CN109475861A - 基于金属纳米颗粒的光热转换特性检测分析物的微流控 - Google Patents

基于金属纳米颗粒的光热转换特性检测分析物的微流控 Download PDF

Info

Publication number
CN109475861A
CN109475861A CN201780033153.8A CN201780033153A CN109475861A CN 109475861 A CN109475861 A CN 109475861A CN 201780033153 A CN201780033153 A CN 201780033153A CN 109475861 A CN109475861 A CN 109475861A
Authority
CN
China
Prior art keywords
metal
antibody
salt
light source
salmonella
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201780033153.8A
Other languages
English (en)
Inventor
马利安托涅塔·帕拉奇诺
何塞·玛利亚·阿贝德·帕斯托
萨拉·普埃尔塔斯·洛伦特
瓦莱里亚·格拉祖·博纳维亚
杰西·马丁内斯·德拉·富恩特
安娜·路易莎·都·瓦勒·丰塞卡·克拉洛
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Nano Immunology Corp
Original Assignee
Nano Immunology Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Nano Immunology Corp filed Critical Nano Immunology Corp
Publication of CN109475861A publication Critical patent/CN109475861A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
    • B01L3/50—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes
    • B01L3/502—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures
    • B01L3/5027—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip
    • B01L3/502707—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip characterised by the manufacture of the container or its components
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/17—Systems in which incident light is modified in accordance with the properties of the material investigated
    • G01N21/171—Systems in which incident light is modified in accordance with the properties of the material investigated with calorimetric detection, e.g. with thermal lens detection
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54366—Apparatus specially adapted for solid-phase testing
    • G01N33/54373—Apparatus specially adapted for solid-phase testing involving physiochemical end-point determination, e.g. wave-guides, FETS, gratings
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
    • G01N33/585—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with a particulate label, e.g. coloured latex
    • G01N33/587—Nanoparticles
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2200/00—Solutions for specific problems relating to chemical or physical laboratory apparatus
    • B01L2200/14—Process control and prevention of errors
    • B01L2200/148—Specific details about calibrations
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2300/00—Additional constructional details
    • B01L2300/08—Geometry, shape and general structure
    • B01L2300/0861—Configuration of multiple channels and/or chambers in a single devices
    • B01L2300/087—Multiple sequential chambers
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2300/00—Additional constructional details
    • B01L2300/08—Geometry, shape and general structure
    • B01L2300/0887—Laminated structure
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2300/00—Additional constructional details
    • B01L2300/12—Specific details about materials
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B82—NANOTECHNOLOGY
    • B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
    • B82Y15/00—Nanotechnology for interacting, sensing or actuating, e.g. quantum dots as markers in protein assays or molecular motors
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/17—Systems in which incident light is modified in accordance with the properties of the material investigated
    • G01N21/55—Specular reflectivity
    • G01N21/552—Attenuated total reflection
    • G01N21/553—Attenuated total reflection and using surface plasmons
    • G01N21/554—Attenuated total reflection and using surface plasmons detecting the surface plasmon resonance of nanostructured metals, e.g. localised surface plasmon resonance
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56911—Bacteria
    • G01N33/56916—Enterobacteria, e.g. shigella, salmonella, klebsiella, serratia
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56911—Bacteria
    • G01N33/56922—Campylobacter

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Clinical Laboratory Science (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
  • Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
  • Investigating Or Analyzing Materials Using Thermal Means (AREA)
  • Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)
  • Optical Measuring Cells (AREA)
  • Radiation Pyrometers (AREA)

Abstract

本发明涉及包括载体或基底的微流控试剂盒或装置用于根据金属纳米颗粒被外部光源照射时产生热量而检测分析物的体外用途，其中所述载体或基底包括在基底中的至少一个通道，所述通道包括入口、出口和连接所述入口与所述出口的流动路径，其中所述入口和所述出口一起限定中间平面，并且流动路径的一部分横向穿过所述中间平面行进，其中横向穿过中间平面行进的流动路径的一部分包括用于检测目标分析物的识别位点或传感区域。

