求保护的分组区域。
图5为China&India高耐药分组，用花括号标记的分支为subclade 2.3，中国和印度高耐药分支在在subclade 2.3中。
6、筛选保守SNP
将上述3获得的所有SNP位点按照如下4个标准进行筛选，得到保守SNP；
①保留同义突变SNP；
②通过abacas.1.3.1对6828株鼠伤寒沙门氏菌全球菌株所有全基因组测序数据进行序列对齐，进而利用gubbins软件得出重组区域并过滤重组区域SNP；
③RepeatMasker软件预测重复序列并去除重复序列中的SNP；
④进入PHAST网页预测噬菌体片段并去除噬菌体片段中的SNP。
7、筛选分组特异SNP
1)从上述6得出的保守SNP中筛选具有分辨力的分组特异的单个SNP；
2)若根据5得到的各分组无法筛选出特异SNP的分组，通过该分组在对应的上一级分组中的特异SNP，与上一级分组的特异SNP组合，从而形成一套分组特异的层级组合SNP。
8、训练集检验
上述7得到的分组特异的单个SNP和分组特异的层级组合SNP，经鼠伤寒沙门菌株基因组序列验证，根据特异性和灵敏度挑选一组高特异性和灵敏度的SNP集，作为鼠伤寒沙门氏菌分子分型SNP集，其结合芯片、PCR等分子诊断技术进行鼠伤寒沙门氏菌精细的分类和分子分型，该SNP集和其对应的分子分型(分支或子分支)为如下表1所示。
表1为全球鼠伤寒沙门氏菌分子分型各分组SNP组合
上述表2中，第1列为鼠伤寒沙门氏菌分子分型的子分支或分支名称(共15个子分支或分支)，第2列为第1列每个子分支或分支对应的菌株数量，第3列为第1列每个子分支或分支对应的特异SNP位点组合及对应位点的核苷酸，第4列为第1列每个子分支或分支的多耐药情况。
上述表1第3列中16个SNP位点，
76338:G表示鼠伤寒沙门氏菌NC_016810.1染色体76338物理位置的SNP位点，且该位点的核苷酸为G；该位点的多态形式为G/A；
114468:T表示鼠伤寒沙门氏菌NC_016810.1染色体114468物理位置的SNP位点，且该位点的核苷酸为T；该位点的多态形式为T/C；
845276:T表示鼠伤寒沙门氏菌NC_016810.1染色体845276物理位置的SNP位点，且该位点的核苷酸为T；该位点的多态形式为T/C；
207875:G表示鼠伤寒沙门氏菌NC_016810.1染色体207875物理位置的SNP位点，且该位点的核苷酸为G；该位点的多态形式为G/A；
719622:G表示鼠伤寒沙门氏菌NC_016810.1染色体719622物理位置的SNP位点，且该位点的核苷酸为G；该位点的多态形式为G/T；
178930:T表示鼠伤寒沙门氏菌NC_016810.1染色体178930物理位置的SNP位点，且该位点的核苷酸为T；该位点的多态形式为T/C；
525595:A表示鼠伤寒沙门氏菌NC_016810.1染色体525595物理位置的SNP位点，且该位点的核苷酸为A；该位点的多态形式为A/G；
302985:T表示鼠伤寒沙门氏菌NC_016810.1染色体302985物理位置的SNP位点，且该位点的核苷酸为T；该位点的多态形式为T/C；
111877:C表示鼠伤寒沙门氏菌NC_016810.1染色体111877物理位置的SNP位点，且该位点的核苷酸为C；该位点的多态形式为C/T；
151916:T表示鼠伤寒沙门氏菌NC_016810.1染色体151916物理位置的SNP位点，且该位点的核苷酸为T；该位点的多态形式为T/C；
165413:A表示鼠伤寒沙门氏菌NC_016810.1染色体165413物理位置的SNP位点，且该位点的核苷酸为A；该位点的多态形式为A/G；
668906:T表示鼠伤寒沙门氏菌NC_016810.1染色体668906物理位置的SNP位点，且该位点的核苷酸为T；该位点的多态形式为T/C；
153823:T表示鼠伤寒沙门氏菌NC_016810.1染色体153823物理位置的SNP位点，且该位点的核苷酸为T；该位点的多态形式为T/C；
