CN109475122A - 用于预防或尽量减少植物病害的生物杀虫剂组合物 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种生物杀虫剂组合物和处理植物或植物组分的方法，包含具有芽孢杆菌的第一组分和具有多糖的第二组分。优选地，芽孢杆菌菌株是角质孢子芽孢菌。以组合形式，该生物杀虫剂组合物可施加到植物，以尽量减少或预防与线虫相关的植物病害。

Description

用于预防或尽量减少植物病害的生物杀虫剂组合物

发明领域

本发明涉及用于预防或尽量减少植物病害的组合物；本发明涉及一种组合物和使用该组合物的方法，该组合物含有细菌菌株和多糖，用于预防或尽量减少与植物和作物有关的植物病害；更重要的是，本发明涉及一种组合物和使用该组合物的方法，该组合物含有芽孢杆菌(bacillus)和壳聚糖(chitosan)，用于预防或尽量减少与线虫相关的植物病害。

背景技术

提供和获取食物的能力是人类必不可少的要求。水果和蔬菜的生产在作为经济成分和人类可持续发展的组成部分中都是至关重要的。诸如柑橘的商业产品的培育和生产在生产此类产品的地区的经济中发挥着重要作用。例如，佛罗里达州严重依赖于柑橘的生产。佛罗里达州的柑橘产业是一个雇用了数万名人的数十亿美元的产业。最近整个产业受到的威胁是一种称为柑橘绿化的细菌性病害。虽然佛罗里达州的柑橘产业经历了与溃疡病、飓风和硬冻结相关的艰辛，但柑橘绿化有可能摧毁该行业。这种病害是由亚洲柑橘木虱(Asian citrus psyllids)传播的，已知的没有治愈方法。由于没有有效的治愈方法，患病的树木无法提供可食用的水果，并且是经济上的损失。如果一个橘园包含广泛的病害，整体效果可能会导致种植者的经济损坏。

尽管大多数水果或蔬菜种植者没有遇到此类破坏性病害，但如果不进行适当控制，各种天然微生物会影响作物产量。植物寄生线虫是土壤中发现的攻击植物的微观圆形蠕虫，从而导致作物损失。尽管并非所有的线虫都是寄生的，但那些线虫通常会攻击植物的根部。攻击植物根部导致根功能障碍以及水分和养分利用的减少。有几种方法可用于治理寄生线虫问题，包括用较不易受影响的作物或抗性品种轮作，使用移植物，植入前杀线虫剂处理或使用天然拮抗剂。这些解决方案并非没有负面影响，包括成本和时间，它们可能对有益的土壤生物产生不利影响。这些策略中的每一种都依赖于预防，因为一旦植物感染了线虫，在不杀死宿主植物的情况下杀死寄生虫是不可能的。

因此，本领域需要有效的组合物和使用该组合物的方法，以治疗与植物相关的病害，诸如线虫相关的病害，其是有效的并且不会损害宿主植物。

发明内容

本发明提供了一种生物杀虫剂组合物，有时称为该组合物，以及使用该生物杀虫剂组合物的方法，用于预防或尽量减少植物中的病害，诸如与线虫相关的植物病害。用于治疗植物中与本发明的线虫相关的病害的组合物主要使用两种组分，一种或多种微生物菌株，优选具有几丁质酶活性的细菌菌株，以及可被一种或多种细菌菌株使用以产生几丁质酶的底物。优选地，该细菌是芽孢杆菌菌株。被一种或多种细菌菌株使用以产生几丁质酶的底物可以是壳聚糖-几丁质基材料，诸如壳聚糖或几丁质(chitan)。

在一个示例性实施方案中，本发明提供了一种用于预防或尽量减少植物病害的组合物，该组合物包含至少一种具有几丁质酶活性的微生物菌株；和刺激几丁质酶产生的底物，该底物与至少一种微生物菌株组合，防止或尽量减少植物或作物病害。

在一个示例性实施方案中，本发明提供了一种用于预防或尽量减少植物病害的组合物，该组合物包含芽孢杆菌菌株；和多糖，该多糖与芽孢杆菌菌株组合，防止或尽量减少植物或作物病害。

在另一个示例性的实施方案中，本发明提供了一种用于预防或尽量减少植物病害的组合物，该组合物包含角质孢子芽孢菌(Bacillus chitinosporus)菌株，和多糖，该多糖与角质孢子芽孢菌组合，杀死或预防至少一种与植物病害相关的线虫物种的生长。

在另一个示例性的实施方案中，本发明提供了一种预防或尽量减少植物病害的方法，该方法包括将有效量的组合物施加到植物或植物组分，以尽量减少或预防植物或作物病害，所述组合物包含至少一种具有几丁质酶活性的微生物菌株；和刺激几丁质酶产生的底物。