Description

基于金属纳米颗粒的光热转换特性检测分析物的微流控
技术领域
本发明涉及微流控领域，特别是本发明说明由于金属纳米颗粒被外部光源照射时产生热量，微流控芯片特别适用于根据金属纳米颗粒被外部光源照射时产生热量而检测分析物的若干免疫测定(例如ELISA免疫测定)。
背景技术
在需要对食品污染物进行超灵敏和低成本检测的农业食品部门中，生物传感市场有所增加。
特别是，家禽业中的公司对病原体(例如沙门氏菌(Salmonella)，大肠杆菌(E.coli)或弯曲菌(Campylobacter))的存在/不存在进行常规控制测试，其中在肉本身以及靴拭子、工作靴、工作台、家禽育肥、蛋鸡场等中广泛地规定有检测方案。
对于沙门氏菌的特异性检测，已经开发了基于免疫测定(例如ELISA)或其他合适的测定(例如PCR和原种培养)的不同方法，以减少检测该病原体所需的时间，因为标准培养方法(例如国际标准化组织方法6579(ISO)和美国食品和药物管理局的细菌学分析手册第5章：沙门氏菌(FDA))尽管对于禽肉和禽肉产品的检测限非常低，为9CFU/mL(菌落形成单位/mL)，但是需要长达5天(包括生物化学和血清学确认；ISO，2002；FDA，2007)来完成该方法，因此在大量样品的常规监测中效率不高。在这种背景下，快速、准确和经济的方法对于该行业以及实验室向政府当局报告结果以采取法律行动是至关重要。这些方法之一是Vitek免疫诊断试验(VIDAS；Biomérieux，Marcy L'Etoile，法国)，是一种能够通过Vitek免疫诊断测定系统沙门氏菌(VIDAS SLM)法来准确快速地从大量样品中筛选出存在的沙门氏菌的基于酶联免疫荧光测定的自动化系统。在48小时内，禽肉和禽肉产品的VIDAS ESLM检测限测定为90cfu/mL。
然而，迄今为止所有已知的用于从样品中筛选存在的沙门氏菌的测试，包括Vitek免疫诊断测定，需要合格的工作人员和特定的实验室装置，这大大延迟了结果的提供。如果我们考虑到任何已知测试中的沙门氏菌的阳性结果可能意味着除非可以及早处理，否则要屠宰鸡舍单元中所有的鸡，对于食品工业来说，尽可能快速有效地确定病原体的存在以便采取适当的措施是一个重要的问题。
本发明提供了一种快速、高灵敏度且特异性的以有效的方式鉴定多种分析物的方法，所述分析物包括病原体如沙门氏菌、大肠杆菌或弯曲菌。
发明内容
在本文中，在各种示例性实施方式中，我们表明微流控芯片特别适用于根据金属纳米颗粒被外部光源照射时产生热量而检测分析物的若干免疫测定。这些装置可用于检测一种或多种样品流体中一种或多种目标分析物的存在。在实施例中还公开了制备和使用这种装置的方法和过程。
因此，特别地，本发明涉及包括载体或基底的微流控试剂盒或装置用于根据金属纳米颗粒被外部光源照射时产生热量而检测分析物的体外用途，其中所述载体或基底包括在基底中的至少一个通道，所述通道包括入口、出口和连接所述入口与所述出口的流动路径，其中入口和出口一起限定中间平面，并且流动路径的一部分横向穿过中间平面行进，其中横向穿过所述中间平面行进的流动路径的一部分包括用于检测目标分析物的识别位点或传感区域。
应注意，中间平面是以将通道分成对称的两半的方式穿过所述通道的平面，并且传感区域被限定为用抗体官能化的金属-化学活化表面的部分，并在横向穿过入口和出口之间的中间平面行进的流动路径内被识别。
附图说明
图1.微流控原型。NC＝阴性对照；PC：阳性对照。
图2.在用30mW NIR光束照射下，稀释于缓冲液中并直接吸附在微流控室上的两种不同浓度的沙门氏菌的温度增量的测量结果。
图3.直接吸附在微流控芯片的表面上的不同浓度的鼠伤寒沙门氏菌(salmonellaT.)的温度增量ΔT的测量结果。
图4.用夹心免疫测定来检测在微流控芯片表面上由不同浓度的鼠伤寒沙门氏菌的存在所引起的温度增量ΔT的测量结果。
图5.在用30mW NIR激光束照射下，由对稀释于磷酸盐缓冲液中的，以夹心形式置于微流控芯片上的一种浓度的沙门氏菌的免疫检测引起的温度增量的测量结果。
图6.沙门氏菌对于吸附于微流控芯片表面上的Ab的检测下限。
图7.在用30mW NIR激光束照射下，以两次稀释掺杂的真实样品中，由于沙门氏菌的存在所引起的温度增量ΔT的测量结果。
图8.根据校准曲线对真实样品的定量。
图9.使用沙门氏菌共价固定化捕获抗体，在30mW NIR激光束照射下，由于PBS中以30CFU/ml掺杂的沙门氏菌的存在所引起的温度增量ΔT的测量结果。
图10.使用沙门氏菌定向固定化捕获抗体，在30mW NIR激光束照射下，由于PBS中以30CFU/ml掺杂的沙门氏菌的存在所引起的温度增量ΔT的测量结果。
图11.微流控芯片表面不同表面官能化之间的比较。
图12.在真实样品含25g鸡肉的225ml蛋白胨中检测到60CFU/ml的沙门氏菌。
图13.在定向捕获抗体官能化的微流控芯片上对真实样品(含25g鸡肉的225ml蛋白胨的真实样品)中的沙门氏菌的定量。
图14.在定向捕获抗体官能化的微流控芯片上对博尔顿培养基(Bolton culturemedia)中空肠弯曲菌(Campylobacter jejuni)的定量
图15.使用市售ELISA试剂盒(来自Indoor Biotechnology的Ara h 1ELISA试剂盒(EL-AH1)Ara h 1ELISA试剂盒(2C12/2F7)，www.inbio.com)对Ara h1的LOD进行测定。
图16.在定向捕获抗体官能化的微流控芯片上对真实样品进行Ara h 1定量。
图17.用于检测微流控芯片室表面上吸附的白蛋白的直接免疫测定。
图18.使用共价固定在微流控芯片表面上的捕获抗体来检测胶原蛋白的夹心免疫测定。
图19.玻璃表面不同表面官能化之间的比较。
图20.处置1：样品后面的热电堆。
图21.处置1：鼠伤寒沙门氏菌的校准曲线。
图22.处置2：样品前面的热电堆。
图23.处置2：鼠伤寒沙门氏菌的校准曲线。
图24.流程图。
图25.用ELISA和夹心斑点印迹检测不同CFU的沙门氏菌(Ag)。作为阴性对照，在不存在沙门氏菌(无Ag)的情况下进行斑点印迹。
图26.使用HEATSENS检测沙门氏菌所实施的一般方案。
图27.使用可视方法对200μl样品中的150CFU沙门氏菌进行HEATSENS检测。
图28.由于检测直接吸附在PVDF膜上的不同CFU的沙门氏菌所引起的温度增量。用0.4W NIR光束照射样品30秒。
图29.A)用NTA-Co2+和抗CD3官能化的金纳米颗粒的SDS-PAGE凝胶：B)用NTA-Cu2+和抗HRP官能化的金纳米颗粒的SDS-PAGE凝胶。泳道：(A)(1)抗CD3 35μg/mL；(2)上清液AuNP-NTA-Co2+；(3)洗涤后的上清液1；(4)洗涤后的上清液2；(5)洗涤后的上清液3；(6)。
图30.用抗HRP和酶HRP孵育后，用NTA-Cu2+(蓝线)和NTA-Co2+(红线)官能化的金纳米颗粒的活性。条件：在50mM磷酸钠缓冲液，pH6.0，25℃下，1mM ABTS作为电子供体，1mMH2O2作为电子受体。
图31.在镍和铜离子活化的商用条带上对HRP进行检测的免疫测定。A)用Ni和Cu官能化的表面上的HRP活性和以10μg/ml和20μg/ml固定的抗HRP抗体的活性；B)HRP活化后相对于TMB底物在450nm处的吸光度。
图32.使用用铜和镍离子活化并用10μg/ml和20μg/ml抗HRP抗体官能化的商业条带进行的HRP免疫测定的HEATSENS测量结果。
图33.使用我们的方法以NTA-Cu2+修饰的COC样品的FTIR光谱(红线)；使用UV照射的以NTA-Ni2+修饰的COC样品的FTIR光谱(蓝线)。未处理的COC样品的FTIR光谱(黑线)。
图34.在CuSO4的EDTA溶液在727nm的吸光度的校准点和相对最大值的UV-vis光谱。
图35.A)从在孵育步骤后获得的微粒控芯片表面去除Cu-EDTA的UV-Vis光谱。B)所分析的表面上的Cu2+浓度外推。
图36.用于检测镍(比较例)和铜离子(NIT)活化的表面上的HRP的免疫测定。用Ni和Cu官能化的表面上的HRP和固定的抗HRP抗体的活性；HRP活化后相对于ABTS底物在412nm处的吸光度。
图37.由通过在两种金属螯合表面上的定向固定化抗体捕获的生物素化HRP的存在所引起的温度增量(ΔT)。
图38.用于检测镍离子(比较例)和铜离子(NIT)活化的表面上的鼠伤寒沙门氏菌的免疫比色测定。报告阳性对照相对于阴性对照在412nm处的吸光度，其中NC1是指在不存在捕获抗体的情况下的测定，NC2是指在不存在分析物沙门氏菌的情况下的测定，NC3是指在不存在检测抗体的情况下的测定，NC4是指不存在链霉亲和素-HRP。
图39.用于检测镍离子(D4)和铜离子(NIT)测定活化的表面上的1000CFU鼠伤寒沙门氏菌的HEATSENS免疫测定：与不同官能化表面上的分析物的存在相关的温度增量(DT)的测量结果。报告了阳性对照相对于阴性对照在412nm处的吸光度，其中NC1是在不存在捕获抗体的情况下的测定，NC2是指在不存在分析物沙门氏菌的情况下的测定，NC3是指在不存在检测抗体的情况下的测定。
具体实施方式
定义
出于本发明的目的，下文包括以下定义：
●术语“包括”，其意味着包括但不限于单词“包括”之后的任何内容。因此，术语“包括”的使用表示所列出的元素是必需或强制性的，但是其他元素是任选的并且可以存在或可以不存在。
●“由......组成”意味着包括并限于短语“由......组成”中的任何内容。因此，短语“由......组成”表示所列出的元素是必需或强制性的，并且不存在其他元素。
●还应注意，本文使用的术语“试剂盒”或“装置”不限于任何特定装置，并且包括适用于实施本发明的任何装置。
●如本文所用，“微流控”是处理微米尺度通道内的液体流动的科学。为了考虑微流控，通道的至少一个尺寸必须在微米或数十微米的范围内。微流控可以被认为是一门科学(微通道中流体行为的研究)和一种技术(用于各种应用的微流控装置的制造，如本文公开的用于对分析物进行识别和定量的应用)。
●如本文所用，“微流控芯片或装置”是指蚀刻或模制到材料(例如玻璃、硅、热塑性材料或聚合物，例如PDMS，即聚二甲基硅氧烷)内的微通道组。形成微流控芯片的微通道连接在一起以便实现期望的特征(混合、泵送、分选、控制生物化学环境)。陷入微流控芯片中的这种微通道网络通过穿过芯片的输入和输出连接到外部，作为宏观和微观世界之间的接口。通过这些孔，用外部主动系统(压力控制器、推进式注射器或蠕动泵)或被动方式(例如静水压力)从微流控芯片(通过管道、注射器适配器或甚至芯片中的简单的孔)注射或移出液体(或气体)。优选地，如本文所用，“微流控芯片或装置”被理解为特别适用于进行用于检测分析物的免疫测定(例如夹心免疫测定)的芯片或装置，其包括载体或基底，其中所述载体或基底包括在基底中的至少一个通道，所述通道包括入口、出口和连接入口与出口的流动路径，其中所述入口和所述出口一起限定中间平面；并且流动路径的一部分横向穿过所述中间平面行进，其中横向穿过所述中间平面行进的所述流动路径的一部分包括用于检测目标分析物的识别位点或传感区域
●如本文所用，术语“Heatsens方法或技术”应理解为使用作为信号转导系统的金属纳米颗粒的光热转换性质的任何方法。使用该系统作为生物传感器中的标签的基础是由于表面等离子体吸收带的存在。当撞击纳米颗粒的光的频率与颗粒导带中的电子的集体振荡频率共振时，产生这些吸收带，从而引起激发。这种现象称为“局域表面等离子体共振”(LSPR)。共振带在光谱中的位置很大程度上取决于颗粒的形状、大小和结构(空心或实心)，以及取决于发现颗粒的介电介质。LSPR导致高摩尔消光系数(～3×1011M-1cm-1)，效率相当于106个荧光团分子，并且接近纳米颗粒的局部电场显著增加。金属纳米颗粒例如金、银或铜纳米颗粒具有这种表面等离子体共振效应。当用具有合适频率的高强度外部光源(例如激光)照射时，这些颗粒能够以热的形式释放部分吸收的能量，导致其表面周围的局部温度升高。
●如本文所用，术语“金属纳米颗粒”应理解为处于其氧化态中的任何一种或在其任何合金中的任何单晶或多晶金属原子簇，其所有几何尺寸为1nm至1000nm，优选为1nm至200nm，可使用标准电子显微镜通过光子特性来测量。本文公开的金属纳米颗粒可以是对称的或不对称的，并且具有各种形状，例如棒形、棱柱形、星形或纳米笼。本文公开的金属颗粒必须具有以有效方式吸收光并产生热量的能力。本领域技术人员会充分理解术语“有效方式”，有效方式可以理解为0.03℃/秒但不受该值的限制，该值是由通过标准手段测量的温度对照射时间绘图的斜率所产生的值。在本发明的优选实施方式中，所述金属原子是贵金属。在本发明更优选的实施方式中，所述金属原子是金、银或铜原子。在本发明甚至更优选的实施方式中，所述金属原子是管状或三角形的金或银原子。
●如本文所用，术语“羧基官能团”或“环氧官能团”或“胺官能团”或“硫醇官能团”或“叠氮官能团”或“卤化物”或“马来酰亚胺官能团”或“酰肼(hydrazyde)官能团”或“醛基”或“炔基”在本文中以如公知常识所理解的使用。
●在本发明的上下文中，外部光源被理解为能量在380nm和1100nm之间的任何电磁照射源，其具有引起基于金、银、铜或其其任何合金或氧化态中的任何一种的金属颗粒的LSPR带的激发的能力，优选是在近红外范围(750nm至1100nm)内，因为样品中存在的、在可见光光谱范围内会吸收的干扰生物分子(血红蛋白等)在该能量范围内不会发生能量吸收。
●在本发明的上下文中，识别分子或捕获用生物分子被理解为能够通过任何类型的化学或生物相互作用特异性识别特定分析物的任何分子。
●在本发明的上下文中，第二识别分子或检测用生物分子被理解为能够通过任何类型的化学或生物相互作用特异性识别特定分析物的任何分子。
●在本发明的生物传感器中用作识别元件的分子必须具有足够的选择性亲和力，以在存在其他化合物的情况下识别特定分析物，此外，随时间保持稳定并且一旦固定在载体上和纳米颗粒表面上就保持其结构以及其生物活性。可使用抗体、肽、酶、蛋白质、多糖、核酸(DNA)、适体或肽核酸(PNA)作为开发系统中的识别分子。
描述
本发明提供一种解决方案，该解决方案提供用于以快速有效的方式鉴定多种分析物的高特异性和灵敏性方法，所述分析物例如食品病原体(例如沙门氏菌、大肠杆菌或弯曲菌)、过敏原(例如Ara H 1)或其他分析物(例如胶原蛋白或白蛋白)。
为此目的，本发明的作者将若干官能化表面的使用与能够通过使用Heatsens技术(参见定义)检测目标分析物的抗体相结合。因此，选择将官能化表面与抗体结合的受控发热作为本发明开发的新一代检测系统的基础。本文所用的用于检测分析物的方案的阶段总结于图24中所示的流程图中，被划分为树型主要阶段：样品预处理、处理和检测。
为了实施该技术，我们首先使用ELISA技术和斑点印迹测定方法测试了抗体与鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhymurium)充分的特异性结合。作为分析物，使用来自BacTRace的减毒鼠伤寒沙门氏菌(https://www.kpl.com/catalog/productdetail.cfm？catalog_ID＝17&Category_ID＝415&Product_ID＝952)作为模型以实施和优化该测定。
如图25所示，使用该标准方法(ELISA)使用酶作为分析物存在的标记检测沙门氏菌，在ELISA测定的情况下检测限(LOD)达到1.400CFU，在斑点印记测定方法的情况下检测限(LOD)达到3.125CFU。已证明抗体与靶分析物(鼠伤寒沙门氏菌)结合，因而结合Heatsens技术对进行检测的数个表面测试以开发传感平台。特别地，选择以下表面：硝酸纤维素、PVDF、环烯烃聚合物(COP)和图案化的TiO2膜。
选择上述表面是由于该表面在其抗体官能化能力和导热能力上的不同的能力，报道如下：
●硝酸纤维素0.12-0.21W/(mK)
●PVDF W/mK 0.17-0.19
●环烯烃聚合物(COP)(微流控芯片)0.12-0.15W/(mK)
●图案化的TiO2膜11.8W/mK。
如本发明所示，用作检测表面的理想表面必须：i)允许使用官能化方法以确保定向结合，和ii)具有高导热性。用于HEATSENS的检测载体的导热性增加将提高分析物的免疫检测的灵敏度，因为金属纳米颗粒与分析物相互作用释放的热量将由热检测器以更快和更精确的方式测量。
我们在下文中描述了本文测试的不同表面的官能化：
-硝酸纤维素/PVDF：使用斑点印迹系统在700毫巴真空下使以正确的缓冲液中的适当浓度的15-25μl/斑点的捕获抗体(在硝酸纤维素或PVDF中心和附近小心滴加)沉积，并将捕获抗体在700毫巴真空下保持干燥10分钟。此后，添加4ml洗涤溶液(含有0.5％BSA和0.5％吐温的PBS缓冲液)将抗体官能化膜洗涤两次，并将其在室温下搅拌孵育10分钟，然后弃去溶液。然后将膜与5ml封闭溶液(含有5％BSA和0.5％吐温的PBS缓冲液)在37℃下搅拌孵育60分钟，并在前述条件下再洗涤两次。此后，准备将硝酸纤维素膜与分析物一起孵育。
-图案化的TiO2膜：吸附5μg/ml的捕获抗体，然后封闭表面。
-微流控芯片：由环烯烃聚合物和PMMA制成，用5μg/ml捕获抗体通过物理吸附到聚合物表面上来进行官能化。通过同样的方式，不同CFU的沙门氏菌也直接吸附在芯片表面上，以便不仅进行夹心测定，还进行直接免疫测定测试。
为了用硝酸纤维素或PVDF膜和图案化的TiO2膜的分析物进行孵育，将它们与200μl在缓冲液(分别为磷酸盐缓冲液、蛋白胨培养基和真实样品)中的不同浓度的分析物在37℃下搅拌孵育30分钟。添加400μl洗涤溶液(含有0.5％BSA和0.5％吐温的PBS缓冲液)，将孵育的载体洗涤两次，并在室温下搅拌孵育5分钟。当该洗涤步骤完成时，添加400μl的10mM磷酸钠缓冲液(pH7)，在室温下搅拌孵育所述表面5分钟，以进行另外两个洗涤步骤。检测的最后步骤是将载体与稀释于封闭缓冲液(含有5％BSA和0.5％吐温的PBS缓冲液)中的20μg/ml链霉亲和素@纳米棱镜(nanoprism)一起在37℃下孵育30分钟。然后将表面在37℃下干燥15分钟。图26说明了进行免疫测定的验证方法的一般方案。
对于每个实验，我们验证了抗体与沙门氏菌的特异性相互作用，引入了以下对照：
●不存在捕获抗体；
●不存在分析物；
●不存在生物素化检测抗体；
●不存在链霉亲和素@纳米棱镜。
沙门氏菌的检测首先使用与官能化膜/载体连接的热敏纸以半定量方式进行，并显示为热敏纸的燃烧。使用的载体是用捕获抗体官能化的PVDF，用于测试200μl样品中150CFU至6000CFU的不同稀释度的沙门氏菌的捕获和过程检测。在与用检测抗体官能化的纳米棱镜孵育后，对膜的照射实现对在200μl样品中的150CFU沙门氏菌的可视检测，检测如图27所示。
然而，上述可视方法没有达到用于食品污染样品的令人满意的检测限，其中仅存在以极低CFU/ml(例如含量<90CFU/ml)的病原体。
为了解决这个问题，本发明的作者试图使用商业热电堆进行定量检测。在这个意义上，注意到在IR照射下纳米棱镜释放的热量可以通过使用IR热电堆(例如来自Melexis的MlX90620)测量。该热电堆适用于检测热照射并测量温度而不与样品接触。
MlX90620热电堆包含64个IR像素，具有专用的低噪声斩波稳定放大器和集成的快速ADC。集成PTAT(与绝对温度成比例)传感器来测量芯片的环境温度。尽管该装置经过校准并且在VDD＝2.6V时性能最佳，但是它需要单个3V电源(±0.6V)。MLX90620出厂时已在很宽的温度范围内进行校准：传感器环境温度为-40至85℃，样品温度为-50至300℃。阵列的每个像素测量其自身视场(称为nFOV)中所有对象的平均温度。
对于定量检测，使200μl样品中的不同CFU稀释度(范围为375CFU至6.000CFU)的沙门氏菌直接固定在PVDF载体上，特别是使用含有375CFU的稀释液和含有700CFU的稀释液。通过测量纳米棱镜与分析物相互作用的存在所产生的温度增量，以定量方式进行检测，如图28所示。
作为阴性对照，我们测量了遵循相同检测方案但未与沙门氏菌孵育的那些膜所提高的温度。正如预期的那样，在不存在沙门氏菌的情况下，纳米棱镜不与膜相互作用，因为我们没有观察到该对照的温度增量的增加。
在之前用磷酸盐缓冲液稀释并直接吸附在表面上的沙门氏菌存在的情况下，375CFU的温度增量约为19℃，而700CFU的沙门氏菌产生约27℃的增量。然而，与可视方法一样，我们没有达到用于食品污染样品的令人满意的检测限，其中仅存在极低CFU/ml(例如含量<90CFU/ml)的病原体。
