CN109485696A - 一种克服肠道降解的膜肽酶抑制肽 - Google Patents

一种克服肠道降解的膜肽酶抑制肽 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种克服肠道降解的膜肽酶抑制肽，其氨基酸序列为Met‑Ile‑Arg(MIR)。本发明所提供的膜肽酶抑制肽对ACE和DPP‑IV有持续稳定的抑制效果，且具有安全无毒副作用，易于吸收等特点，可作为功能成分用于食品、保健品以及降压药品中，同时还可作为活性因子的跨膜保护载体，具有广泛的应用前景和十分重要的意义。

Description

一种克服肠道降解的膜肽酶抑制肽
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种克服肠道降解的膜肽酶抑制肽。
背景技术
生物活性肽可以发挥不同的生物活性，例如抗氧化，抗高血压，抗痉挛，免疫调节和降血糖等。但活性肽的潜在作用的发挥取决于它们在口服后必须被吸收到血液循环中并以活性形式和足够剂量的方式运输到靶器官的部位，其中肠道是人体的主要障碍之一。肠道中膜肽酶可能改变肽的结构进而影响它们的生物活性。ACE和DPP-IV是重要的膜肽酶，兼具ACE抑制活性和DPP-IV抑制活性的活性肽因抗肠道降解而更具有体内的稳定性，能够以活性分子形式进入细胞发挥作用。
同时，ACE抑制活性肽和DPP-IV抑制活性肽都是重要的生物活性肽，可分别抑制体内ACE和DPP-IV活性，从而起到降血压和降血糖的作用。因此，从食源性蛋白质中水解分离出兼具ACE抑制活性和DPP-IV抑制活性的活性肽成为开发具有克服肠道稳定性的功能肽的一个新思路。
本发明旨在发现一种克服肠道降解的膜肽酶抑制肽，并提供一种兼具ACE抑制活性和DPP-IV抑制活性的活性肽的原料。
发明内容
本发明公开了一种克服肠道降解的膜肽酶抑制肽，并且可以将其作为保健品成分以及生物药品中有效成分的生物递送的有效载体。
本发明的一种克服肠道降解的膜肽酶抑制肽，其氨基酸序列为Met-Ile-Arg。
本发明的克服肠道降解的膜肽酶抑制肽，其抑制ACE和DPP-IV活性的半抑制浓度(IC50)分别为24.9654μM和4.86mM。
本发明的目的通过以下技术方案实现：
(1)活性肽的筛选
本发明借助ExPASy PeptideCutter(http：//web.expasy.org/peptide_cutter/)这一在线酶切工具对鸡蛋蛋白序列进行虚拟酶切，将酶切后产生的肽序列与BIOPEP(http：//www.uwm.edu.pl/biochemia/index.php/en/biopep)数据库中已报道的ACE抑制和DPP-IV抑制肽进行比较，筛选获得到未经报道的活性肽MIR、GCR、CDR、FK、NTF、NAF、FYQ、QGF、QGL、ADF。通过peptide property calculator、PeptideRanker和Discovery Studio的ADMET模块对三肽MIR、GCR、CDR、FK、NTF、NAF、FYQ、QGF、QGL、ADF进行水溶性、生物活性和ADMET(吸收、分布、代谢、排泄、毒性)性质的预测。筛选得到溶解性好、活性评分高于0.5、无毒的肽MIR、CDR、FK、ADF。从PDB数据库(http：//www.rcsb.org/)中获得ACE的晶体结构(1O86)和DPP-IV的晶体结构(5J3J)，并将其作为蛋白靶标，通过DS中的CDOCKER程序进行分子对接来筛选能与ACE和DPP-IV紧密结合的三肽，并明确活性位点。以结合‘CDOCKER-INTERACTION-ENERGY’得分、形成氢键的数目及作用的关键氨基酸为指标，筛选得到具有潜在ACE抑制活性和DPP-IV抑制活性的三肽MIR。
(2)体外ACE抑制活性和DPP-IV抑制活性测定