276334:G表示鼠伤寒沙门氏菌NC_016810.1染色体276334物理位置的SNP位点，且该位点的核苷酸为G；该位点的多态形式为G/A；
99426:A表示鼠伤寒沙门氏菌NC_016810.1染色体99426物理位置的SNP位点，且该位点的核苷酸为A；该位点的多态形式为A/C；
24555:T表示鼠伤寒沙门氏菌NC_016810.1染色体24555物理位置的SNP位点，且该位点的核苷酸为T；该位点的多态形式为T/C。
其中，MDR(Multi-drug resistance)表示多重耐药，具体耐药种类如下：氯霉素(Chloramphenicol，CHL)，链霉素(Streptomycin，STR)，甲氧苄氨嘧啶(Trimethoprim-sulfamethoxazole，TMP)，氨苄青霉素(Ampicillin，blaTEM-1B，AMP)，磺胺类(Sulfonamide，SUL)，四环素(Tetracycline，TET)；
S表示80％以菌株上有0种耐药；
-表示80％以上菌株对多重耐药中1-2种耐药(低耐药性)；
pre-MDR表示80％以上菌株有3-4种耐药(中耐药性)；
MDR表示80％以上菌株有5-6种耐药(高耐药性)。
上述结果表明，本发明通过检测比对6828株鼠伤寒沙门氏菌全球菌株全基因组序列，得到15组不同分支或子分支的鼠伤寒沙门氏菌，且每一组鼠伤寒沙门氏菌具有特异的SNP位点组合；也就是15组特异SNP位点组合(表1第3列)，且每个组合形式的耐药情况也不同。
可根据上述15组特异SNP位点组合(表1第3列)对待测鼠伤寒沙门氏菌进行分子分型，具体方法如下：
检测待测鼠伤寒沙门氏菌基因组中16个SNP位点核苷酸，
按照如下方式进行分子分型：
1)若所述待测鼠伤寒沙门氏菌基因组中76338位点的核苷酸为G，则所述待测鼠伤寒沙门氏菌属于4.4分子分型组；
2)若所述待测鼠伤寒沙门氏菌基因组中114468位点的核苷酸为T，且845276位点的核苷酸为T，则所述待测鼠伤寒沙门氏菌属于4.2分子分型组；
3)若所述待测鼠伤寒沙门氏菌基因组中114468位点的核苷酸为T，且845276位点的核苷酸不为T；则所述待测鼠伤寒沙门氏菌属于4分子分型组；
4)若所述待测鼠伤寒沙门氏菌基因组中207875位点的核苷酸为G，且719622位点的核苷酸为G，且178930位点的核苷酸为T，则所述待测鼠伤寒沙门氏菌属于China&IndiaMDR分子分型组；
5)若所述待测鼠伤寒沙门氏菌基因组中207875的核苷酸为G，且719622位点的核苷酸为G，且525595位点的核苷酸为A，则所述待测鼠伤寒沙门氏菌属于India MDR分子分型组；
6)若所述待测鼠伤寒沙门氏菌基因组中302985位点的核苷酸为T，则所述待测鼠伤寒沙门氏菌属于europe MDR分子分型组；
7)若所述待测鼠伤寒沙门氏菌基因组中111877位点的核苷酸为C，则所述待测鼠伤寒沙门氏菌属于3.5分子分型组；
8)若所述待测鼠伤寒沙门氏菌基因组中151916位点的核苷酸为T，则所述待测鼠伤寒沙门氏菌属于3.3分子分型组；
9)若所述待测鼠伤寒沙门氏菌基因组中165413位点的核苷酸为A，则所述待测鼠伤寒沙门氏菌属于3.1分子分型组；
10)若所述待测鼠伤寒沙门氏菌基因组中668906位点的核苷酸为T，则所述待测鼠伤寒沙门氏菌属于1.2分子分型组；
11)若所述待测鼠伤寒沙门氏菌基因组中153823位点的核苷酸为T，则所述待测鼠伤寒沙门氏菌属于3.2分子分型组；
12)若所述待测鼠伤寒沙门氏菌基因组中276334位点的核苷酸为G，则所述待测鼠伤寒沙门氏菌属于1.3分子分型组；
13)若所述待测鼠伤寒沙门氏菌基因组中99426位点的核苷酸为A，则所述待测鼠伤寒沙门氏菌属于1.5分子分型组；