为了解决这个问题，我们尝试使用除PVDF和硝酸纤维素以外的载体，例如TiO2图案化载体。然而，与目前为止所示的可视检测方法和定量检测方法一样，仍然无法以可靠的方式实现令人满意的检测限。
为了解决这个问题，我们尝试将微流控技术与Heatsens技术相结合，以便以可靠的方式进行一系列能够以令人满意的检测限来检测目标分析物的免疫测定。为此目的，将实施例的材料和方法中所示的未修饰的制造的微流控芯片用于测试沙门氏菌的两种稀释液的直接固定。为此目的，使10μl的60000CFU/ml和20000CFU/ml(表面上分别总计为600CFU和200CFU)鼠伤寒沙门氏菌吸附在检测表面上。在使病原体直接固定后，用BSA封闭表面并使该表面与生物素化检测抗体反应。最后，将它们洗涤并进一步与链霉亲和素-金纳米棱镜溶液反应。
在图2中，我们显示了在沙门氏菌被生物素化检测抗体识别并且与链霉亲和素-纳米棱镜进一步相互作用之后，在NIR照射表面下测量由沙门氏菌的存在所引起的温度增量。在不存在生物素化检测抗体(NC2)的情况下，温度没有显著的增量，这与在没有链霉亲和素@金纳米棱镜(NC3)的情况下一样。温度增量与沙门氏菌的CFU量成比例。这些结果表明该材料适合于制造微流控芯片及在HEATSENS中的应用。此外，结果设想了将不同CFU稀释度的沙门氏菌直接固定在微流控芯片上并制定校准曲线的可能性。
鉴于这些结果，然后我们使用10μl不同浓度(CFU/ml)的鼠伤寒沙门氏菌(范围为0至240000CFU/ml)。使鼠伤寒沙门氏菌直接吸附在微流控芯片上，并用生物素化抗体抗沙门氏菌检测，以测量由不同浓度的沙门氏菌的存在所引起的温度增量。然后链霉亲和素@金纳米棱镜与抗体相互作用，并用IR激光照射每个单独的传感区域。测量每个室的温度，并计算温度增量。图3显示了计算的随沙门氏菌CFU/ml量而变化的温度增量。
所测得的温度升高是由于直接吸附在微流控芯片表面上的CFU量增加。
已显示微流控芯片适合应用于HEATSENS技术，我们通过使用微流控芯片进行夹心免疫测定以检测所选病原体。为此目的，通过使(5μL)5μg/ml抗沙门氏菌捕获抗体直接吸附到表面上，用抗沙门氏菌捕获抗体来官能化微芯片的每个微室。然后，沙门氏菌的捕获活动以及检测和与链霉亲和素-金纳米棱镜的相互作用以在每个通道中注射1ml样品的流控模式进行。用稀释于缓冲液磷酸盐中的2种不同浓度(以CFU/ml计，即200000CFU/ml和240000CFU/ml)的沙门氏菌分别进行测定。图4描述了由鼠伤寒沙门氏菌的存在而引起的温度增量的趋势。校准曲线的趋势不是线性的，表明由于存在与分析物相互作用的大量纳米棱镜而导致信号饱和。根据指数方程计算两种未知浓度的沙门氏菌的检测，其中值与校正决定系数(adj.R-Square)等于0.98843的曲线一致。
已显示夹心形式的免疫测定的有效性，我们试图通过降低掺杂缓冲液中病原体的浓度来改善鼠伤寒沙门氏菌的检测限。从这个意义上讲，在PBS 1X中的1500CFU/ml的鼠伤寒沙门氏菌是第一次试验中检测到的第一较低浓度。为此目的，将1ml样品以200μl/ml的流速注入通道中。注射样品后，使用缓冲液(含0.5％BSA的PBS1X，0.1％吐温)用300μl/min的流速洗涤4分钟。然后使用200μl/ml使检测抗体与其抗原相互作用2分钟。使用洗涤缓冲液(含0.5％BSA的PBS1X，0.1％吐温)以300μl/min的流速冲洗通道4分钟。将链霉亲和素@金纳米棱镜注入通道中。流速为200μl/ml，持续2分钟。使用洗涤缓冲液(含0.5％BSA的PBS1X，0.1％吐温)以300μl/mim的流速冲洗通道4分钟并干燥。
图5示出了相对于阴性对照，1500CFU/ml沙门氏菌的温度增量。在存在沙门氏菌的情况下微室的温度增量高于分别在不存在沙门氏菌(NC1)、不存在检测抗体(NC2)和不存在链霉素-金纳米棱镜(NC3)情况下的对照的温度增量。由沙门氏菌的存在所引起的温度增量高于所有阴性对照，即使这与以下预期值不同：阴性对照的温度增量的正值表明免疫测定中的试剂之间存在非特异性相互作用。在免疫测定期间，非特异性相互作用可能与不完全的官能化和表面封闭相关或与不适当的流速相关。这样，通过在免疫测定期间使表面抗体官能化保持恒定并改变流速，可以改进沙门氏菌的检测限和由背景引起的信号，如图6所示。
使用真实食品样品，即含25g鸡肉的225ml蛋白胨预富集培养基，掺入不同CFP的沙门氏菌来进行相同的实验。使捕获抗体吸附在微流控芯片上，并用含5％BSA的PBS 1X-0.1％吐温以150ml/min的流速封闭表面。
然后，通过使用洗涤缓冲液，用250μl/min的流速进行洗涤。
通过使用流速为15μl/min的流体，对1ml真实样品中的沙门氏菌进行捕获，以及检测生物素化检测抗体，和与链霉亲和素纳米棱镜相互作用。
在微流控芯片中进行的免疫分析的结果如图7所示。在制定校准曲线后，测量由于已知不同浓度的沙门氏菌引起的温度增量，由校准曲线来确定真实样品中未知的病原体浓度(图8)。
掺入沙门氏菌的样品温度增量较高，清楚地表明HEATSENS与微流控技术相结合适合于在复杂基质(例如含25g鸡肉的225ml蛋白胨)中对极低CFU的细菌进行超灵敏检测。
在真实样品中，由沙门氏菌的存在所引起的温度增量与磷酸盐缓冲液中的温度增量略有不同，这是因为存在大量的肉蛋白质会影响细菌与抗体的特异性相互作用。
已证明HEATSENS与微流控技术的组合适合于对极低CFU的分析物进行超灵敏检测，我们试图通过用羧基末端基团对微流控芯片表面的修饰来改进该技术，所述用羧基末端基团对微流控芯片表面的修饰用于通过用捕获抗体的伯胺经EDC/磺基-NHS反应形成稳定的酰胺键来共价固定捕获抗体。
在这个意义上，将先前用10mM EDC和20mM磺基-NHS活化的每个微室的表面用20μl的5μg/ml捕获抗体进行官能化。在捕获抗体共价固定并且在37℃下用在PBS 1X/0.1％吐温中的5％BSA封闭表面1小时后，将芯片连接到蠕动泵并使用洗涤缓冲液用300μl/min的流速洗涤4分钟。使1ml的30CFU/ml的鼠伤寒沙门氏菌以150μl/min的流速在微流控通道内流动1分钟，接着使用缓冲溶液用300μl/min的流速洗涤通道4分钟。然后使400μl生物素化检测抗体在通道内流动。
图9中描绘的结果显示，与不同对照的温度增量相比，掺入30CFU/ml沙门氏菌的样品的温度增量更高。在这种类型的固定中，抗体主要采用“平铺(flat-on)”定向，其中Fc和两个Fab片段平铺在表面上。
然后，我们尝试通过金属螯合来定向固定所述抗体。通过金属螯合至抗体重链(Fc)中富含组氨酸的金属结合位点或融合于蛋白质中的poly-His-标签序列来完成固定。由于金属结合位点位于C末端或N末端，因此以这种方式结合到表面的抗体和带His标签的蛋白质被定向为结合位点指向远离表面的方向，从而允许最大的抗原结合或有利的蛋白质定向。此外，，由于组氨酸结合的螯合作用与多个金属螯合基团的靶结合组合在一起，导致金属螯合固定的结合常数非常高，所以通过金属螯合的定向固定还导致稳定的抗体固定。结合常数估计为10-7M-1至10-13M-1。对于许多应用来说，这提供了与抗原-抗体相互作用相当的结合强度。另一方面，通过金属螯合使抗体定向固定的抗体附着实验条件比共价定向固定方法采用的抗体附着实验条件更温和。作为优点，为了方便起见，与螯合物结合的抗体也可以被调节为可逆的或不可逆的。此外，因为与螯合物结合的抗体也可用于带His标签的重组蛋白的固定，因而它也更通用。
为了实现捕获抗体的定向固定，在微流控室芯片的表面以逐步修饰的方式用金属-螯合物络合物来使微流控室芯片官能化。首先，用含有羧基的芳胺化合物(例如3-(4-氨基苯基)丙酸、3-氨基苯基乙酸、4-氨基苯基乙酸或4-(4-硝基苯基)丁酸)使表面官能化。对于该具体实例，我们使用PhBut，即便对于固定不同的生物分子，使用携带范围在2至16个碳之间的不同长度的正烷基羧酸的芳胺化合物是更合适的。
通过共价接枝重氮化PhBut的芳基自由基以引入的羧基(方案II)是通过EDC催化SNHS酯化来活化的，以便通过游离氨基促进ANTA-M(II)(Cu2+、Ni2+、Co2+)络合物的共价连接(方案III)。然后，将它们与20μl的5μg/ml捕获抗体一起孵育。得到的NTA-M(II)络合物终产物含有被水分子占据的两个自由配位点，所述两个自由配位点被捕获抗体的组氨酸残基取代，从而引起抗体的定向固定。然后，将芯片连接到蠕动泵并使用洗涤缓冲液用300μl/min的流速洗涤4分钟。使1ml的30CFU/ml的鼠伤寒沙门氏菌以150μl/min的流速在微流控通道内流动1分钟，接着使用缓冲液用300μl/min的流速洗涤通道4分钟。然后使400μl生物素化检测抗体在通道内流动。
图10示出了在用捕获抗体以定向方式官能化的微流控芯片上对沙门氏菌的检测。
有趣的是，对于这种类型的固定，由于沙门氏菌的存在所引起的温度增量高于各自对照所获得的温度增量，甚至高于之前直接吸附和共价固定的结果中所获得的温度增量。在这个意义上，进行了不同固定方法之间的比较研究。图11显示对抗体表面官能化的不同策略的比较，其中该图显示了对于本实施例中所示的每种表面官能化策略，与产生的背景信号相比，由于检测到的沙门氏菌所引起的温度增量。
图11示出捕获抗体通过金属螯合进行定向固定不仅因提供由于沙门氏菌的存在所引起的较高温度增量，而且因提供由非特异性相互作用(背景)产生的较低信号，而提供了最佳结果。这些结果表明，芯片表面的正确官能化策略对于以有利的定向获得最佳抗体附着同时避免HEATSENS标记(例如金纳米棱镜)的非特异性吸附是至关重要的。值得注意的是，该方法显示出优于共价定向固定的优点。尽管两种方法都具有获得用于结合的定向抗体附着的优点，但是在金属螯合固定的情况下，抗体被放置成垂直于表面的“端点在上(end-on)”定向，这与抗体主要采用Fc和两个Fab片段平放在表面上的“平铺”定向的共价固定形成对比。
然后对实施例6中所示的有利的抗体定向固定进行测试以检测真实样品中的沙门氏菌。图12报告了结果，其显示了与阴性对照产生的信号相比，在掺杂有已知数量的沙门氏菌CFU的真实样品中，由于沙门氏菌所引起的温度增量。
在抗体定向固定的微流控芯片表面上由于在真实样品中沙门氏菌的存在所引起的温度增量也高于各个对照获得的温度增量。在制定校准曲线后，确定由已知的不同浓度的沙门氏菌和真实样品中未知浓度的病原体所引起的温度增量的测量结果，如图13报告。由用于掺杂真实样品的CFU/ml的理论值的存在所引起的温度增量与校准曲线的CFU数值一致。
因此，选择微流控技术作为制造执行用于分析物检测的HEATSENS方案所需的优选一次性盒的最佳方法。此外，在本文中已经显示微流控技术与捕获用生物分子(例如抗体)的定向构型的组合为用于制造执行用于分析物检测的HEATSENS方案所需的优选一次性盒的优异方法。
最后，重要的是要注意，如实施例8、9和10中清楚地说明，微流控技术与Heatsens技术的组合适用于检测和量化多种分析物，例如但不限于，微生物、添加剂、药物、病原微生物(例如食品病原体)、食品组分、环境污染物、农药、核苷酸、生物标记物(例如医学生物标记物)或毒性化合物等。因此，本文描述的传感器系统不限于任何特定分析物。
-微流控技术与热传感技术组合的用途
在本文中，在各种示例性实施方式中，我们示出了微流控芯片特别适用于根据金属纳米颗粒被外部光源照射时产生热量而检测分析物的若干免疫测定。
这些装置可用于检测一种或多种样品流体中一种或多种目标分析物的存在。在实施例中还公开了制备和使用这种装置的方法和过程。
因此，本发明的第一方面涉及微流控试剂盒或装置用于根据金属纳米颗粒被外部光源照射时产生热量而检测分析物的体外用途，所述微流控试剂盒或装置包括载体或基底，其中所述载体或基底包括在基底中的至少一个通道，所述通道包括入口、出口和连接所述入口与所述出口的流动路径，其中所述入口和所述出口一起限定中间平面，并且流动路径的一部分横向穿过中间平面行进，其中横向穿过所述中间平面行进的流动路径的一部分包括用于检测目标分析物的识别位点或传感区域。
在本发明第一方面的优选实施方式中，流动路径的一部分多次横向穿过中间平面行进。在本发明第一方面的另一种优选实施方式中，流动路径的一部分可以基本垂直地穿过中间平面行进。在本发明第一方面的另一种优选实施方式中，流动路径的一部分可以从入口朝向出口连续行进。在本发明第一方面的另一种优选实施方式中，该装置具有多个通道。在本发明第一方面的另一种优选实施方式中，该装置具有多个微室，每个微室在每一个或多个通道中具有识别位点。在本发明第一方面的又另一种优选实施方式中，每个通道的入口连接到公共装载通道。在本发明第一方面的再另一种优选实施方式中，该装置包括在实施例的材料和方法部分中描述的微芯片或装置的特征。
另外，注意，本发明第一方面的装置的基底或表面可由多种材料，例如热塑性材料、硅、金属或碳制成。优选地，本发明第一方面的装置的基底或表面可以由聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚苯乙烯、聚(二甲基硅氧烷)、聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚乙烯、聚丙烯、聚乳酸、聚(D,L-丙交酯-共-乙交酯)、聚碳酸酯、环烯烃共聚物、硅、玻璃等制成。
如实施例中所示(参见实施例6至9)，微芯片表面的传感区域的官能化通过提供捕获用生物分子的共价或定向构型而改善了传感器的特性。
因此，在本发明第一方面的另一种优选实施方式或其任何优选实施方式中，横向穿过包括识别位点或传感区域的中间平面而行进的流动路径的一部分用一个或多个羧基官能团、或环氧官能团、或胺官能团、或硫醇官能团、或叠氮官能团、或卤化物、或马来酰亚胺官能团、或酰肼官能团、或醛基、或炔基进行官能化。
在实施例中示出了用上述官能团使这些类型的表面官能化的不同方式。无论如何，一般来说，假设载体或基底由以下制成：
a.热塑性材料，例如共烯烃(co-olephin)聚合物，官能化通过使用重氮芳基化合物来进行，所述重氮芳基化合物含有一个或多个羧基、或环氧基、或胺基、或硫醇基、或叠氮基、或卤化物、或马来酰亚胺官能团、或酰肼官能团、或醛基、或炔基；
b.硅材料，例如聚二甲基硅氧烷(PDMS)或玻璃，官能化通过用有机官能烷氧基硅烷分子自组装来进行，所述有机官能烷氧基硅烷分子携带一个或多个羧基、或环氧基、或胺基、或硫醇基、或叠氮基、或卤化物、或马来酰亚胺官能团、或酰肼官能团、或醛基、或炔基；
c.金属，例如铁、钴、镍、铂、钯、锌、银、铜、或金，官能化通过用能够与金属相互作用的分子(例如在金和银的情况下，为硫醇基)自组装来进行，所述能够与金属相互作用的分子携带一个或多个羧基、或环氧基、或胺基、或硫醇基、或叠氮基、或卤化物、或马来酰亚胺官能团、或酰肼官能团、或醛基、或炔基；
d.碳材料，例如石墨烯，官能化如根据上述步骤a)所制定的进行，或通过氧化产生醛基官能团和羧基官能团进行，或通过官能化聚合物的疏水结合进行，所述官能化聚合物具有一个或多个羧基、或环氧基、或胺基、或硫醇基、或叠氮基、或卤化物、或马来酰亚胺官能团、或酰肼官能团、或醛基、或炔基。
优选地，用羧基官能团使任何上述表面官能化。更优选地，载体或微流控芯片或装置由热塑性材料制成，重氮芳基化合物由下式I或II表示：
其中R是具有1至15个碳原子的烷基或亚乙基；和
Z为羧基、环氧基、胺基、硫醇基、叠氮基、卤化物、马来酰亚胺官能团、酰肼官能团、醛基、或炔基，优选羧基或环氧基；或
其中R是具有1至15个碳原子的烷基。
优选地，上述式I或II的重氮组分相对于任何这些化学式的烷基或乙烯组分置于或位于对位或间位。适合于制备任何上述式I或II中的重氮芳基化合物的芳胺化合物的实例是：3-(4-氨基苯基)丙酸、3-氨基苯基乙酸、4-氨基苯基乙酸、4-(4-硝基苯基)丁酸或4-(4-氨基苯基)丁酸(参见实施例)。
在本发明的第一方面的另一种优选实施方式中，用螯合剂进一步修饰或官能化微芯片或装置的表面，所述螯合剂优选选自：Nα,Nα-双(羧甲基)-L-赖氨酸水合物(ANTA)金属(II)盐、次氮基三乙酸(NTA)金属(II)盐、亚氨基二乙酸(IDA)金属(II)盐、乙二胺四乙酸(EDTA)金属(II)盐、二乙烯三胺五乙酸(DTPA)金属(II)盐，其中金属(II)盐被理解为二价金属(例如Cu2+、Ni2+或Co2+)的盐。这通过螯合剂与上述提及的任何活化官能团(除了那些不需要被活化而直接与螯合剂反应的基团(如环氧基)之外)的直接反应来实现，其中：
-羧基可以通过EDC/SNHS介导的酰胺化来活化(方案III)；
-胺基可以用羰基活化；
-硫醇基可以通过形成巯基反应性交联剂来活化，其中巯基可以选自马来酰亚胺、卤代乙酰基或吡啶基二硫化物；
-炔基或叠氮基可通过点击化学(CLICK chemistry)来活化；
-醛基可以通过席夫碱形成来活化。
优选地，载体由热塑性材料制成，并且芳胺化合物含有羧基，所述羧基通过N-(3-二甲基氨基丙基)-N'-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)催化的N-羟基磺基琥珀酰亚胺盐(磺基-NHS)的酯化而活化。
更优选地，载体由热塑性材料制成，并且芳胺化合物含有羧基，所述羧基通过N-(3-二甲基氨基丙基)-N'-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)催化的N-羟基磺基琥珀酰亚胺盐(磺基-NHS)的酯化而活化，并且金属螯合剂是Nα,Nα-双(羧甲基)-L-赖氨酸水合物(ANTA)金属(II)盐，其中金属(II)盐应理解为二价金属(例如Cu2+、Ni2+或Co2+)的盐。
如实施例中所示，用螯合剂(例如ANTA金属(II)盐)活化微芯片表面对于实现抗体的定向构型从而产生改进的传感平台特别有利。
在本发明的第一方面的又一种优选实施方式或其任何优选实施方式中，横向穿过包括识别位点或传感区域的中间平面而行进的流动路径的一部分可以包括：
a.能够识别固定在识别位点或传感区域上的目标分析物的识别分子；或
b.固定在识别位点或传感区域上的分析物。
优选地，所述识别分子可以选自但不限于由以下组成的列表：肽、多糖、毒素、蛋白质受体、凝集素、酶、抗体、抗体片段、重组抗体、抗体树状大分子复合物、核酸(DNA、RNA)、肽核酸(PNA)、分子印记。优选地，所述识别分子是抗体、其片段或重组抗体。
在本发明的第二方面，本发明的第一方面或其任何优选实施方式的试剂盒或装置还可以包括以下元件中的至少一种：
a.适用于Heatsens技术的外部光源，例如激光或LED灯；
b.能够识别目标分析物的第二识别分子；或
c.具有光子特性的金属纳米颗粒；和
d.任选地，能够检测金属纳米颗粒在被外部光源照射时产生的热量的装置。
在本发明的第三方面，本发明的第一方面或其任何优选实施方式的试剂盒或装置还可以包括以下元件中的至少一种：
a.适用于Heatsens技术的外部光源，例如激光或LED灯；或
b.具有光子性质的金属纳米颗粒，其用能够识别目标分析物的第二识别分子官能化；和
c.任选地，能够检测金属纳米颗粒在被外部光源照射时产生的热量的装置。
在本发明的第四方面，本发明的第一方面或其任何优选实施方式的试剂盒或装置还可以包括以下元件中的至少一种：
a.适用于Heatsens技术的外部光源，例如激光或LED灯；
b.能够识别目标分析物的第二识别分子(检测用生物分子)，所述目标分析物任选地与标记分子结合；或
c.具有光子性质的金属纳米颗粒，其用特异性地识别检测用生物分子的生物分子或修饰检测用生物分子的标记官能化；和
d.任选地，能够检测金属纳米颗粒在被外部光源照射时产生的热量的装置。
优选地，本发明第二至第四方面中任一方面的试剂盒或装置还包括能够检测金属纳米颗粒在被外部光源照射时产生的热量的装置，该装置选自红外相机或热电堆。
本发明的第五方面涉及根据本发明任一前述方面的装置的用途，其中分析物是微生物、添加剂、药物、病原微生物(例如食品病原体)、食品组分、环境污染物、农药、核苷酸、生物标记物(例如医学生物标记物)或毒性化合物。优选地，所述目标分析物选自沙门氏菌、弯曲菌、胶原蛋白、白蛋白和Ara H1。
-具有为抗体定向固定而官能化的传感区域的微流控装置或芯片
如在实施例6至9中所制定的，通过使微芯片或装置的传感区域官能化，使得捕获用生物分子(例如抗体)具有定向构型，这为在微芯片技术与Heatsens技术相结合的传感器系统中检测分析物提供了明显的优势。