通过高效液相色谱法对三肽MIR的ACE抑制活性进行测定，取30μL马尿酰-组胺酰-亮氨酸(HHL)底物溶液，加入10μL抑制剂混合均匀，在37℃恒温水浴锅中预热3～5min，然后加入20μL ACE液充分混合，37℃保温30min后，得到反应液。该反应液用HPLC进行分析。
色谱条件：柱温25℃，流速0.5mL/min，进样量10μL，流动相乙腈∶水为25∶75等度洗脱，检测波长228nm。
利用下列公式计算不同浓度三肽的抑制率：
ACE抑制活性(％)＝(A-B)/A×100％
其中A是反应空白的峰面积，反应空白混合物含有相同体积的缓冲溶液而不是样品；B是ACE和酶促肽样品存在下反应的峰面积，IC50值定义为在测定条件下抑制50％ACE活性的抑制剂浓度。
ACE活性的定义：ACE活性的一个单位(U)定义为在37℃下每分钟从催化HHL形成1mol的HA所需的酶量。
通过荧光分光光度法对三肽FGR的DPP-IV抑制活性进行测定，取25μL抑制剂溶液，加入50μL酶缓冲液充分混合在37℃避光保温10min，然后加入25μL底物缓冲液。同时用DPP-IV缓冲液替代抑制剂溶液作为酶对照组。该反应液用荧光分光光度计进行分析。
计算公式：
DPP-IV抑制活性(％)＝(SlopeEC-SlopeSM)/SlopeEC×100％
其中SlopeSM是样品抑制剂的斜率，SlopeEC是酶对照的斜率，IC50值定义为在测定条件下抑制50％DPP-IV活性的抑制剂浓度。
DPP-IV活性的定义：DPP-IV活性的一个单位(U)定义为在37℃下每分钟通过切割底物以产生与存在的酶活性成比例的荧光产物所需的酶量。
荧光分光光度检测参数：
时间扫描：20min；
激发波长：360nm，发射波长460nm。
活性肽MIR的获得可利用胃蛋白酶和胰蛋白酶对鸡蛋溶菌酶进行酶解并通过多维色谱纯化(凝胶过滤色谱、亲和色谱和半制备液相色谱)实现；也可通过固相化学合成方法实现。
本发明与现有技术相比，具有如下有益效果为：
本发明从鸡蛋蛋白中筛选得到了能够有效抑制ACE活性和DPP-IV活性并且克服肠道膜肽酶的三肽MIR，并明确活性肽MIR与ACE和DPP-IV的作用位点；MIR既具有抑制高血压和高血糖的靶点的作用，而且能够克服肠道降解等优点，因此可作为功能成分用于食品、保健品以及降压药品中，同时兼具膜肽酶稳定性的优点，具有良好的潜力和应用前景。
附图说明
本发明附图2幅，其中：
图1 MIR与ACE相互作用；
图2 MIR与DPP-IV相互作用；
具体实施方式
下面以具体实施例的方式对本发明作进一步的阐述。
实施例1.具有ACE抑制活性与DPP-IV抑制活性的活性肽的筛选
本发明借助ExPASy PeptideCutter(http：//web.expasy.org/peptide_cutter/)的胃蛋白酶和胰蛋白酶对鸡蛋蛋白(卵清蛋白、肌球蛋白、溶菌酶蛋白、卵转铁蛋白)进行酶切，将酶切后产生的肽序列与BIOPEP(http：//www.uwm.edu.pl/biochemia/index.php/en/biopep)数据库中已知的ACE抑制和DPP-IV抑制肽进行比较，筛选获得到未经报道的肽MIR、GCR、CDR、FK、NTF、NAF、FYQ、QGF、QGL、ADF。通过在线工具peptide property calculator、PeptideRanker和Discovery Studio中的ADMET程序对FGR进行水溶性、生物活性和ADMET(吸收、分布、代谢、排泄、毒性)性质的预测。筛选得到溶解性好、活性评分高于0.5、无毒的肽MIR、CDR、FK、ADF。