14)若所述待测鼠伤寒沙门氏菌基因组中207875位点的核苷酸为G，且719622位点的核苷酸为G，且符合如下：178930位点的核苷酸不为T或且525595位点的核苷酸不为A；则所述待测鼠伤寒沙门氏菌属于2.3分子分型组；
15)若所述待测鼠伤寒沙门氏菌基因组中24555位点的核苷酸为T，则所述待测鼠伤寒沙门氏菌属于2.1分子分型组。
也可以根据上述15组特异SNP位点组合(表1第3列)对待测鼠伤寒沙门氏菌进行耐药性鉴定，具体方法如下：
检测待测鼠伤寒沙门氏菌基因组中上述16个SNP位点核苷酸，按照如下方式进行判断：
1)若所述待测鼠伤寒沙门氏菌基因组中76338位点的核苷酸为G，则所述待测鼠伤寒沙门氏菌属于中等耐药性；
2)若所述待测鼠伤寒沙门氏菌基因组中114468位点的核苷酸为T，且845276位点的核苷酸为T，则所述待测鼠伤寒沙门氏菌属于高等耐药性；
3)若所述待测鼠伤寒沙门氏菌基因组中114468位点的核苷酸为T，且845276位点的核苷酸不为T；则所述待测鼠伤寒沙门氏菌属于高等耐药性；
4)若所述待测鼠伤寒沙门氏菌基因组中207875位点的核苷酸为G，且719622位点的核苷酸为G，且178930位点的核苷酸为T，则所述待测鼠伤寒沙门氏菌属于高等耐药性；
5)若所述待测鼠伤寒沙门氏菌基因组中207875的核苷酸为G，且719622位点的核苷酸为G，且525595位点的核苷酸为A，则所述待测鼠伤寒沙门氏菌属于高等耐药性；
6)若所述待测鼠伤寒沙门氏菌基因组中302985位点的核苷酸为T，则所述待测鼠伤寒沙门氏菌属于高等耐药性；
7)若所述待测鼠伤寒沙门氏菌基因组中111877位点的核苷酸为C，则所述待测鼠伤寒沙门氏菌属于不耐药；
8)若所述待测鼠伤寒沙门氏菌基因组中151916位点的核苷酸为T，则所述待测鼠伤寒沙门氏菌属于不耐药；
9)若所述待测鼠伤寒沙门氏菌基因组中165413位点的核苷酸为A，则所述待测鼠伤寒沙门氏菌属于不耐药；
10)若所述待测鼠伤寒沙门氏菌基因组中668906位点的核苷酸为T，则所述待测鼠伤寒沙门氏菌属于中等耐药性；
11)若所述待测鼠伤寒沙门氏菌基因组中153823位点的核苷酸为T，则所述待测鼠伤寒沙门氏菌属于不耐药；
12)若所述待测鼠伤寒沙门氏菌基因组中276334位点的核苷酸为G，则所述待测鼠伤寒沙门氏菌属于不耐药；
13)若所述待测鼠伤寒沙门氏菌基因组中99426位点的核苷酸为A，则所述待测鼠伤寒沙门氏菌属于低等耐药性；
14)若所述待测鼠伤寒沙门氏菌基因组中207875位点的核苷酸为G，且719622位点的核苷酸为G，且符合如下：178930位点的核苷酸不为T或且525595位点的核苷酸不为A；则所述待测鼠伤寒沙门氏菌属于中等耐药性；
15)若所述待测鼠伤寒沙门氏菌基因组中24555位点的核苷酸为T，则所述待测鼠伤寒沙门氏菌属于中等耐药性。
实施例2、4151株亚非欧来源鼠伤寒沙门氏菌公共数据库测序数据验证方法
采用4151株亚非欧来源鼠伤寒沙门氏菌公共数据库测序数据验证实施例1的方法，具体如下：
1)对来自SRA数据的4151株亚非欧来源鼠伤寒沙门氏菌全基因组测序数据进行FASTQ格式转换；
2)预测样品数据血清型，剔除与表型不符的数据；
3)以鼠伤寒标准菌株(accession:NC_016810)为参考序列，进行变异检索，找出与鼠伤寒标准菌株(accession:NC_016810)不同的所有SNP位点；
4)将上述所有SNP位点与表1所示的15组特异SNP位点组合(表1第3列)的多态形式进行一一检索；
5)统计本发明中各分组的位点组合在每个数据中的出现情况及耐药数量，计算各分组位点组合灵敏度和特异度。
表2为灵敏度和特异度计算原理
验证结果 分型1 非分型1 总数
分型1 a c a+c
非分型1 b d b+d
总数 a+b c+d
灵敏度计算公式＝组合位点碱基与该分型位点碱基相符的菌株数/该分型的菌株总数；【a/(a+b)】