因此，本发明的第六方面涉及一种试剂盒或装置，其包括载体或基底，其中所述载体或基底包括在基底中的至少一个通道，通道包括入口、出口和连接所述入口与所述出口的流动路径，其中所述入口和所述出口一起限定中间平面，并且流动路径的一部分横向穿过所述中间平面行进，其中横向穿过所述中间平面行进的所述流动路径的一部分包括用于检测目标分析物的识别位点或传感区域；
其中，横向穿过包括识别位点或传感区域的中间平面而行进的流动路径的一部分用螯合剂官能化。
在本发明第六方面的优选实施方式中，所述螯合剂优选选自由以下组成的列表：Nα,Nα-双(羧甲基)-L-赖氨酸水合物(ANTA)金属(II)盐、次氮基三乙酸(NTA)金属(II)盐、亚氨基二乙酸(IDA)金属(II)盐、乙二胺四乙酸(EDTA)金属(II)盐、二乙烯三胺五乙酸(DTPA)金属(II)盐，其中金属(II)盐应理解为二价金属的盐，所述二价金属例如Cu2+、Ni2+或Co2+，优选Cu2+。优选地，螯合剂选自由以下组成的列表：Nα,Nα-双(羧甲基)-L-赖氨酸水合物(ANTA)金属(II)盐和次氮基三乙酸(NTA)金属(II)盐，其中金属(II)盐应理解为二价金属的盐，所述二价金属例如Cu2+、Ni2+或Co2+，优选Cu2+。这是通过螯合剂与活化的官能团的直接反应来实现的，其中
-羧基可以通过EDC/SNHS介导的酰胺化来活化(方案III)；
-胺基可以用羰基活化；
-硫醇基可以通过形成巯基反应性交联剂来活化，其中巯基可以选自马来酰亚胺、卤代乙酰基或吡啶基二硫化物；
-炔基或叠氮基可通过点击化学来活化；
-醛基可以通过席夫碱形成来活化。
优选地，所述载体由热塑性材料制成，并且芳胺化合物含有羧基，所述羧基通过N-(3-二甲基氨基丙基)-N'-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)催化的N-羟基磺基琥珀酰亚胺盐(磺基-NHS)的酯化而活化。
更优选地，所述载体由热塑性材料制成，并且芳胺化合物含有羧基，所述羧基通过N-(3-二甲基氨基丙基)-N'-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)催化的N-羟基磺基琥珀酰亚胺盐(磺基-NHS)的酯化而活化，并且所述金属螯合剂选自由以下组成的列表：Nα,Nα-双(羧甲基)-L-赖氨酸水合物(ANTA)金属(II)盐和次氮基三乙酸(NTA)金属(II)盐，其中金属(II)盐被理解为二价金属的盐，所述二价金属例如Cu2+、Ni2+或Co2+，优选Cu2+。
在本发明的第六方面的另一种优选实施方式或其任何优选实施方式中，横向穿过包括识别位点或传感区域的中间平面而行进的流动路径的一部分可以包括：
a.能够识别固定在识别位点或传感区域上的目标分析物的识别分子；或
b.固定在识别位点或传感区域上的目标分析物。
优选地，所述识别分子可以选自但不限于由以下组成的列表：肽、多糖、毒素、蛋白质受体、凝集素、酶、抗体、抗体片段、重组抗体、抗体树状大分子复合物、核酸(DNA、RNA)、肽核酸(PNA)、分子印记。优选地，所述识别分子是抗体、其片段或重组抗体。
在本发明的第七方面，本发明的第六方面或其任何优选实施方式的试剂盒或装置还可以包括以下元件中的至少一种：
a.适用于Heatsens技术的外部光源，例如激光或LED灯；
b.能够识别目标分析物的第二识别分子；或
c.具有光子特性的金属纳米颗粒；和
d.任选地，能够检测金属纳米颗粒在被外部光源照射时产生的热量的装置。
在本发明的第八方面，本发明的第六方面或其任何优选实施方式的试剂盒或装置还可以包括以下元件中的至少一种：
a.适用于Heatsens技术的外部光源，例如激光或LED灯，优选地，外部光源包括发光二极管(LED)，其中所述光源优选地在600nm至1100nm之间发射；或
b.具有光子性质的金属纳米颗粒，其用能够识别目标分析物的第二识别分子官能化；和
c.任选地，能够检测金属纳米颗粒在被外部光源照射时产生的热量的装置。
在本发明的第九方面，本发明的第六方面或其任何优选实施方式的试剂盒或装置还可以包括以下元件中的至少一种：
a.适用于Heatsens技术的外部光源，例如激光或LED灯；
b.能够识别目标分析物的第二识别分子(检测用生物分子)，所述目标分析物任选地与标记分子结合；或
c.具有光子性质的金属纳米颗粒，其用特异性地识别检测用生物分子的生物分子或修饰检测用生物分子的标记官能化；和
d.任选地，能够检测金属纳米颗粒在被外部光源照射时产生的热量的装置。
优选地，本发明第七至第八方面中任一方面的试剂盒或装置还包括能够检测金属纳米颗粒在被外部光源照射时产生的热量的装置，该装置选自红外相机或热电堆。
-适用于检测样品流体中分析物的存在的、微芯片技术与HEATSENS技术相结合的传感器系统
本发明的另外的方面涉及将微芯片技术与Heatsens技术相结合的完整传感器系统。
因此，本发明的第十方面涉及一种用于检测样品流体中分析物的存在的装置或系统，所述装置或系统包括：
a.载体或基底；
b.基底中的通道，所述通道包括入口、出口和连接所述入口与所述出口的流动路径，其中所述入口和所述出口一起限定中间平面；流动路径的一部分横向穿过所述中间平面行进，其中横向穿过所述中间平面行进的流动路径的一部分包括传感区域，所述传感区域包括识别分子(捕获用生物分子)，所述识别分子(捕获用生物分子)能够识别固定在其上面的目标分析物；
c.适用于Heatsens技术的外部光源，例如激光或LED灯；
d.能够识别目标分析物的第二识别分子(检测用生物分子)；
e.具有光子特性的金属纳米颗粒；和
f.任选地，能够检测金属纳米颗粒在被外部光源照射时产生的热量的装置。
本发明的第十一方面涉及一种用于检测样品流体中分析物的存在的装置或系统，包括：
a.基底；
b.基底中的通道，所述通道包括入口、出口和连接所述入口与所述出口的流动路径，其中所述入口和所述出口一起限定中间平面；流动路径的一部分横向穿过所述中间平面行进，其中横向穿过所述中间平面行进的流动路径的一部分包括传感区域，所述传感区域包括识别分子(捕获用生物分子)，所述识别分子(捕获用生物分子)能够识别固定在其上面的目标分析物；
g.适用于Heatsens技术的外部光源，例如激光或LED灯；
c.具有光子特性的金属纳米颗粒，其用能够识别目标分析物的第二识别分子官能化；
d.任选地，能够检测金属纳米颗粒在被外部光源照射时产生的热量的装置。
本发明的第十二方面涉及一种用于检测样品流体中分析物的存在的装置或系统，所述装置或系统包括：
a.基底；
b.基底中的通道，通道包括入口、出口和连接所述入口与所述出口的流动路径，其中所述入口和所述出口一起限定中间平面；流动路径的一部分横向穿过所述中间平面行进，其中横向穿过所述中间平面行进的流动路径的一部分包括传感区域，所述传感区域包括识别分子(捕获用生物分子)，所述识别分子(捕获用生物分子)能够识别固定在其上面的目标分析物；
c.适用于Heatsens技术的外部光源，例如激光或LED灯；
d.能够识别目标分析物的第二识别分子(检测用生物分子)，所述目标分析物任选地与标记分子结合；
e.具有光子性质的金属纳米颗粒，其用特异性地识别检测用生物分子的生物分子或修饰检测用生物分子的标记官能化；和
f.任选地，能够检测金属纳米颗粒在被外部光源照射时产生的热量的装置。
应注意，本发明的第十至第十二方面中任一方面的系统或装置的传感区域可以根据任何技术官能化以及标题为“微流控技术与热传感技术组合的用途”的部分中描述的任何官能团来官能化。优选地，所使用的官能化允许识别分子(优选为抗体)的定向构型。
此外，还应注意，作为本发明的第十至第十二方面中任一方面的完整传感器系统的组件之一而提及的微芯片或装置可以进一步表征为如标题为“微流控技术与热传感技术组合的用途”的部分中所述的任何实施方式所描述。
-使适于通过使用HEATSENS技术检测分析物来进行免疫测定的微芯片或装置的传感区域官能化的过程
如实施例中所示(参见实施例6至9)，微芯片表面的传感区域的官能化通过提供捕获用生物分子的共价或定向构型而改善了传感器的特性。
正如在标题为“微流控技术与热传感技术组合的用途”或标题为“具有为抗体定向固定而官能化的传感区域的微流控装置或芯片”的部分中已制定的，用于通过使用Heatsens技术检测分析物来进行免疫测定的微芯片或装置的传感区域可以通过若干不同方式进行官能化。使微芯片或装置官能化的不同方式取决于待官能化的材料的类型和有机官能团的类型(例如羧基官能团、或环氧官能团、或胺官能团、或硫醇官能团、或叠氮官能团、或卤化物、或马来酰亚胺官能团、或酰肼官能团、或醛基、或炔基)，我们希望所述有机官能团的类型使整个本发明中所示的任何微芯片或装置的传感区域官能化。
在这个意义上，应注意，微芯片或装置的基底或表面可由多种材料，例如热塑性材料、硅、金属或碳制成。优选地，所述微芯片或装置的基底或表面可以由聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚苯乙烯、聚(二甲基硅氧烷)、聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚乙烯、聚丙烯、聚乳酸、聚(D,L-丙交酯-共-乙交酯)、聚碳酸酯、环烯烃共聚物、硅、玻璃等制成。
在实施例中显示了用上述官能团使这些类型的表面官能化的不同方式。在这个意义上，本发明的第十三方面涉及使包括载体或基底的微芯片或装置的传感区域官能化的过程，其中所述载体或基底包括在基底中的至少一个通道，实施通道包括入口、出口和连接所述入口与所述出口的流动路径，其中所述入口和所述出口一起限定中间平面，并且流动路径的一部分横向穿过中间平面行进，其中横向穿过所述中间平面行进的流动路径的一部分包括用于检测目标分析物的识别位点或传感区域；
其中如果载体或基底由以下制成：
a.热塑性材料，例如共烯烃聚合物，官能化通过使用重氮芳基化合物来进行，所述重氮芳基化合物含有一个或多个羧基、或环氧基、或胺基、或硫醇基、或叠氮基、或卤化物、或马来酰亚胺官能团、或酰肼官能团、或醛基、或炔基；
b.硅材料，例如聚二甲基硅氧烷(PDMS)或玻璃，官能化通过用有机官能烷氧基硅烷分子自组装来进行，所述有机官能烷氧基硅烷分子携带一个或多个羧基、或环氧基、或胺基、或硫醇基、或叠氮基、或卤化物、或马来酰亚胺官能团、或酰肼官能团、或醛基、或炔基；
c.金属，例如铁、钴、镍、铂、钯、锌、银、铜、或金，官能化通过用能够与金属相互作用的分子(例如在金和银的情况下，为硫醇基)自组装来进行，所述能够与金属相互作用的分子携带一个或多个羧基、或环氧基、或胺基、或硫醇基、或叠氮基、或卤化物、或马来酰亚胺官能团、或酰肼官能团、或醛基、或炔基；
d.碳材料，例如石墨烯，官能化如根据上述步骤a)所制定的进行，或通过氧化产生醛基官能团和羧基官能团进行，或通过官能化聚合物的疏水结合进行，所述官能化聚合物具有一个或多个羧基、或环氧基、或胺基、或硫醇基、或叠氮基、或卤化物、或马来酰亚胺官能团、或酰肼官能团、或醛基、或炔基。
优选地，如果微流控芯片或装置的支撑体由热塑性材料制成，则重氮芳基化合物由下式I或II表示：
其中R是具有1至15个碳原子的烷基或乙烯；和
Z为羧基、环氧基、胺基、硫醇基、叠氮基、卤化物、马来酰亚胺官能团、酰肼官能团、醛基、或炔基，优选羧基或环氧基；
其中R是具有1至15个碳原子的烷基。
优选地，上述式I或II的重氮组分相对于任何这些化学式的烷基或乙烯组分置于或位于对位或间位。适合于制备任何上述式I或II中的重氮芳基化合物的芳胺化合物的实例是：3-(4-氨基苯基)丙酸、3-氨基苯基乙酸、4-氨基苯基乙酸、4-(4-硝基苯基)丁酸或4-(4-氨基苯基)丁酸。
在本发明的第十三方面的另一种优选实施方式中，用螯合剂进一步修饰或官能化微芯片或装置的表面，所述螯合剂优选选自：Nα,Nα-双(羧甲基)-L-赖氨酸水合物(ANTA)金属(II)盐、次氮基三乙酸(NTA)金属(II)盐、亚氨基二乙酸(IDA)金属(II)盐、乙二胺四乙酸(EDTA)金属(II)盐、二乙烯三胺五乙酸(DTPA)金属(II)盐，其中金属(II)盐应理解为二价金属的盐，所述二价金属例如Cu2+、Ni2+或Co2+。这通过螯合剂与任何上述活化官能团的直接反应来实现，其中：
-羧基可以通过EDC/SNHS介导的酰胺化来活化(方案III)；
-胺基可以用羰基活化；
-硫醇基可以通过形成巯基反应性交联剂来活化，其中巯基可以选自马来酰亚胺、卤代乙酰基或吡啶基二硫化物；
-炔基或叠氮基可通过点击化学来活化；
-醛基可以通过席夫碱形成来活化。
优选地，所述载体由热塑性材料制成，并且芳胺化合物含有羧基，所述羧基通过N-(3-二甲基氨基丙基)-N'-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)催化的N-羟基磺基琥珀酰亚胺盐(磺基-NHS)的酯化而活化。
更优选地，所述载体由热塑性材料制成，并且芳胺化合物含有羧基，所述羧基通过N-(3-二甲基氨基丙基)-N'-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)催化的N-羟基磺基琥珀酰亚胺盐(磺基-NHS)的酯化而活化，并且金属螯合剂选自由以下组成的列表：Nα,Nα-双(羧甲基)-L-赖氨酸水合物(ANTA)金属(II)盐和次氮基三乙酸(NTA)金属(II)盐，其中金属(II)盐应理解为二价金属的盐，所述二价金属例如Cu2+、Ni2+或Co2+，优选Cu2+。
如实施例中所示，用螯合剂(例如ANTA金属(II)盐)活化微芯片表面对于实现抗体的定向构型从而产生改进的传感平台特别有利。
-具有为抗体定向固定而官能化的传感区域的试剂盒或装置
最后，应注意，如实施例中所示，通过使任何支持体(不必须是微芯片或装置的支持体，例如玻璃)的传感区域官能化，使得捕获用生物分子(例如抗体)具有定向构型，这为在使用Heatsens技术的传感器系统中检测分析物提供了明显的优势。
因此，本发明的第十四方面涉及一种试剂盒或装置，其包括载体或基底，其中所述基底或表面可由多种材料，例如热塑性材料、硅、金属或碳制成；其中所述载体或基底包括用于检测目标分析物的识别位点或传感区域；其中所述识别位点或传感区域用螯合剂官能化。
在本发明第十四方面的优选实施方式中，所述螯合剂优选选自由以下组成的列表：Nα,Nα-双(羧甲基)-L-赖氨酸水合物(ANTA)金属(II)盐、次氮基三乙酸(NTA)金属(II)盐、亚氨基二乙酸(IDA)金属(II)盐、乙二胺四乙酸(EDTA)金属(II)盐、二乙烯三胺五乙酸(DTPA)金属(II)盐，其中金属(II)盐应理解为二价金属的盐，所述二价金属例如Cu2+、Ni2+或Co2+。所述螯合剂通过螯合剂与活化的官能团的直接反应使载体官能化，其中：
-羧基可以通过EDC/SNHS介导的酰胺化来活化(方案III)；
-胺基可以用羰基活化；
-硫醇基可以通过形成巯基反应性交联剂来活化，其中巯基可以选自马来酰亚胺、卤代乙酰基或吡啶基二硫化物；
-炔基或叠氮基可通过点击化学来活化；
-醛基可以通过席夫碱形成来活化。
值得注意的是，在标题为“使适于通过使用HEATSENS技术检测分析物来进行免疫测定的微芯片或装置的传感区域官能化的过程”的部分中，我们描述了如何用整个本发明中提到的任何有机官能团使不同的载体或表面官能化。
优选地，所述载体由通过用有机官能烷氧基硅烷分子自组装来官能化的玻璃制成，所述有机官能烷氧基硅烷分子携带一个或多个羧基、或环氧基、或胺基、或硫醇基、或叠氮基、或卤化物、或马来酰亚胺官能团、或酰肼官能团、或醛基、或炔基；其中上述官能团已经任选地被活化并与螯合剂直接反应，优选与选自由以下组成的列表中的螯合剂反应：Nα,Nα-双(羧甲基)-L-赖氨酸水合物(ANTA)金属(II)盐或次氮基三乙酸(NTA)金属(II)盐，其中金属(II)盐应理解为二价金属的盐，所述二价金属例如Cu2+、Ni2+或Co2+，优选Cu2+。
在本发明第十四方面的另一种优选实施方式或其任何优选实施方式中，识别位点或传感区域可包括：
a.能够识别固定在识别位点或传感区域上的目标分析物的识别分子；或
b.固定在识别位点或传感区域上的目标分析物。
优选地，所述识别分子可以选自但不限于由以下组成的列表：肽、多糖、毒素、蛋白质受体、凝集素、酶、抗体、抗体片段、重组抗体、抗体树状大分子复合物、核酸(DNA、RNA)、肽核酸(PNA)、分子印记。优选地，所述识别分子是抗体、其片段或重组抗体。
在本发明的第十五方面中，本发明的第十四方面或其任何优选实施方式的试剂盒或装置还可以包括以下元件中的至少一种：
a.适用于Heatsens技术的外部光源，例如激光或LED灯；
b.能够识别目标分析物的第二识别分子；或
c.具有光子特性的金属纳米颗粒；和
d.任选地，能够检测金属纳米颗粒在被外部光源照射时产生的热量的装置。
在本发明的第十六方面中，本发明的第十四方面或其任何优选实施方式的试剂盒或装置还可以包括以下元件中的至少一种：
a.适用于Heatsens技术的外部光源，例如激光或LED灯；
b.具有光子特性的金属纳米颗粒；和
c.任选地，能够检测金属纳米颗粒在被外部光源照射时产生的热量的装置。
在本发明的第十七方面中，本发明的第六方面或其任何优选实施方式的试剂盒或装置还可以包括以下元件中的至少一种：
a.适用于Heatsens技术的外部光源，例如激光或LED灯；
b.能够识别目标分析物的第二识别分子(检测用生物分子)，所述目标分析物任选地与标记分子结合；或
c.具有光子性质的金属纳米颗粒，其用特异性地识别检测用生物分子的生物分子或修饰检测用生物分子的标记官能化；和
d.任选地，能够检测金属纳米颗粒在被外部光源照射时产生的热量的装置。
优选地，本发明的第十五至第十七方面中任一方面的试剂盒或装置还包括能够检测金属纳米颗粒在被外部光源照射时产生的热量的装置，该装置选自红外相机或热电堆。
最后，本发明的第十八方面涉及本发明的第十四至第十七方面中任一方面的试剂盒或装置用于根据金属颗粒被外部光源照射时产生热量而检测分析物的体外用途。
在此广泛和一般地描述了本发明。落入一般公开内容内的每个较窄种类和亚属分组也构成本发明的一部分。这包括本发明的一般描述以及对于从属中去除任何主题的附带条件或否定限制，无论在本文中是否具体叙述了被切除的材料。
其他实施方式在以下权利要求和非限制性的实施例内。另外，在按照组来描述本发明的特征或方面的情况下，本领域技术人员将认识到，本发明也因此按照组的任何单个成员或成员子组的形式描述。
实施例
材料和方法
-微芯片的制造
已经在本发明的微流控芯片中实施了用于检测病原体(例如沙门氏菌和弯曲菌)、过敏原(例如Ara h1)和其他蛋白质分子(例如白蛋白和胶原蛋白)的夹心免疫测定。如图1所示，适当地设计和制作本发明的微流控芯片，以满足以下目标规格：
1.使用热塑性材料(共-烯烃聚合物)制造微流控芯片，特别是使用厚度范围为50mm至150mm的膜。通过使用热塑性材料来构建本实施例中使用的微芯片，所述热塑性材料在监测温度的一侧的厚度约为100μm。
2.集成尺寸约为5x3mm，深度为0.1mm并且总容积为1ml至3ml的微室。微流控室的容积为1μl。
3.每个微室彼此应远离至少10mm。
4.易于使用的设计以允许插入至少3种不同的液体。
5.集成5种不同的检测通道。
●1x对照，也是校准曲线：
■每个检测通道包括5个微室阵列。所有微室都排成直线，包括每个微室专用的入口和出口。
●4x检测：
■每个检测通道包括排成直线的3个微室。
■每个检测通道具有专用入口。
最终的芯片设计包括三个专用入口以允许直接向前插入试剂(见图1)。然后将检测性测定分到5个不同的微通道中。位于盒顶部的微通道专用于执行校准方案。该微通道包括5个具有已知浓度的分析物的不同微室。其他4个微通道用于测定本身，从而允许使用不同的样品和内部对照。为了避免污染问题，使用专用入口注入每个样品。此外，每个样品微通道被设计为包括3个相等的微室以进行统计学相关的平行测定。
从概念上讲，微流控芯片的布局最初是为了特异性检测家禽部门中存在的病原体而设计的，但本文提到的微芯片也成功地应用于检测其他生物分子，例如Ara h1、胶原蛋白和白蛋白。在这个意义上，本发明不限于本文描述的微流控芯片的具体布局。
-用于微芯片的不同官能化的试剂