从PDB数据库(http：//www.rcsb.org/)中获得ACE的晶体结构(1O86)和DPP-IV的晶体结构(5J3J)，并将其作为蛋白靶标，通过DS中的CDOCKER程序进行分子对接来评价肽与ACE和DPP-IV紧密结合能力。结合‘CDOCKER-INTERACTION-ENERGY’得分、形成氢键的数目及作用的关键氨基酸，筛选得到一种具有潜在ACE抑制活性和DPP-IV抑制活性的三肽MIR。结果表明MIR可以与ACE的主要残基即His353、Glu384、Ala354、His513、Tyr523、和Lys511结合(图1)；MIR同时还可以与DPP-IV的主要残基即His126、Glu205、Arg125、Tyr666、Phe357和Glu206结合(图2)。
实施例2.MIR体外ACE抑制活性和DPP-IV抑制活性鉴定
通过高效液相色谱法对三肽MIR的ACE抑制活性进行测定，取马尿酰-组胺酰-亮氨酸(HHL)底物溶液，加入抑制剂混合均匀，在37℃恒温水浴锅中预热3～5min，然后加入ACE溶液充分混合，37℃保温30min后，得到反应液。同时用硼酸缓冲液替代抑制剂溶液作为空白对照组，用高效液相色谱进行分析。
色谱条件：柱温25℃，流速0.5mL/min，进样量10μL，流动相乙腈∶水为25∶75等度洗脱，检测波长228nm。
利用下列公式计算不同浓度三肽的抑制率：
ACE抑制活性(％)＝(A-B)/A×100％
其中A是反应空白的峰面积，反应空白混合物含有相同体积的缓冲溶液而不是样品；B是ACE和酶促肽样品存在下反应的峰面积，IC50值定义为在测定条件下抑制50％ACE活性的抑制剂浓度。
ACE活性的定义：ACE活性的一个单位(U)定义为在37℃下每分钟从催化HHL形成1mol的HA所需的酶量。
结果表明MIR可有效抑制ACE的活性，其IC50值为24.9654μM。
通过荧光分光光度法对三肽MIR的DPP-IV抑制活性进行测定，取25μL抑制剂溶液，加入50μL酶缓冲液充分混合在37℃避光保温10min，然后加入25μL底物缓冲液。同时用DPP-IV缓冲液替代抑制剂溶液作为酶对照组。该反应液用荧光分光光度计进行分析。
计算公式：
DPP-IV抑制活性(％)＝(SlopeEC-SlopeSM)/SlopeEC×100％
其中SlopeSM是样品抑制剂的斜率，SlopeEC是酶对照的斜率，IC50值定义为在测定条件下抑制50％DPP-IV活性的抑制剂浓度。
DPP-IV活性的定义：DPP-IV活性的一个单位(U)定义为在37℃下每分钟通过切割底物以产生与存在的酶活性成比例的荧光产物所需的酶量。
结果表明MIR可有效抑制DPP-IV的活性，其IC50值为4.86mM。
以上所述的实施例对本发明的技术方案进行了详细说明，应理解的是以上所述仅为本发明的具体实施例，并不用于限制本发明，应当指出：对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围的前提下，还可以做出各种变化和变型，这些变化和变型也应视为本发明的保护范围。

Claims (4)

1.一种克服肠道降解的膜肽酶抑制肽，其特征在于，所述三肽氨基酸序列为Met-Ile-Arg。
2.根据权利要求1所述的膜肽酶抑制肽，其特征在于，根据高效液相色谱法测定三肽Met-Ile-Arg抑制ACE活性的半抑制浓度为24.9654μM。
3.根据权利要求1所述的膜肽酶抑制肽，其特征在于，根据荧光分光光度法测定三肽Met-Ile-Arg抑制DPP-IV活性的半抑制浓度为4.86mM。
4.根据权利要求1所述的膜肽酶抑制肽，其特征在于，Met-Ile-Arg与ACE的His353、Glu384、Ala354、His513、Tyr523和Lys511结合；MIR与DPP-IV的His126、Glu205、Arg125、Tyr666、Phe357和Glu206结合。
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