特异度计算公式＝菌株不属于该分型且组合位点碱基与分型的组合位点碱基不相符的的菌株数/非该分型的菌株总数。【d/c+d】
结果如表3所示。
表3亚非欧来源鼠伤寒分子分型各分组SNP组合验证情况
上述表2中，第1列为鼠伤寒沙门氏菌分子分型的子分支或分支名称(共15个子分支或分支)，第2列为第1列每个子分支或分支对应的菌株数量，第3列为第1列每个子分支或分支对应的特异SNP位点组合多态形式，第4列为第1列每个子分支或分支的耐药情况；第5列为灵敏度，第6列为特异度。

Claims (10)

1.检测待测鼠伤寒沙门氏菌的基因组中16个SNP位点核苷酸的物质在制备检测或辅助检测鼠伤寒沙门氏菌分子分型情况产品中的应用；
或，检测待测鼠伤寒沙门氏菌的基因组中16个SNP位点核苷酸的物质在对待测鼠伤寒沙门氏菌进行分子分型中的应用；
所述16个SNP位点为如下：
76338位点，该位点为鼠伤寒沙门氏菌NC_016810.1染色体76338物理位置的SNP位点；
114468位点，该位点为鼠伤寒沙门氏菌NC_016810.1染色体114468物理位置的SNP位点；
845276位点，该位点为鼠伤寒沙门氏菌NC_016810.1染色体845276物理位置的SNP位点；
207875位点，该位点为鼠伤寒沙门氏菌NC_016810.1染色体207875物理位置的SNP位点；
719622位点，该位点为鼠伤寒沙门氏菌NC_016810.1染色体719622物理位置的SNP位点；
178930位点，该位点为鼠伤寒沙门氏菌NC_016810.1染色体178930物理位置的SNP位点；
525595位点，该位点为鼠伤寒沙门氏菌NC_016810.1染色体525595物理位置的SNP位点G；
302985位点，该位点为鼠伤寒沙门氏菌NC_016810.1染色体302985物理位置的SNP位点C；
111877位点，该位点为鼠伤寒沙门氏菌NC_016810.1染色体111877物理位置的SNP位点；
151916位点，该位点为鼠伤寒沙门氏菌NC_016810.1染色体151916物理位置的SNP位点；
165413位点，该位点为鼠伤寒沙门氏菌NC_016810.1染色体165413物理位置的SNP位点；
668906位点，该位点为鼠伤寒沙门氏菌NC_016810.1染色体668906物理位置的SNP位点；
153823位点，该位点为鼠伤寒沙门氏菌NC_016810.1染色体153823物理位置的SNP位点；
276334位点，该位点为鼠伤寒沙门氏菌NC_016810.1染色体276334物理位置的SNP位点；
99426位点，该位点为鼠伤寒沙门氏菌NC_016810.1染色体99426物理位置的SNP位点；
24555位点，该位点为鼠伤寒沙门氏菌NC_016810.1染色体24555物理位置的SNP位点。
2.检测待测鼠伤寒沙门氏菌的基因组中权利要求1中所述16个SNP位点核苷酸的物质在制备检测或辅助检测待测鼠伤寒沙门氏菌耐药性产品中的应用；
或，检测待测鼠伤寒沙门氏菌的基因组中权利要求1中所述16个SNP位点核苷酸的物质制备检测或辅助检测待测鼠伤寒沙门氏菌耐药性产品中的应用。
3.一种对待测鼠伤寒沙门氏菌进行分子分型的方法，包括如下步骤：
检测待测鼠伤寒沙门氏菌基因组中权利要求1中所述16个SNP位点核苷酸，按照如下方式进行分子分型：
1)若所述待测鼠伤寒沙门氏菌基因组中76338位点的核苷酸为G，则所述待测鼠伤寒沙门氏菌属于4.4分子分型组；
2)若所述待测鼠伤寒沙门氏菌基因组中114468位点的核苷酸为T，且845276位点的核苷酸为T，则所述待测鼠伤寒沙门氏菌属于4.2分子分型组；
3)若所述待测鼠伤寒沙门氏菌基因组中114468位点的核苷酸为T，且845276位点的核苷酸不为T，则所述待测鼠伤寒沙门氏菌属于4分子分型组；