4-(4-氨基苯基)丁酸(PhBut)、亚硝酸钠(NaNO2)、次磷酸(水中含50wt％H3PO2)、N-(3-二甲基氨基丙基)-N'-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)，N-羟基磺基琥珀酰亚胺钠盐(磺基-NHS)，Nα,Nα-双(羧甲基)-L-赖氨酸水合物(ANTA)，硫酸铜(II)，20mM HEPES缓冲液pH8.0、2.5N NaOH溶液，1N HCl溶液，无水乙醇(EtOH)，I型蒸馏水(>18.2Mohm-1)。链霉亲和素Ref7100-05Lote A2805-PA05H。2％的3-(2,3-环氧丙氧基)丙基三甲氧基硅烷的干甲苯溶液。10mM碳酸盐缓冲液pH 10.8。10mM MES(2-(N-吗啉代)乙磺酸)缓冲液，pH 5。食人鱼溶液(H2SO4:H2O2为3:1)
-用于检测鼠伤寒沙门氏菌的试剂
a.捕获抗体：抗鼠伤寒沙门氏菌0-4抗体[1E6]ab8274-Abcam 2mg/mL.
b.5μg/mL溶解于PBS 1X.
c.封闭：TBS-T 0.1％+BSA 5％.
d.抗原：BacTrace鼠伤寒沙门氏菌阳性对照编号50-74-01-KPL.细胞计数：3×109CFU/mL.
e.检测抗体：抗沙门氏菌抗体(生物素)ab69255-Abcam 4mg/mL
f.稀释度：1/5.000稀释于TBS-T 0.1％+BSA 5％.
-用于检测空肠弯曲菌的试剂
a.捕获抗体：抗空肠弯曲菌抗体ab155855Lote：GR146930-4 0.1mg/mL.
b.稀释度：1/20＝5.0μg/mL PBS1X.
c.抗原：BacTrace空肠弯曲菌阳性对照编号50-92-93.Lot 140513-KPL细胞计数：4.64x108CFU/mL.
d.检测抗体：抗空肠弯曲菌抗体-生物素ab53909Lot GR93260-3.
e.稀释度：1/1000TBS-T 0.1％+BSA 5％.
-用于检测Ara h1的试剂
a.捕获抗体：单克隆抗体2C12小鼠IgG1Lot：30083 2.7mg/mL
b.稀释度：1/500＝5.4μg/mL PBS1X.
c.过敏原标准nArah1Ref EL-AH1-Standard.Lot 38018 20.000ng/mL.
d.检测抗体：单克隆抗体2F7小鼠IgG1-生物素化Lot 36069.
e.稀释度：1/1000PBS-T 0.1％+BSA 5％.
f.稀释度：1/2000PBS-T 0.1％+BSA 5％.
-用于检测白蛋白和胶原蛋白的试剂
a.OVA多克隆抗体：山羊抗兔IgG H&L(生物素)，Abcam编号:ab6720
b.小鼠中产生的单克隆抗鸡蛋清白蛋白(卵清蛋白)抗体，Sigma编号:A6075
C.抗胶原蛋白I小鼠单克隆抗体，GeneTex编号:GTX26308
d.抗胶原蛋白I兔多克隆抗体(生物素)，Genetex编号:GTX26577
实施例1.通过重氮化PhBut的共价接枝用羧基对微流控芯片表面进行官能化
通过化学还原(H3PO2)和UV照射来产生与芯片室表面结合(方案II)的重氮化PhBut(方案I)的芳基的共价接枝，由此实现用羧基进行的表面官能化。
方法
1.Phn的重氮化
通过在0.5M HCl中制备的0.1M PhBut溶液中溶解一定量的NaNO2，得到0.3M终浓度，在使用之前，在冰浴中在原位获得重氮化PhBut。在用于表面修饰之前，将该混合物在4℃保持10分钟。
方案I.PhBut的重氮化反应
2.重氮化PhBut的共价接枝
在表面修饰之前，芯片用乙醇冲洗并干燥。然后，通过暴露于波长为365nm的UV灯(8W)下，用紫外线(UV范围为305nm至395nm)光照射芯片15分钟。将正如上所述制备的重氮化PhBut溶液与H3PO2酸溶液混合，达到0.16M终浓度，并滴加在芯片室上。将它们再次置于UV灯下并在365nm的波长下照射30分钟。最后，将经修饰的芯片从灯下移去并用无水EtOH彻底地冲洗。
方案II.通过重氮化PhBut的共价接枝用羧基对微流控室芯片进行表面官能化
实施例2.用次氮基三乙酸-Cu(II)对羧酸封端表面进行微流控芯片修饰
NTA-Cu(II)表面修饰通过活化羧基以及经EDC/SNHS介导的酰胺化与ANTA的伯胺(-NH2)直接反应来实现(方案III)。
方案III.用次氮基三乙酸-Cu(II)络合物对微流控室芯片的羧酸封端表面进行官能化的连续步骤
表面修饰的室的羧酸酯基团的活化以及随后用ANTA-Cu(II)络合物使NHS-酯酰胺化的步骤分几步进行。首先，通过将磺基-NHS试剂溶解在I型蒸馏水中并转移至EDC试剂来制备20mM SNHS和10mM EDC溶液。将含有试剂的该溶液滴在芯片室上并使其在室温下反应1小时。然后，用I型蒸馏水冲洗芯片，并在25mM ANTA的10mM碳酸氢钠溶液(pH 10)溶液中孵育过夜，以引入螯合物。最后，在用水洗涤以移除过量的试剂并干燥之后，通过在100mM硫酸铜(II)水溶液中孵育芯片室3小时，在表面上形成次氮基-三乙酸-铜(II)络合物(ANTA-Cu2 +)。再次洗涤芯片并干燥，准备用于抗体固定。
实施例3.用其他次氮基三乙酸-M(II)(Ni2+、Co2+)络合物对羧酸封端表面进行微流控芯片修饰
其他NTA-M2+络合物的表面修饰也可以按照与NTA-Cu(II)相同的方法，用与上述浓度相似的相应的金属盐(CoCl2，NiSO4或NiCl2)代替CuSO4来完成。NTA-螯合的金属原子对带组氨酸标签的蛋白质和抗体的结合亲和力遵循Cu(II)>Ni(II)>Co(II)的顺序。
实施例4.玻璃表面的官能化
已经对玻璃表面进行了两种类型的生物官能化，即共价非定向固定和定向固定。为了活化玻璃载体，在定轨振荡器中在室温下用食人鱼溶液清洁表面1小时。随后，用milli-Q水冲洗载玻片并干燥。然后，将2％的3-(2,3-环氧丙氧基)丙基三甲氧基硅烷的干甲苯溶液在定轨振荡器中在室温下添加到活化的玻璃载体上过夜。然后，用甲苯和10mM碳酸盐缓冲液(pH 10.8)彻底洗涤载玻片。使载玻片干燥后，将玻璃载体与25mM NTA在定轨振荡器中在室温下孵育3小时。然后，用pH10.8的10mM碳酸盐缓冲液彻底洗涤玻璃载体。
为了进行定向固定，将NTA-表面在室温下与100mM CuSO4水溶液孵育过夜以形成络合环境。然后，用milli-Q水洗涤载玻片。对于非定向共价固定，NTA表面用10mM MES(pH5)中的50mM EDC和75mM SNHS在室温下加载45分钟，以进一步活化羧基。然后，用10mM MES(pH 5)洗涤表面。
实施例5.表面官能化-用捕获抗体修饰微流控室芯片
1.物理吸附
在进行抗体表面修饰之前，用EtOH冲洗芯片并干燥。然后将在PBS 1X中的5μl 5μg/ml捕获抗体仅加到微流控通道内的微流控室(传感区域)的表面上，并在37℃下孵育1小时。
用PBS 1X冲洗表面并在4℃下用封闭缓冲液(含BSA 5％的PBS 1X，0.1％吐温)孵育过夜。
洗涤表面并将芯片与上部(PMMA)组装并连接到蠕动泵。
2.用捕获抗体进行羧基化官能化的微流控室芯片表面修饰：共价抗体固定
表面经修饰的室的羧酸酯基团的活化以及随后用捕获抗体进行的NHS-酯酰胺化按如下所述的两步法进行：
1.将羧基化微室与10μl 10mM MES缓冲液(pH 6)中的10mM EDC和20mM SNHS孵育10分钟。
2.用10mM MES(pH 6)洗涤，并在每个微室上用10μl的5μg/ml捕获抗体在37℃下孵育1小时。
在捕获抗体共价固定并用含5％BSA的PBS1X/0.1％吐温在37℃下封闭表面1小时后，将芯片连接到蠕动泵，并使用300μl/min的流速用洗涤缓冲液冲洗每个通道4分钟。
3.用捕获抗体修饰次氮基三乙酸-M(II)(Cu2+、Ni2+、Co2+)络合物官能化的微流控 室芯片：定向抗体固定
使用捕获抗体对NTA-M(II)(Cu2+、Ni2+、Co2+)官能化的微流控室芯片的修饰以如下所述的单个步骤中进行：仅在微流控通道传感区域的表面沉积5μl的5μg/ml捕获抗体，并在37℃下孵育1小时。
然后冲洗表面并在4℃下用封闭缓冲液(含BSA5％的PBS1X，0.1％吐温)孵育过夜。接下来，冲洗表面并将芯片与上部(PMMA)组装并连接到蠕动泵。
实施例6.使用微流控芯片的免疫测定
在下文中，我们说明了在用于检测沙门氏菌的材料和方法中所提到的微芯片中实施的不同的免疫测定。此外，我们还比较了用这些方法获得的结果。
1.用于沙门氏菌检测的直接免疫测定：使用以两种不同稀释度的沙门氏菌直接官能化的芯片进行的第一次测试的温度增量
将材料和方法中说明的所制造的未经修饰的微流控芯片用于测试两种稀释度的沙门氏菌的直接固定。
使10μl的60000CFU/ml和20000CFU/ml(表面上分别总计为600和200CFU)鼠伤寒沙门氏菌吸附在检测表面上。在直接固定病原体后，用BSA封闭表面并使该表面与生物素化检测抗体反应。最后，对其进行洗涤并进一步与链霉亲和素-金纳米棱镜溶液反应。
为了测试免疫测定的特异性，进行以下对照实验：1)NC1＝不存在沙门氏菌，表面被BSA5％封闭；2)NC2＝不存在生物素化检测抗体；3)NC3＝不存在链霉亲和素-金纳米棱镜。
在图2中，报道了在沙门氏菌被生物素化检测抗体识别并且与链霉亲和素-纳米棱镜进一步相互作用之后，在NIR照射表面时测量由沙门氏菌的存在所引起的温度增量。
在不存在生物素化检测抗体(NC2)的情况下，温度没有显著的增量，这与在没有链霉亲和素@金纳米棱镜(NC3)的情况下一样。
温度增量与沙门氏菌的CFU量成比例。这些结果表明该材料在制造微流控芯片及在HEATSENS中的应用上的适用性。此外，结果设想了将不同CFU稀释度的沙门氏菌直接固定在微流控芯片上并制定校准曲线的可能性。
2.用于沙门氏菌检测的直接免疫测定：在微流控芯片上直接固定沙门氏菌并检测两种不同稀释度的沙门氏菌的第一次测试的温度增量.校准曲线测试构建
使10μl不同浓度(CFU/ml)的鼠伤寒沙门氏菌(范围为0至240000CFU/ml)直接吸附在微流控芯片上，并用生物素化抗体抗沙门氏菌检测，以测量由于存在不同浓度的沙门氏菌所引起的温度增量。然后链霉亲和素@金纳米棱镜与抗体相互作用，用IR激光照射每个单独的传感区域。测量每个室的温度，并计算温度增量。图3显示了计算温度增量随沙门氏菌CFU/ml量变化而变化。
在微流控芯片上直接吸附，并用生物素化抗沙门氏菌抗体检测，以测量由于不同浓度沙门氏菌的存在所引起的温度增量。然后链霉亲和素@金纳米棱镜与抗体相互作用，并用IR激光照射每个传感区域。测量每个室的温度，并计算温度增量。图3显示了计算出的随沙门氏菌CFU/ml量而变化的温度增量。
测得的温度升高是由于直接吸附在微流控芯片表面上的CFU量增加。
3.用于沙门氏菌检测的夹心免疫测定：在微流控芯片上用夹心免疫测定检测两种不同稀释度的沙门氏菌的第一次测试的温度增量
已显示微流控芯片适合应用于HEATSENS技术，我们通过使用微流控芯片进行夹心免疫测定以检测所选病原体。为此目的，通过使(5μL)5μg/ml抗沙门氏菌捕获抗体直接吸附到表面上，用抗沙门氏菌捕获抗体来使微芯片的每个微室官能化。然后，以在每个通道中注射1ml样品的流控模式进行沙门氏菌的捕获活动以及检测和与链霉亲和素-金纳米棱镜的相互作用。
用稀释于缓冲液磷酸盐中的2种不同浓度的沙门氏菌(以CFU/ml计即200000CFU/ml和240000CFU/ml)，分别进行测定。图4描述了由于鼠伤寒沙门氏菌的存在而引起的温度增量的趋势。
校准曲线的趋势不是线性的，表明由于存在与分析物相互作用的大量纳米棱镜而导致信号饱和。根据指数方程计算两种未知浓度的沙门氏菌的检测，其中值与校正决定系数等于0.98843的曲线一致。
已显示夹心形式的免疫测定的有效性，我们试图通过降低掺杂缓冲液中病原体的浓度来改善鼠伤寒沙门氏菌的检测限。
以第一次试验中检测到的PBS 1X中的1500CFU/ml的鼠伤寒沙门氏菌为第一个较低浓度。
将1ml样品以200μl/ml的流速注入通道中。注射样品后，使用缓冲液(含BSA 0.5％的PBS1X，0.1％吐温)用300μl/min的流速洗涤4分钟。然后使用200μl/ml使检测抗体与其抗原相互作用2分钟。使用洗涤缓冲液(含BSA 0.5％的PBS1X，0.1％吐温)用300μl/min的流速洗涤通道4分钟。将链霉亲和素@金纳米棱镜注入通道中。流速为200μl/ml，持续2分钟。使用洗涤缓冲液(PBS1X和0.1％吐温中的BSA 0.5％)用300μl/mim的流速冲洗通道4分钟并干燥。
图5示出了相对于阴性对照，1500CFU/ml沙门氏菌的温度增量。存在沙门氏菌的微室的温度增量高于分别为不存在沙门氏菌(NC1)、不存在检测抗体(NC2)和不存在链霉素-金纳米棱镜(NC3)的对照的温度增量。
由沙门氏菌的存在所引起的温度增量高于所有阴性对照，即使这与以下预期值不同：表明免疫测定中的试剂之间存在非特异性相互作用的阴性对照的温度增量的正值。在免疫测定期间，非特异性相互作用可能与不完全的官能化和表面封闭相关或与不适当的流速相关。这样，通过在免疫测定期间保持表面抗体官能化恒定并改变流速，可以提高沙门氏菌的检测限和由于背景引起的信号，如图6所示。
使用真实食品样品含25g鸡肉的225ml蛋白胨预富集培养基，掺入不同CFP的沙门氏菌来进行相同的实验。使捕获抗体吸附在微流控芯片上，并通过含5％BSA的PBS 1X-0.1％吐温用150ml/min的流速封闭表面。
然后，通过使用洗涤缓冲液，用250μl/min的流速进行洗涤。
通过使用流速为15μl/min的流体，对1ml真实样品中的沙门氏菌进行捕获，并且检测生物素化检测抗体，以及与链霉亲和素纳米棱镜的相互作用。
在微流控芯片中进行的免疫分析的结果如图7所示。
在制定校准曲线后，测量由于已知不同浓度的沙门氏菌所引起的温度增量，由校准曲线来确定真实样品中未知的病原体浓度(图8)。
掺入沙门氏菌的样品温度增量较高，清楚地表明HEATSENS适合于在复杂基质(例如含25g鸡肉的225ml蛋白胨)中对极低CFU的细菌进行超灵敏检测。
在真实样品中，由于沙门氏菌的存在所引起的温度增量与磷酸盐缓冲液中的温度增量略有不同，这是因为存在大量的肉蛋白质会影响细菌与抗体的特异性相互作用。
4.用于沙门氏菌检测的夹心免疫测定：捕获抗体的共价固定对微流控芯片的作用
用羧基末端基团对微流控芯片表面的修饰可以用于通过用捕获抗体的伯胺经EDC/磺基-NHS反应形成稳定的酰胺键来共价固定捕获抗体。
在这个意义上，将先前用10mM EDC和20mM磺基-NHS活化的每个微室的表面用20μl的5μg/ml捕获抗体进行官能化。在捕获抗体共价固定并且在37℃下用PBS 1X/0.1％吐温中的BSA 5％封闭表面1小时后，将芯片连接到蠕动泵并使用洗涤缓冲液用300μl/min的流速洗涤4分钟。使1ml的30CFU/ml的鼠伤寒沙门氏菌以150μl/min的流速在微流控通道内流动1分钟，接着使用缓冲溶液用300μl/min的流速洗涤通道4分钟。然后使400μl生物素化检测抗体在通道内流动。
图9中描绘的结果显示，与不同对照的温度增量相比，掺入30CFU/ml沙门氏菌的样品中的温度增量更高。在这种类型的固定中，抗体主要采用“平铺(flat-on)”定向，其中Fc和两个Fab片段平铺在表面上。
5.用于沙门氏菌检测的夹心免疫测定：在微流控芯片上通过金属螯合使捕获抗体定向固定
通过金属螯合定向固定抗体构成了如本文所示的最佳和通用方法。通过金属螯合到抗体的重链(Fc)中的富含组氨酸的金属结合位点或融合在蛋白质中的poly-His-标签序列来完成固定。由于金属结合位点位于C末端或N末端，因此以这种方式结合到表面的抗体和带His标签的蛋白质被定向为其结合位点指向远离表面的方向，从而允许最大的抗原结合或有利的蛋白质定向。此外，因为由于组氨酸结合的螯合作用与多个金属螯合基团的靶结合组合在一起，导致金属螯合固定的结合常数非常高，所以通过金属螯合的定向固定还导致稳定的抗体固定。结合常数估计为10-7M-1至10-13M-1。对于许多应用来说，这提供了与抗原-抗体相互作用相当的结合强度。另一方面，通过金属螯合使抗体定向固定的抗体附着实验条件比共价定向固定方法的抗体附着实验条件更温和。作为优点，为了方便起见，与螯合物结合的抗体也可以被调节为可逆的或不可逆的。此外，因为与螯合物结合的抗体也可用于带His标签的重组蛋白的固定，因而它也更通用。
为了实现捕获抗体的定向固定，在微流控室芯片的表面以逐步修饰的方式用金属-螯合物络合物来使微流控室芯片官能化。首先，用含有羧基的芳胺化合物(例如3-(4-氨基苯基)丙酸、3-氨基苯基乙酸、4-氨基苯基乙酸或4-(4-硝基苯基)丁酸)使表面官能化。对于该具体实例，我们使用PhBut，即便对于固定不同的生物分子，使用携带范围在2至16个碳之间的不同长度的正烷基羧酸的芳胺化合物是更合适的。
通过共价接枝重氮化PhBut的芳基自由基以引入的羧基(方案II)是通过EDC催化SNHS酯化来活化的，以便通过游离氨基促进ANTA-M(II)(Cu2+、Ni2+、Co2+)络合物的共价连接(方案III)。然后，将它们与20μl的5μg/ml捕获抗体一起孵育。得到的NTA-M(II)络合物终产物含有被水分子占据的两个自由配位点，所述两个自由配位点被捕获抗体的组氨酸残基取代，从而引起抗体的定向固定。然后，将芯片连接到蠕动泵并使用洗涤缓冲液用300μl/min的流速洗涤4分钟。使1ml的30CFU/ml的鼠伤寒沙门氏菌以150μl/min的流速在微流控通道内流动1分钟，接着使用缓冲液用300μl/min的流速洗涤通道4分钟。然后使400μl生物素化检测抗体在通道内流动。
图10示出了在用捕获抗体以定向方式官能化的微流控芯片上对沙门氏菌的检测。
有趣的是，对于这种类型的固定，由于沙门氏菌的存在所引起的温度增量高于各自对照所获得的温度增量，甚至高于之前直接吸附和共价固定的结果中所获得的温度增量。在这个意义上，进行了不同固定方法之间的比较研究。图11显示对抗体表面官能化的不同策略的比较，其中该图显示了对于本实施例中所示的每种表面官能化策略，与产生的背景信号相比，由于检测到的沙门氏菌所引起的温度增量。
图11示出捕获抗体通过金属螯合进行定向固定因提供由于沙门氏菌的存在所引起的最高温度增量，且因提供由非特异性相互作用(背景)产生的最低信号，而提供了最佳结果。这些结果表明，芯片表面的正确官能化策略对于以有利的定向获得最佳抗体附着同时避免HEATSENS标记(金纳米棱镜)的非特异性吸附是至关重要的。值得注意的是，该方法显示出优于共价定向固定的优点。尽管两种方法都具有获得用于结合的定向抗体附着的优点，但是在金属螯合固定的情况下，抗体被放置成垂直于表面的“端点在上(end-on)”定向，这与抗体主要采用Fc和两个Fab片段平放在表面上的“平铺”定向的共价固定形成对比。
实施例7.检测真实食品样品中的沙门氏菌
然后对实施例6中所示的有利的抗体定向固定进行测试以检测真实样品中的沙门氏菌。图12报告了结果，其显示了与阴性对照产生的信号相比，在掺杂有已知数量的沙门氏菌CFU的真实样品中，由于沙门氏菌所引起的温度增量。
在抗体定向固定的微流控芯片表面上由于真实样品中沙门氏菌的存在所引起的温度增量也高于各个对照获得的温度增量。
在制定校准曲线后，确定由已知的不同浓度的沙门氏菌和真实样品中未知浓度的病原体所引起的温度增量的测量结果，如图13所报告的。
由用于掺杂真实样品的CFU/ml的理论值的存在所引起的温度增量与校准曲线的CFU数值一致。
实施例8.用于空肠弯曲菌检测的夹心免疫测定：捕获抗体在微流控室表面上的定向固定
将微流控室的捕获抗体定向官能化的制定方案与夹心免疫测定一起用于检测不同于沙门氏菌的病原体(例如空肠弯曲菌)，以证明该技术的通用性。
空肠弯曲菌作为与沙门氏菌属(Salmonella spp.)、单核细胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes,L.monocytogenes)和大肠杆菌(Escherichia coli,E.coli)O157:H7并称的四大细菌病原体中的一种，估计约占食品相关死亡原因的67％(Mead etal.,1999)。在全球，常规上使用不同的定量方法对弯曲菌进行筛选，这些方法可用于检测食品中的这种病原体，该方法例如培养、显微镜检查、计数法以及生物化学测试PCR，免疫测定(Yang et al.,2013)。上述方法中的一些方法灵敏且快速，但具有缺陷，例如实际上，昂贵、需要大量样品制备、选择性差且耗时的。事实上，对于沙门氏菌，由于大多数基于家禽的产品在生产日期后的几天内被消费，这对现有方法提出了挑战，因为在执行该方法时，人群暴露于弯曲菌而导致食源性疾病的爆发(Che et al.,2001)。