在另一个示例性实施方案中，本发明提供了一种产生杀死或抑制线虫的物质的方法，该方法包括将有效量的组合物施加到植物或植物组分，以尽量减少或预防植物或作物病害，所述组合物包含至少一种具有几丁质酶活性的微生物菌株；和刺激几丁质酶产生的底物，从而刺激几丁质酶产生的底物浓度足以使至少一种具有几丁质酶活性的微生物菌株产生足够浓度或数量的几丁质酶，以杀死或抑制植物相关的线虫，该植物含有施用于其上的组合物。

在另一个示例性实施方案中，本发明提供了一种预防或尽量减少植物病害的方法，该方法包括将有效量的组合物施加到植物或植物组分，以尽量减少或预防植物或作物病害，所述组合物包含芽孢杆菌菌株和多糖。该方法还可包括监测植物或植物组分，以改善植物病害，并在必要时重复施加组合物，用于治疗所述植物或植物组分中的所述植物病害。

因此，本发明的一个目的是提供一种用于预防或尽量减少植物病害的组合物。

本发明的另一个目的是提供一种预防或尽量减少植物病害的方法。

本发明的另一个目的是提供一种用于预防或尽量减少与线虫相关的植物病害的组合物。

本发明的另一个目的是提供一种预防或尽量减少与线虫相关的植物病害的方法。

本发明的另一个目的是提供一种用于预防或尽量减少植物病害的组合物，该组合物具有细菌物种与刺激几丁质酶产生的底物的组合。

本发明的另一个目的是提供一种用于预防或尽量减少植物病害的组合物，该组合物具有细菌成分与刺激几丁质酶产生的底物的组合。

本发明的另一个目的是提供一种使用组合物来预防或尽量减少植物病害的方法，该组合物具有细菌物种与刺激几丁质酶产生的底物的组合。

本发明的另一个目的是提供一种使用组合物来预防或尽量减少植物病害的方法，该组合物具有几丁质酶活性的细菌物种与刺激几丁质酶产生的底物的组合。

本发明的另一个目的是提供一种使用组合物来预防或尽量减少植物病害的方法，该组合物具有能够通过产生几丁质酶分解几丁质或壳聚糖的几丁质分解细菌与刺激几丁质酶产生的底物的组合。

本发明的另一个目的是提供一种使用组合物来用于预防或尽量减少植物病害的组合物，该组合物具有芽孢杆菌与刺激几丁质酶产生的底物的组合。

本发明的另一个目的是提供一种用使用组合物来用于预防或尽量减少植物病害的组合物，该组合物具有角质孢子芽孢菌与刺激几丁质酶产生的底物的组合。

本发明的另一个目的是提供一种用于预防或尽量减少植物物种的组合物，该组合物具有细菌物种与壳聚糖或几丁质的组合。

本发明的另一个目的是提供一种使用组合物来用于预防或尽量减少植物病害的组合物，该组合物具有角质孢子芽孢菌与壳聚糖或几丁质的组合。

本发明的另一个目的是提供一种使用组合物来预防或尽量减少植物病害的方法，该组合物具有角质孢子芽孢菌与壳聚糖或几丁质的组合。

本发明的其它目的和优点将通过以下结合任何附图的描述变得显而易见，其中通过图示和示例的方式阐述了本发明的某些实施例。这里包含的任何附图构成本说明书的一部分并且包括本发明的示例性实施例，并且示出了其各种目的和特征。

具体实施方式

尽管本发明可以以各种形式实施，但是在附图中示出并且在下文中将描述目前优选的但不是限制性的实施例，应理解本公开被认为是本发明的示例，并不旨在限制本发明所示的具体实施方案。

本发明提供了生物杀虫剂组合物，以及该生物杀虫剂组合物的使用方法，用于预防植物中与线虫相关的病害。本发明的组合物主要使用两种组分来预防或尽量减少植物中与线虫相关的病害。第一组分包括一种或多种细菌菌株。优选地，细菌菌株是具有几丁质酶活性或能够通过几丁质酶进行酶促作用的菌株。因此，细菌菌株可以是能够分解几丁质或壳聚糖的几丁质分解菌。优选地，细菌菌株组分是芽孢杆菌，更优选地，是角质孢子芽孢菌。第二组分是刺激细菌生长，或者更优选地，刺激几丁质酶产生的底物。第二组分包括壳聚糖-几丁质基材料。