4)若所述待测鼠伤寒沙门氏菌基因组中207875位点的核苷酸为G，且719622位点的核苷酸为G，且178930位点的核苷酸为T，则所述待测鼠伤寒沙门氏菌属于China&India MDR分子分型组；
5)若所述待测鼠伤寒沙门氏菌基因组中207875的核苷酸为G，且719622位点的核苷酸为G，且525595位点的核苷酸为A，则所述待测鼠伤寒沙门氏菌属于India MDR分子分型组；
6)若所述待测鼠伤寒沙门氏菌基因组中302985位点的核苷酸为T，则所述待测鼠伤寒沙门氏菌属于europeMDR分子分型组；
7)若所述待测鼠伤寒沙门氏菌基因组中111877位点的核苷酸为C，则所述待测鼠伤寒沙门氏菌属于3.5分子分型组；
8)若所述待测鼠伤寒沙门氏菌基因组中151916位点的核苷酸为T，则所述待测鼠伤寒沙门氏菌属于3.3分子分型组；
9)若所述待测鼠伤寒沙门氏菌基因组中165413位点的核苷酸为A，则所述待测鼠伤寒沙门氏菌属于3.1分子分型组；
10)若所述待测鼠伤寒沙门氏菌基因组中668906位点的核苷酸为T，则所述待测鼠伤寒沙门氏菌属于1.2分子分型组；
11)若所述待测鼠伤寒沙门氏菌基因组中153823位点的核苷酸为T，则所述待测鼠伤寒沙门氏菌属于3.2分子分型组；
12)若所述待测鼠伤寒沙门氏菌基因组中276334位点的核苷酸为G，则所述待测鼠伤寒沙门氏菌属于1.3分子分型组；
13)若所述待测鼠伤寒沙门氏菌基因组中99426位点的核苷酸为A，则所述待测鼠伤寒沙门氏菌属于1.5分子分型组；
14)若所述待测鼠伤寒沙门氏菌基因组中207875位点的核苷酸为G，且719622位点的核苷酸为G，且符合如下：178930位点的核苷酸不为T或且525595位点的核苷酸不为A；则所述待测鼠伤寒沙门氏菌属于2.3分子分型组；
15)若所述待测鼠伤寒沙门氏菌基因组中24555位点的核苷酸为T，则所述待测鼠伤寒沙门氏菌属于2.1分子分型组。
4.一种检测或辅助检测待测鼠伤寒沙门氏菌耐药性的方法，包括如下步骤：
检测待测鼠伤寒沙门氏菌基因组中权利要求1中所述16个SNP位点核苷酸，按照如下方式进行判断：
1)若所述待测鼠伤寒沙门氏菌基因组中76338位点的核苷酸为G，则所述待测鼠伤寒沙门氏菌属于中等耐药性；
2)若所述待测鼠伤寒沙门氏菌基因组中114468位点的核苷酸为T，且845276位点的核苷酸为T，则所述待测鼠伤寒沙门氏菌属于高等耐药性；
3)若所述待测鼠伤寒沙门氏菌基因组中114468位点的核苷酸为T，且845276位点的核苷酸不为T，则所述待测鼠伤寒沙门氏菌属于高等耐药性；
4)若所述待测鼠伤寒沙门氏菌基因组中207875位点的核苷酸为G，且719622位点的核苷酸为G，且178930位点的核苷酸为T，则所述待测鼠伤寒沙门氏菌属于高等耐药性；
5)若所述待测鼠伤寒沙门氏菌基因组中207875的核苷酸为G，且719622位点的核苷酸为G，且525595位点的核苷酸为A，则所述待测鼠伤寒沙门氏菌属于高等耐药性；
6)若所述待测鼠伤寒沙门氏菌基因组中302985位点的核苷酸为T，则所述待测鼠伤寒沙门氏菌属于高等耐药性；
7)若所述待测鼠伤寒沙门氏菌基因组中111877位点的核苷酸为C，则所述待测鼠伤寒沙门氏菌属于不耐药；
8)若所述待测鼠伤寒沙门氏菌基因组中151916位点的核苷酸为T，则所述待测鼠伤寒沙门氏菌属于不耐药；
9)若所述待测鼠伤寒沙门氏菌基因组中165413位点的核苷酸为A，则所述待测鼠伤寒沙门氏菌属于不耐药；
10)若所述待测鼠伤寒沙门氏菌基因组中668906位点的核苷酸为T，则所述待测鼠伤寒沙门氏菌属于中等耐药性；
11)若所述待测鼠伤寒沙门氏菌基因组中153823位点的核苷酸为T，则所述待测鼠伤寒沙门氏菌属于不耐药；
12)若所述待测鼠伤寒沙门氏菌基因组中276334位点的核苷酸为G，则所述待测鼠伤寒沙门氏菌属于不耐药；
13)若所述待测鼠伤寒沙门氏菌基因组中99426位点的核苷酸为A，则所述待测鼠伤寒沙门氏菌属于低等耐药性；