在微流控芯片中使用HEATSENS对空肠弯曲菌进行免疫检测提供了有成本效益的、快速、简便、灵敏且可靠的诊断方法。
购买热灭活和冻干的空肠弯曲菌。将它们以不同的稀释度在PBS中重悬，并用于生成校准曲线，以进一步检测博尔顿培养基中的未知样品(图14)。
HEATSENS技术和微流控室表面的抗体定向官能化的组合使得在博尔顿培养基中实现弯曲菌的低LOD(检测限)。
与Masdor等人报道的的空肠弯曲菌传感(Masdor et Al.Biosensors andbioelectronics 78,2016,328-336，该文献描述检测150CFU/ml弯曲菌的QCM灵敏夹心免疫测定的开发)相比，HEATSENS允许检测低于100CFU/ml的这种特定的细菌病原体。
此外，实现这种检测限，固定在表面上的捕获抗体减少210倍，从而降低背景并降低芯片的生产成本。
实施例9.用于Ara h 1检测的夹心免疫测定：捕获抗体在微流控室表面上的定向固定
为了进一步说明本方法的通用性，我们用更进一步的分析物进行了本实施例。
花生(Arachis hypogaea)是与严重过敏反应相关的最常过敏原之一，包括危及生命的食品引起的过敏反应。根据美国2004年食品过敏原标记和消费者保护法(FALCPA2004，公共法108-282，标题II)和欧盟由指令2003/19/EC和2007修订的指令2000/13/EC/68/EC，食品中存在花生则必须在其标签上声明。
即便还存在其他分析方法，例如HPLC、毛细管电泳(CE)、激光诱导荧光(LIF)检测方法、酶联免疫亲和层析(ELIAC)、尺寸排阻色谱和SPR，但目前用于检测食品过敏原的参考方法是ELISA。图15中示出了确定的ELISA的LOD。
HEATSENS技术与微流控室表面的抗体定向官能化的组合允许使用相同的捕获抗体和检测抗体对实现PBS中的Ara h1的较低LOD(图16)。
因此在生物测定中将HEATSENS与定向官能化微流控表面的组合成功地用于检测Ara h1。
与商用ELISA试剂盒(LOD≈10ng/ml)相比，Ara h1的生物传感器检测限提高了一个数量级(LOD<0.4ng/ml)，并且与其他检测方法(如SPR)相比，Ara h1的生物传感器检测限提高了若干个数量级(J.Pollet et al./Talanta 83(2011)1436–1441)。
实施例10.应用于其他分析物的微流控中的HEATSENS
历史上涂料粘合剂的表征仍然依赖于几十年前开发的传统分子生物学方法，这些方法已经被利用新兴纳米技术世界的优势的、更灵敏、更具特异性、更便宜且更快速的方法而取代。
在微流控芯片中HEATSENS应用于检测胶原蛋白和白蛋白，胶原蛋白和白蛋白是文艺复兴前期绘画、手工绘本和雕塑中最常用的两种粘合剂。该实施例再次进一步说明了本方法的通用性
1.检测吸附在微流控芯片室表面上的白蛋白的直接免疫测定
我们实施直接免疫测定以检测白蛋白。为了这个目的，将白蛋白作为阳性对照(PC1)，两种微量样品：一种是来自的白蛋白粉末(样品4)，而另一种来自涂覆在玻璃表面上在空气中暴露了一年半的釉(glair)(样品5)，将样品直接固定在微流控室表面上。固定后，用PBS中的牛奶3mg/mL来封闭芯片表面，在37℃下覆盖芯片表面(至少)1小时并摇动。
为了测试免疫测定的特异性，进行以下对照实验：1)NC1＝不存在白蛋白，和2)NC2＝不存在检测抗体。
图17描绘了在沉积方案之后在微流控芯片中进行的直接免疫测定的结果。
结果表明，在生物测定中HEATSENS与官能化微流控表面结合使用，能够检测颜料中的白蛋白。本发明的传感方法还提供了如在颜料中那样的复杂基质中进行白蛋白定量的可能性。
2.使用共价固定在微流控芯片表面上的捕获抗体检测胶原蛋白的夹心免疫测定
胶原蛋白的检测也通过使用夹心形式的免疫测定来实施。
使用已经描述的固定方案将捕获抗体固定在微流控芯片表面上，并且使以下两种微量样品在微流控芯片内流动：一种是来自含兔皮胶(10％w/w)的水(样品4)和另一种微量样品来自检测抗体识别的40多年前涂覆的由胶+CaCO3的混合物制成涂料(真实样品)。
为了测试免疫测定的特异性，进行以下对照实验：1)NC1＝不存在胶原蛋白，和2)NC2＝不存在检测抗体。
HEATSENS技术与微流控室表面的抗体官能化的组合允许识别真实样品中的胶原蛋白。
图18示出了在微流控芯片中使用HEATSENS技术进行胶原蛋白检测的结果。
结果表明，在夹心免疫测定中，HEATSENS与官能化微流控表面结合使用能够检测颜料中的胶原蛋白。本发明的传感方法还提供了在如颜料中那样的复杂基质中进行胶原蛋白定量的可能性。
实施例11.夹心免疫测定方案
已发现以下方案特别适用于使用微流控装置和Heatsens技术的夹心免疫测定：
1.通过以150μl/ml的流速泵送洗涤缓冲液(含BSA 0.5％的PBS1X，0.1％吐温)5分钟来使通道平衡。
2.然后将1ml分析物样品以150μl/ml的流速注入通道中。
3.进样后，使用洗涤缓冲液(含BSA 0.5％的PBS1X，0.1％吐温)用300μl/min的流速洗涤通道4分钟。
4.将检测抗体注入通道中。流速为150μl/ml，持续2.5分钟。
5.注入检测抗体后，使用洗涤缓冲液(含BSA 0.5％的PBS1X，0.1％吐温)用300μl/mim的流速洗涤通道4分钟。
6.将链霉亲和素@金纳米棱镜注入通道中。流速为150μl/ml，持续2.5分钟。
7.在链霉亲和素@金纳米棱镜后，使用洗涤缓冲液(含BSA 0.5％的PBS1X，0.1％吐温)用300μl/min的流速洗涤通道4分钟，并干燥。
实施例12.将定向官能化方法扩展到其他材料表面。
通过用金属螯合物在微流控芯片上官能化的定向固定方法可以扩展到其他类型的表面，例如金属(铁、钴、镍、铂、钯、锌、铜、和金)，碳(石墨烯、金刚石、纳米管、纳米点)和硅表面。含有羧基的重氮芳基衍生物的接枝也可以在这些表面上完成，所述表面是用于与金属螯合物层进一步逐步官能化的平台。
还可以通过用携带有羧酸官能团或环氧基团的有机官能烷氧基硅烷分子进行自组装来覆盖表面，从而使其它表面(例如聚二甲基硅氧烷(PDMS)和玻璃)官能化。以这种方式，对通过硅烷化和进一步引入金属螯合物层(NTA-Cu2+)用环氧基团官能化的玻璃表面进行研究。测定金属螯合物官能化的玻璃表面的生物分子的定向和非定向共价固定，并采用夹心免疫测定以灵敏方式检测分析物。
简单的玻璃表面修饰分四步进行。第一步，进行玻璃载体的活化以除去所有有机残留物，以便将环氧硅烷接枝在表面上。在第二步中，用干甲苯进行环氧硅烷的官能化，以避免硅烷形成凝胶。表面上的环氧基团确保在pH10.8下与NTA的胺基的有效反应，其中NTA的胺以高摩尔比打开环氧基团。最后，在最后一步中，将载体与100mM CuSO4一起孵育，以便将金属离子螯合到NTA部分上，从而使分析物定向。
一旦载玻片用NTA-Cu2+官能化，就(通过使用定向固定)使用HEATSENS技术进行免疫测定以检测沙门氏菌。为了比较，还测定了其他固定方法，例如直接吸附和共价平铺抗体固定。图19展示了抗体表面官能化的不同策略的结果，其中针对每种表面官能化，显示了与所产生的背景信号相比，由于检测到的沙门氏菌所引起的温度增量。
该图再次证明，通过金属螯合的进行捕获抗体的定向固定不仅在由于沙门氏菌的存在而所引起的高温度增量方面，而且在提供由非特异性相互作用(背景)导致的空信号方面提供了最佳结果。由此表明，正确的官能化策略是以有利的定向获得最佳抗体附着，同时避免HEATSENS标记(金纳米棱镜)的非特异性吸附的至关重要的步骤。
玻璃表面官能化快速、容易、简单且便宜，并且可用于不同类型的生物分子。
实施例13.用于测量由目标分析物的存在所引起的温度增量的热传感器的不同构造的描述
使用用于分析物捕获的微流控芯片的HEATSENS传感设备的重要优点是所有部件都适合于以多种不同方式组装并小型化，图20示出了其中一种方式。
传感器系统的两种可能构造如下：
1.热传感器在样品后面；和
2.热传感器在样品前面。
从这个意义上说，我们可以将激光和热电堆(热传感器)放在同一平面上同时热电堆指向样品，或轻微向上倾斜，或放在不同的平面上。倾斜是由于热电堆的饱和。当激光束直接照射到热电堆时，每个温度值都达到最大值并且测量是无效的。热电堆的FOV为10°x40°，发生反应的位置处的相机高3mm，宽5mm。这导致样品和热电堆之间的最佳距离为17mm，以覆盖相机；确保在20mm处设定测量。
如果我们将激光器和热电堆放在同一平面上并且我们从后面进行测量，则样品位于热电堆旁边的较窄宽度处，这样检测到的热量就不会散开，我们可以获得总的信息。
通过使用图20中所示的构造(相同平面)记录的结果表明温度增量相对于沙门氏菌CFU数量的增量是线性的，其中采集的样品与校准曲线一致(参见图21)。
然而，激光和热电堆也可以放置在不同的平面中。热电堆再次指向样品，纵向倾斜(≈40°)以避免激光照射(图22)。到样品的距离也设定为热电堆可以检测样品的热增量的20mm处。
在样品前面测量需要在热电堆和激光器侧的宽度较薄。这里激光以聚焦方式照射，光线通过微流控芯片的较薄部分并照射样品。
在图23中，合成曲线是指数曲线，这些值与校正决定系数等于0.99864的曲线相一致。测量的饱和度清晰可见。在这种特定情况下，由于所呈现的构造与纳米棱镜在激光照射下的行为的组合，在存在非常低浓度的纳米棱镜下实现饱和，这是因为与先前的处置相比，检测限增加，在更低的CFU下实现更高的温度增量。
使用Ventus激光系统实现了所呈现的结果，但考虑到HEATSENS技术的特性，也可以使用其他NIR光源，例如激光二极管和LED。
实施例14.根据本发明的抗体固定方法与导致羧基生成的通过UV照射(185nm)使 聚苯乙烯表面官能化的方法的比较
对于传感应用，识别生物分子在发生传感的载体上的固定必须尽可能稳定，定向并具有高产率，以提供对传感平台来说的高灵敏度。
对于HEATSENS传感平台，如本说明书中所报道的，针对用于实施传感平台的捕获抗体的特定定向固定，已经修饰了化学物质。对于通过NTA-M2+与抗体重链(Fc)中存在的富含组氨酸的金属结合位点的金属螯合来将抗体定向固定在表面上，有两个关键因素：
1)在配位结合组氨酸残基中采用的金属。
2)用于抗体成功定向固定的金属螯合物表面密度。
HEATSENS传感平台的第一个关键因素是采用的NTA-金属螯合物。在这个意义上，我们已经分别用NTA-金属螯合物NTA-Cu2+和NTA-Co2+，使用抗HRP和抗CD3来测定抗体在金纳米颗粒上的固定，以证明待用的独特方法使HEATSENS传感平台实现了高灵敏度。
通过测量固定过程中每个步骤之前和之后残留在上清液中的蛋白质来计算固定化抗体的量。取出样品并通过SDS-PAGE来分析。使用凝胶(12％)并用银染色。
如在SDS-PAGE凝胶中可以看到的(图29)，对于两块凝胶，在抗体溶液中孵育后用NTA-Co2+官能化的金纳米颗粒对进样样品和固定后的上清液(泳道1、2)分别给出了相似的结果，这表明了两种抗体均没有抗体分子的附着。相比之下，在两块凝胶的泳道7中，存在固定后的抗体的信号，其中凝胶1中没有出现条带，而凝胶2中出现了条带，这是由于抗体分子完全附着到用NTA-Cu2+官能化的金纳米颗粒的结果。
用NTA-Co2+和NTA-Cu2+官能化的金纳米颗粒上的抗体固定也通过与HRP一起孵育并测量其酶活性来评估。如图30中可见，只有用NTA-Cu2+螯合物修饰的金纳米颗粒在与抗HRP孵育后显示出酶活性，证实了抗体固定。相比之下，从用NTA-Co2+官能化的纳米颗粒观察到可忽略的活性。
还使用铜离子和镍离子官能化的平面表面商业条带(2D系统)证明了与其他二价金属相比，抗体对铜的高亲和力。在这个意义上，将抗HRP的抗体分子固定在这些官能化的金属-螯合物表面上，并且通过免疫比色测定来对捕获的HRP的存在进行定量。如图31A所示，NTA-Cu2+官能化表面显示出与HRP活性相关的更强烈的黄色。这表明存在比NTA-Ni2+官能化表面捕获的更高量的HRP酶并因此固定更高量的抗体。这通过测量相对于HRP的基底在450nm处的吸光度更清楚地显示于图31B中。NTA-Cu2+官能化表面显示出吸光度比NTA-Ni2+的高达5倍。
这些结果表明，与Ni相比，定向固定在用铜螯合物活化的表面上的抗体的结合能力更高。使用不对称金纳米颗粒作为标记进行相同的实验，以用于HEATSENS传感检测(请参考图32)。
通过使用HEATSENS检测方法也制定了更高的抗体捕获效率的铜螯合表面。从这个意义上，当10μg/mL的抗HRP固定在Cu离子上时，温度增量与Ni离子相比几乎是两倍。
所有这些结果证明了所采用的金属对抗体通过NTA-M2+的金属螯合而定向固定在表面上的重要性。
对抗体通过NTA-M2+与抗体重链(Fc)中存在的富含组氨酸的金属结合位点的金属螯合而定向固定在表面上具有强烈影响的另一个关键因素是金属螯合物表面密度，它影响抗体固定产率。为了证明这一事实，我们使用金表面经修饰的纳米颗粒作为3D系统，采用不同的NTA-Cu2+覆盖率进行抗体-HRP固定研究。这些通过改变作为催化剂以用于其合并的EDC/磺基-NHS的浓度而获得。
表1示出了固定在金纳米颗粒上的抗HRP的酶促HRP活性，所述金纳米颗粒分别用低表面覆盖率和高表面覆盖率的NTA-Cu2+和NTA-Co2+进行官能化。
酶活性(Abs/min) HRP进样对照 AuNPs-NTA-Cu<sup>2+</sup> AuNPs-NTA-Co<sup>2+</sup>
低覆盖率 0.027 0.0003 0.0003
高覆盖率 0.027 0.023 0.0024
表1：在用抗HRP和酶HRP孵育后，以低覆盖率和高覆盖率的NTA-Cu2+和NTA-Co2+官能化的金纳米颗粒的酶活性。
观察到，在与抗体-HRP孵育后，只有用高表面覆盖率的NTA-Cu2+官能化的金纳米颗粒才提供实际上与抗HRP固定相关的全部的酶活性。相反，对于用低浓度的NTA-Cu2+或NTA-Co2+修饰的金纳米颗粒则没有观察到活性。
这表明抗体固定受到表面上的金属螯合物密度的显著影响，这是要控制的至关重要的因素。
还评估了2D表面上的活性基团密度和金属密度对捕获抗体在发生检测的表面上的固定的影响。在这个意义上，我们比较了两种不同的方案。特别地，我们使用Chiu WaiKwok et al,“In vitro cell culture systems for the investigation of themorphogen Sonic hedgehog(Shh),Dissertation,16November 2011中描述的方案，其中微芯片表面通过UV照射(185nm)来官能化，导致羧基的产生。然后，我们通过二价金属(如Ni2+)与形成的羧基配位来形成螯合物。使用40mM NiSO2进行螯合，NiSO2与之前在COOH聚合物表面上通过末端氨基引入的N2,N2-双(羧甲基)-L-赖氨酸反应。然后使用经金属修饰的表面固定带聚(6)组氨酸标签的蛋白质，在该特定情况下即ShhN蛋白质。
将这种方案与HEATSENS表面官能化进行比较，其中与上述相比，通过使用芳基重氮盐化学物质和UV光(365nm，8W)接枝有机层来实现羧基的引入。然后通过分别用10mM和20mM的EDC和磺基-NHS催化的酰胺化，用20mM N2,N2-双(羧甲基)-L-赖氨酸-25mM CuSO4对羧酸表面进行官能化。化学修饰的两个步骤保证了产生具有高密度活性基团的均匀层。
通过傅里叶变换红外(FTIR)测量来表征对两个表面的界面表面变化的评估。这些在配备有通用ATR取样附件(Perkin Elmer)的Spectrum One FT-IR光谱仪上进行。
用通过NIT方法官能化的NTA-Cu2+来修饰的样品的FTIR研究揭示了，与未处理样品(图33)相比，出现与NTA的酰胺和羧基的振动模式(图33)相关的特征谱带。3420cm-1和3780cm-1处的吸收带与酰胺基团的N-H拉伸对应，并且1609cm-1和1747cm-1处的谱带与羧酸的C＝O拉伸基团相关。相反，用NTA-Ni2+修饰的表面(图33)没有显示酰胺基团的吸收带，而显示了与胺基团相关的NH吸收和可忽略的羧基带。此外，对芯片表面上金属螯合物的密度进行定量，从而知晓每mm2的NTA-Cu2+以获得传感改进。通过确定从用EDTA螯合的表面去除的Cu2+的浓度来进行定量。
CuSO4与NTA形成螯合物以使抗体定向，其中COOH:Cu2+的比例为3:1，因此1mol的Cu2+对应于3mol的NTA的COOH。图34示出了校准曲线的五个点的UV-Vis光谱，其中测量了在500和900nm之间的吸光度，以观察相应CuSO4峰。图35A示出了从微流控芯片表面除去的Cu2 +-EDTA的光谱。通过对图34B描绘的校准曲线上的吸光度值进行外推，发现4μM Cu2+的浓度。考虑到Cu2+与NTA的三个COOH基团配位，在总表面积为9.42mm2微流控芯片表面上，4μM的CuSO4与12μM的NTA的COOH配位。因此，已经发现为了在平坦表面上具有最佳的抗体密度，每mm2的最小螯合基团浓度为1.3μM的COOH和0.43μM的Cu2+。
使用Chiu Wai Kwok等人报道的方法，用NTA-Ni2+修饰的表面进行类似的实验，得到可忽略的吸光度值，因此无法检测Ni2+的量。这些结果进一步证实了采用Chiu Wai Kwok 等人的技术而不是NIT技术的螯合物官能化产率较低。
还分析了取决于表面官能化的方案(NIT和Chiu Wai Kwok等)的抗体固定及其在经修饰的表面上的结合能力的差异。使抗HRP抗体固定在NTA-Cu2+和NTA-Ni2+螯合物官能化表面上。固定化抗体捕获HRP的结合能力通过测量HRP在表面上的活性来证明，通过比色法以及Heatsens检测来确定。
图36示出了NTA-Cu2+(NIT方法)和NTA-Ni2+螯合物(Chiu Wai Kwok等人的方法)官能化表面与HRP孵育后的酶活性结果。两种表面上的活性结果证实了抗体固定，但是在NTA-Cu2+螯合物修饰表面上测定的吸光度强度高于NTA-Ni2+表面上测定的吸光度强度，表明由于NTA-Cu2+的高表面覆盖率导致抗体固定的产率更高。因此，当通过NIT方法经由表面修饰进行抗体固定时，得到的结果远远好于Chiu Wai Kwok等人报道的结果。
通过进行HEATSENS测定进一步证实了该结果。在这个意义上，图37示出了由两个金属螯合表面上的定向固定化抗体捕获的生物素化HRP的存在所引起的温度增量。与在NTA-Ni2+表面上测得的温度增量相比，在NTA-Cu2+螯合物修饰的表面上测得的温度增量的结果更高，这再次表明通过使用NIT方法，抗体固定产率更高。
证明NIT方法与Chiu Wai Kwok等人的方法在方案和强度上的差异的其他方法是使用高灵敏度的HEATSENS传感平台对病原体沙门氏菌进行检测。在用NTA-金属螯合物(NTA-Cu2+(遵循在NIT中开发的方案)和NTA-Ni2+(按照文献Chiu Wai Kwok等报道的方案))官能化的两种表面上测定抗体的固定；总量为1000CFU的沙门氏菌与定向固定化捕获抗体相互作用。一旦结合在表面上，生物素化检测抗体就检测到能够与链霉亲和素-HRP(用于比色测定)或链霉亲和素-纳米棱镜(用于HEATSENS测定)相互作用的病原体。图38显示了，与用Chiu Wai Kwok等人报道的方案官能化的表面相比，与在用NIT开发的方案官能化的表面上存在分析物相关的HRP酶的吸光度较高。可以看出，在用NTA-Cu2+官能化的表面上检测到的1000CFU沙门氏菌的吸光度强度比相对于NTA-Ni2+官能化的表面上检测相同量分析物所测得的吸光度高三倍以上。
图39显示了与在不同活化表面上的沙门氏菌的检测相关的HEATSENS测定结果。HEATSENS测定的结果显示，相同量的沙门氏菌在NTA-Cu2+螯合物表面上的温度增量比在NTA-Ni2+螯合物表面上的温度增量更高。此外，与阳性测定相比，在NTA-Ni2+上进行的测定中更高的阴性对照信号表明使用Chiu Wai Kwok等报道的方案缺乏表面官能化的有效性。活性基团在表面上的不均匀覆盖可导致分析物和检测抗体与表面的非特异性相互作用。此外，在NTA-Cu2+表面上进行的测定中阴性对照的信号比阳性对照低三倍，这使得检测非常有效。此外，它们的信号低于NTA-Ni2+表面上测定的阴性对照的信号，表明NTA-Cu2+表面的化学官能化更好。不同的表面官能化方案提供了活性基团在表面上较高的覆盖度和均匀性，这导致抗体固定能力的改善，结合能力更高，并且HEATSENS测定的灵敏度更高。

Claims (15)

1.包括微芯片的试剂盒或装置用于根据金属纳米颗粒被外部光源照射时产生热量而检测分析物的体外用途，所述微芯片转而包括基底，其中，所述基底包括在所述基底中的至少一个通道，所述通道包括入口、出口和连接所述所述入口与所述出口的流动路径，其中，所述入口和所述出口一起限定中间平面；并且所述流动路径的一部分横向穿过所述中间平面行进，其中横向穿过所述中间平面行进的所述流动路径的一部分包括具有经修饰的表面的识别位点或传感区域，所述修饰的表面包括在螯合剂上的能够检测目标分析物的定向抗体；
其中，具有用螯合剂修饰的表面的识别位点或传感区域由热塑性塑料制成，所述热塑性塑料用重氮芳基化合物官能化，所述重氮芳基化合物由以下式II表示，包含一个或多个羧基：
其中，R是具有1至15个碳原子的烷基；
其中，由前述式II化合物官能化得到的羧基与螯合剂共价连接，所述螯合剂选自由Nα,Nα-双(羧甲基)-L-赖氨酸水合物(ANTA)金属(II)盐或次氮基三乙酸(NTA)金属(II)盐组成的列表，其中，所述金属(II)盐被理解为Cu2+的盐；
其中，所述中间平面是以将所述通道分成对称的两半的方式穿过所述通道的平面，并且其中，所述传感区域被限定为用抗体官能化的金属-螯合物活化表面的一部分，并在横向穿过所述入口和出口之间的所述中间平面行进的流动路径内被识别。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述螯合剂是次氮基三乙酸(NTA)金属(II)盐，所述金属(II)盐被理解为Cu2+的盐。
3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述螯合剂是Nα,Nα-双(羧甲基)-L-赖氨酸水合物(ANTA)金属(II)盐，所述金属(II)盐被理解为Cu2+的盐。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的用途，其特征在于，所述试剂盒或装置还包括以下元件中的至少一种：
a.外部光源，例如激光；
b.能够识别目标分析物的第二识别分子；
c.具有光子特性的金属纳米颗粒；和
d.任选地，能够检测所述金属纳米颗粒在被外部光源照射时产生的热量的装置。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的用途，其特征在于，所述试剂盒或装置还包括以下元件中的至少一种：
a.外部光源；或
b.具有光子性质的金属纳米颗粒，其用能够识别目标分析物的第二识别分子官能化；和
c.任选地，能够检测所述金属纳米颗粒在被外部光源照射时产生的热量的装置。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的用途，其特征在于，所述试剂盒或装置还包括以下元件中的至少一种：
a.外部光源；
b.能够识别目标分析物的第二识别分子(检测用生物分子)，所述目标分析物任选地与标记分子结合；
c.具有光子性质的金属纳米颗粒，其用特异性地识别检测用生物分子的生物分子或修饰检测用生物分子的标记官能化；和
d.任选地，能够检测所述金属纳米颗粒在被外部光源照射时产生的热量的装置。
7.根据权利要求4至6中任一项所述的用途，其特征在于，所述试剂盒或装置还包括能够检测金属纳米颗粒在被外部光源照射时产生的热量的装置，所述装置选自由红外相机或热电堆组成的列表。
8.一种包括基底的试剂盒或装置，其中，所述基底包括在所述基底中的至少一个通道，所述通道包括入口、出口和连接所述入口与所述出口的流动路径，其中，所述入口和所述出口一起限定中间平面；并且所述流动路径的一部分横向穿过所述中间平面行进，其中，横向穿过所述中间平面行进的所述流动路径的一部分包括用于检测目标分析物的识别位点或传感区域；
其中，横向穿过包括识别位点的所述中间平面而行进的流动路径的一部分用如权利要求1所限定的式II所示的重氮芳基化合物官能化，所述重氮芳基化合物包含一个或多个羧基，并且其中，由前述官能化产生的羧基与螯合剂共价连接，所述螯合剂选自由Nα,Nα-双(羧甲基)-L-赖氨酸水合物(ANTA)金属(II)盐或次氮基三乙酸(NTA)金属(II)盐组成的列表，其中，所述金属(II)盐被理解为Cu2+的盐。
9.根据权利要求8所述的试剂盒或装置，其特征在于，所述基底由热塑性材料制成，所述热塑性材料例如聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚苯乙烯、聚(二甲基硅氧烷)、聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚乙烯、聚丙烯、聚乳酸、聚(D,L-丙交酯-共-乙交酯)或环烯烃共聚物，并且包含能够识别固定在所述识别位点或传感区域上的目标分析物的抗体。
10.根据权利要求8或9中任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述螯合剂是次氮基三乙酸(NTA)金属(II)盐，所述金属(II)盐被理解为Cu2+的盐。
11.根据权利要求8或9中任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述螯合剂是Nα,Nα-双(羧甲基)-L-赖氨酸水合物(ANTA)金属(II)盐，所述金属(II)盐被理解为Cu2+的盐。
12.根据权利要求8至11中任一项所述的试剂盒或装置，其特征在于，还包括以下元件中的至少一种：
a.外部光源，例如激光；
b.能够识别所述目标分析物的第二识别分子；
c.具有光子特性的金属纳米颗粒；和
d.任选地，能够检测所述金属纳米颗粒在被外部光源照射时产生的热量的装置。
13.根据权利要求8至11中任一项所述的试剂盒或装置，其特征在于，还包括以下元件中的至少一种：
a.外部光源；
b.具有光子性质的金属纳米颗粒，其用能够识别所述目标分析物的第二识别分子官能化；和
c.任选地，能够检测所述金属纳米颗粒在被外部光源照射时产生的热量的装置。
14.根据权利要求8至11中任一项所述的试剂盒或装置，其特征在于，所述试剂盒或装置还包括以下元件中的至少一种：
a.外部光源；
b.能够识别目标分析物的第二识别分子(检测用生物分子)，所述目标分析物任选地与标记分子结合；
c.具有光子性质的金属纳米颗粒，其用特异性地识别检测用生物分子的生物分子或修饰检测用生物分子的标记官能化；和
d.任选地，能够检测所述金属纳米颗粒在被外部光源照射时产生的热量的装置。
15.根据权利要求8至14中任一项所述的试剂盒或装置，其特征在于，所述试剂盒或装置还包括能够检测金属纳米颗粒在被外部光源照射时产生的热量的装置，所述装置选自由红外相机或热电堆组成的列表。
CN201780033153.8A 2016-03-28 2017-03-28 基于金属纳米颗粒的光热转换特性检测分析物的微流控 Pending CN109475861A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP16382137 2016-03-28
EP16382137.4 2016-03-28
PCT/EP2017/057346 WO2017167769A1 (en) 2016-03-28 2017-03-28 Microfluidics for analyte detection based on the light to heat conversion properties of metal nanoparticles