14)若所述待测鼠伤寒沙门氏菌基因组中207875位点的核苷酸为G，且719622位点的核苷酸为G，且符合如下：178930位点的核苷酸不为T或且525595位点的核苷酸不为A；则所述待测鼠伤寒沙门氏菌属于中等耐药性；
15)若所述待测鼠伤寒沙门氏菌基因组中24555位点的核苷酸为T，则所述待测鼠伤寒沙门氏菌属于中等耐药性。
5.权利要求1或2所述检测待测鼠伤寒沙门氏菌的基因组中16个SNP位点核苷酸的物质和记载权利要求3所述方法的可读载体在制备检测或辅助检测待测鼠伤寒沙门氏菌分子分型产品中的应用；
或，权利要求1或2所述检测待测鼠伤寒沙门氏菌的基因组中16个SNP位点核苷酸的物质和记载权利要求4所述方法的可读载体在制备检测或辅助检测待测鼠伤寒沙门氏菌耐药性产品中的应用。
6.检测或辅助检测待测鼠伤寒沙门氏菌分子分型产品，包括权利要求1或2所述检测待测鼠伤寒沙门氏菌的基因组中16个SNP位点核苷酸的物质。
7.根据权利要求6所述的产品，其特征在于：所述产品还包括记载权利要求3所述方法的可读载体。
8.检测或辅助检测待测鼠伤寒沙门氏菌耐药性产品，包括权利要求1或2所述检测待测鼠伤寒沙门氏菌的基因组中16个SNP位点核苷酸的物质。
9.根据权利要求8所述的产品，其特征在于：所述产品还包括记载权利要求4所述方法的可读载体。
10.一种获得鼠伤寒沙门氏菌分子分型SNP集的方法，包括如下步骤：
1)从http://ncbi.nlm.nih.gov/网站和/或深圳疾病控制预防中心获得全球鼠伤寒沙门菌株的全基因组测序数据或样品，样品经处理测序得出fastq格式序列，将这些数据格式处理至fastq或fasta格式；
2)对传统检测出为鼠伤寒的沙门氏菌全基因组进行SeqSero软件预测血清型，筛除预测类型和表型不一致的数据，保留预测类型和表型一致的全球鼠伤寒沙门菌株的全基因组测序数据，得到来源于美洲、欧洲、非洲、澳大利亚和亚洲的6828株鼠伤寒沙门菌株全球菌株全基因组测序数据；
3)Call SNP和构建进化树
所述Call SNP为以鼠伤寒标准菌株的accession:NC_016810为参考序列，对所述2得到的6828株鼠伤寒沙门菌株全球菌株全基因组测序数据，用snippy pipeline构建变异位点集合，得到所有SNP位点；
所述构建进化树为将所述2)得到的6828株鼠伤寒沙门菌株全球菌株全基因组测序数据使用fasttree软件对所有菌株进行系统发育树构建；
4)建立分型分组和筛选保守SNP
所述建立分型分组为利用群体结构分析系统hierBAPS软件将6828株鼠伤寒沙门菌株所有菌株在clades和subclades水平上进行分组，对进化树的分支进行合理调整和分组；
筛选保守SNP得到保守SNP；
任选的，所述筛选保守SNP为将所述3)获得的所有SNP位点按照如下4个标准进行筛选，
①保留同义突变SNP；
②通过abacas.1.3.1对6828株鼠伤寒沙门氏菌全球菌株所有全基因组测序数据进行序列对齐，进而利用gubbins软件得出重组区域并过滤重组区域SNP；
③RepeatMasker软件预测重复序列并去除重复序列中的SNP；
④进入PHAST网页预测噬菌体片段并去除噬菌体片段中的SNP；
5)筛选分组特异SNP；
任选的，所述筛选分组特异SNP的方法如下：
(1)从所述保守SNP中筛选具有分辨力的分组特异的单个SNP；
(2)若根据4)得到的各分组无法筛选出特异SNP的分组，通过该分组在对应的上一级分组中的特异SNP，与上一级分组的特异SNP组合，从而形成一套分组特异的层级组合SNP；
6)上述5)得到的分组特异的单个SNP和分组特异的层级组合SNP，经鼠伤寒沙门菌株基因组序列验证，根据特异性和灵敏度挑选一组特异性和灵敏度最高的SNP集，作为鼠伤寒沙门氏菌分子分型SNP集。
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