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN109475861A true CN109475861A (zh) 2019-03-15

Family

ID=55752237

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201780033153.8A Pending CN109475861A (zh) 2016-03-28 2017-03-28 基于金属纳米颗粒的光热转换特性检测分析物的微流控

Country Status (7)

Country Link
US (1) US20190118174A1 (zh)
EP (1) EP3436193A1 (zh)
JP (1) JP2019515310A (zh)
CN (1) CN109475861A (zh)
BR (1) BR112018069889A2 (zh)
RU (1) RU2018137413A (zh)
WO (1) WO2017167769A1 (zh)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111545136B (zh) * 2020-04-05 2021-02-19 北京化工大学 一种高效光热转化的自悬浮聚合物气凝胶的制备方法及其应用
CN113856778A (zh) * 2021-11-03 2021-12-31 清华大学 一种选择性检测微生物的微流控芯片、装置和方法
CN114280049A (zh) * 2021-12-28 2022-04-05 江南大学 检测过敏原蛋白的比色-光热双模式试纸条及其制备方法

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11568529B2 (en) * 2018-07-25 2023-01-31 Konica Minolta, Inc. Gas detection device that visualizes gas
KR102346758B1 (ko) * 2019-12-03 2021-12-31 서강대학교산학협력단 금 나노입자 합성을 위한 미세 액적 기반 미세유체칩 및 이의 용도

Citations (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20020094580A1 (en) * 2001-01-16 2002-07-18 Jorgenson James W. Photothermal absorbance detection apparatus and method of using same
CN1905835A (zh) * 2003-09-11 2007-01-31 赛拉诺斯股份有限公司 分析物监测和药物递送的医疗装置
CN101073002A (zh) * 2004-09-15 2007-11-14 微芯片生物工艺学股份有限公司 微流体装置
EP2126039A2 (en) * 2007-01-23 2009-12-02 Yeda Research And Development Company Limited Microfluidic devices and methods of generating and using same
CN102527453A (zh) * 2011-12-30 2012-07-04 北京瑞斯诺生物医药技术有限公司 一种应用于纳米颗粒制备的高并行微流道芯片
CN102917793A (zh) * 2010-05-28 2013-02-06 国家科学研究中心 用于制造微流控芯片的方法以及相关的芯片和盘
US20130078740A1 (en) * 2011-09-23 2013-03-28 University Of Rochester Preparation of microfluidic device on metal nanoparticle coated surface, and use thereof for nucleic acid detection
CN203164120U (zh) * 2012-03-30 2013-08-28 北京博晖创新光电技术股份有限公司 微流控时间分辨荧光免疫分析装置
WO2014139031A1 (en) * 2013-03-15 2014-09-18 Concordia University Methods for fabricating morphologically transformed nano-structures (mtns) and tunable nanocomposite polymer materials, and devices using such materials
CN105062974A (zh) * 2015-08-03 2015-11-18 苏州大学 一种癌细胞或细菌的捕获方法及其试剂盒
CN105149020A (zh) * 2015-07-01 2015-12-16 北京航空航天大学 一种嵌入微纳结构端面光纤的拉曼检测微流控芯片

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2397909B1 (es) * 2011-05-05 2014-06-06 Universidad De Zaragoza Procedimiento de obtención de materiales multifuncionalizados

Patent Citations (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20020094580A1 (en) * 2001-01-16 2002-07-18 Jorgenson James W. Photothermal absorbance detection apparatus and method of using same
CN1905835A (zh) * 2003-09-11 2007-01-31 赛拉诺斯股份有限公司 分析物监测和药物递送的医疗装置
CN101073002A (zh) * 2004-09-15 2007-11-14 微芯片生物工艺学股份有限公司 微流体装置
EP2126039A2 (en) * 2007-01-23 2009-12-02 Yeda Research And Development Company Limited Microfluidic devices and methods of generating and using same
CN102917793A (zh) * 2010-05-28 2013-02-06 国家科学研究中心 用于制造微流控芯片的方法以及相关的芯片和盘
US20130078740A1 (en) * 2011-09-23 2013-03-28 University Of Rochester Preparation of microfluidic device on metal nanoparticle coated surface, and use thereof for nucleic acid detection
CN102527453A (zh) * 2011-12-30 2012-07-04 北京瑞斯诺生物医药技术有限公司 一种应用于纳米颗粒制备的高并行微流道芯片
CN203164120U (zh) * 2012-03-30 2013-08-28 北京博晖创新光电技术股份有限公司 微流控时间分辨荧光免疫分析装置
WO2014139031A1 (en) * 2013-03-15 2014-09-18 Concordia University Methods for fabricating morphologically transformed nano-structures (mtns) and tunable nanocomposite polymer materials, and devices using such materials
CN105149020A (zh) * 2015-07-01 2015-12-16 北京航空航天大学 一种嵌入微纳结构端面光纤的拉曼检测微流控芯片
CN105062974A (zh) * 2015-08-03 2015-11-18 苏州大学 一种癌细胞或细菌的捕获方法及其试剂盒

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111545136B (zh) * 2020-04-05 2021-02-19 北京化工大学 一种高效光热转化的自悬浮聚合物气凝胶的制备方法及其应用
CN113856778A (zh) * 2021-11-03 2021-12-31 清华大学 一种选择性检测微生物的微流控芯片、装置和方法
CN114280049A (zh) * 2021-12-28 2022-04-05 江南大学 检测过敏原蛋白的比色-光热双模式试纸条及其制备方法
CN114280049B (zh) * 2021-12-28 2024-01-05 江南大学 检测过敏原蛋白的比色-光热双模式试纸条及其制备方法

Also Published As

Publication number Publication date
EP3436193A1 (en) 2019-02-06
WO2017167769A1 (en) 2017-10-05
BR112018069889A2 (pt) 2019-04-30
RU2018137413A (ru) 2020-04-29
JP2019515310A (ja) 2019-06-06
US20190118174A1 (en) 2019-04-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Mahmoudpour et al. Nanomaterials and new biorecognition molecules based surface plasmon resonance biosensors for mycotoxin detection
CN109475861A (zh) 基于金属纳米颗粒的光热转换特性检测分析物的微流控
Wang et al. Fe3O4 nanoparticles-enhanced SPR sensing for ultrasensitive sandwich bio-assay
Saerens et al. Engineering camel single-domain antibodies and immobilization chemistry for human prostate-specific antigen sensing
Oh et al. The fabrication of protein chip based on surface plasmon resonance for detection of pathogens
Falsey et al. Peptide and small molecule microarray for high throughput cell adhesion and functional assays
Jung et al. Self-directed and self-oriented immobilization of antibody by protein G− DNA conjugate
Wang et al. Aptamer–Au NPs conjugates-enhanced SPR sensing for the ultrasensitive sandwich immunoassay
Adányi et al. Development of new immunosensors for determination of contaminants in food
Scarano et al. Surface plasmon resonance imaging (SPRi)-based sensing: a new approach in signal sampling and management
Ribeiro et al. Electrochemistry-assisted surface plasmon resonance biosensor for detection of CA 15–3
Wang et al. Label-free biosensing of Salmonella enterica serovars at single-cell level
Rettke et al. Picomolar glyphosate sensitivity of an optical particle-based sensor utilizing biomimetic interaction principles
CN102539733A (zh) 一种可视化塑料基生物芯片及其制备方法和检测方法
Byeon et al. Multiplexed evaluation of capture agent binding kinetics using arrays of silicon photonic microring resonators
Kurihara et al. Fabrication of carboxylated silicon nitride sensor chips for detection of antigen–antibody reaction using microfluidic reflectometric interference spectroscopy
Saylan et al. Surface plasmon resonance sensors for medical diagnosis
Wang et al. Nanoparticles-enabled surface-enhanced imaging ellipsometry for amplified biosensing
Liu et al. Sensitivity-enhancement of wavelength-modulation surface plasmon resonance biosensor for human complement factor 4
Choudhury et al. Study on snake venom protein-antibody interaction by surface plasmon resonance spectroscopy
JP2009520983A (ja) 分析物における標的分子の量を決定するセンシング装置及び方法
Shin et al. Use of multiple peptide-based SERS probes binding to different epitopes on a protein biomarker to improve detection sensitivity
Kyprianou et al. New reactive polymer for protein immobilisation on sensor surfaces
Kim et al. Homogeneous one-step immunoassay based on switching peptides for detection of the influenza virus
Guo et al. Kinetic analysis of a high-affinity antibody/antigen interaction performed by planar waveguide fluorescence immunosensor

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20190315