该组合物提供了至少一种具有几丁质酶活性的微生物菌株，与产生或增强几丁质酶产生的底物或材料的组合。当微生物组合物与所提供的壳聚糖-几丁质基材料的浓度相互作用时，几丁质酶的来源可以连续被产生并且可以对线虫起作用。因此，该组合物包括一定浓度的壳聚糖-几丁质基材料，其足以使微生物菌株产生足够浓度的几丁质酶，以对与酶接触的线虫的生长起作用，即杀死或抑制。因此，生物杀虫剂组合物的两种组分的浓度是足够的，使得产生足够浓度的几丁质酶，以杀死或抑制线虫的产生。

生物杀虫剂组合物可以以液体的形式制备。或者，生物杀虫剂组合物可以以可溶的干粉形式制备。生物杀虫剂组合物可以施加到植物的任何部分，优选地，施加到根系。

具有几丁质酶活性或能够通过几丁质酶进行酶促作用的微生物物种：生物杀虫剂组合物可包括一种微生物菌株或物种，或菌株或物种的组合。

芽孢杆菌。芽孢杆菌是来自厚壁菌门(Phylum Firmicutes)的革兰氏阳性杆状细菌。芽孢杆菌存在于土壤和水中，并且通常是好氧细菌，但在某些条件下可以是厌氧的。优选的芽孢杆菌种是分离的或纯化的角质孢子芽孢菌。

尽管已知市售的角质孢子芽孢菌(参见例如ATCC 19986)并且可以用作生物杀虫剂组合物的第一组分，用于以下实验的角质孢子芽孢菌，在本文中称为角质孢子芽孢菌变种101，最初是从德克萨斯州金斯维尔(克雷伯县)附近的棉田的农业土壤中分离出来的。对土壤进行取样。分离微生物并进行表征研究。经过生化和酶学表征后，筛选出角质孢子芽孢菌变种101，测定并培养。角质孢子芽孢菌变种101是革兰氏阳性菌，形成内生孢子的运动细菌，其优选在pH为3-11的范围内的嗜温生长条件。

该细菌产生并分泌高浓度剂量的几丁质酶，该酶是选择性地靶向环境中的几丁质的酶。几丁质是真菌细胞壁和线虫幼虫囊肿的基本组成部分。因此，人们认为一旦角质孢子芽孢菌变种101分泌细胞外几丁质酶，然后酶将会降解其附近的几丁质复合物聚合物，将其还原成其简单组分，从而裂解细胞壁并将其细胞内组分暴露于环境中，导致幼虫细胞死亡。由于环境中的渗透压差异，线虫幼虫将裂解。

检测角质孢子芽孢菌变种101以及几种其他芽孢杆菌种，以确定当与壳聚糖-几丁质基材料组合时产生的几丁质酶的量。表1示出了测试结果，其显示了作为对壳聚糖-几丁质基材料的底物的直接响应而产生的酶几丁质酶的百分比(ppm)，在环境中以几丁质表示。在胰蛋白酶大豆肉汤制剂(用于兼性厌氧培养的标准微生物生长培养基)中用几丁质代替右旋糖。没有简单的糖可用于培养基中的分解代谢。生物体在这种环境中生长的唯一途径是通过几丁质(复合糖聚合物)的分解代谢作为其最终的糖组分。对于每种生物体，在37℃的摇瓶中随时间测量酶几丁质酶。从各自的烧瓶中取出每种生物体的样品，滤出培养基组分，剩余的作为流出物的是几丁质酶。每个物种在其各自的烧瓶中测量。浓度显示在表测定中。

表1：几丁质酶产生测定

*分光光度计和比色浓度分析。

胰蛋白酶大豆肉汤培养基(用几丁质代替右旋糖)，35℃，以190rpm旋转振荡平台并喷射氧气，pH值为7。

如本文所用，术语“壳聚糖-几丁质基材料”定义为纯化的或分离的壳聚糖，纯化的或分离的几丁质，几丁质或壳聚糖衍生物或原料，其可包括壳聚糖或几丁质源，其可被细菌物种使用或分解，以用作壳聚糖或几丁质的来源。如果需要，可以将分离的或纯的壳聚糖或几丁质与底物混合，以在与本发明的其他组分混合时帮助溶解。例如，溶液中的壳聚糖乙酸酯可用于组合物中。作为示例性实例，原料可以是虾粉或虾废料，定义为虾的未分解废物，优选地，处于地面干燥状态。虾粉可含有整个虾或虾的部分，诸如头或壳体。虾粉可以使用晒干、烘箱干燥来制造，或者可以在干燥之前煮沸或蒸煮。虾粉可以制成并以液体形式使用。“壳聚糖-几丁质基材料”的使用还可以涵盖含有几丁质或壳聚糖的任何其他动物或动物组分，植物或真菌/真菌物种，诸如昆虫、螃蟹、龙虾或其他甲壳类动物壳体的外骨骼。也可以使用节肢动物甚至蘑菇的整个或部分。

几丁质：是一种线性、对数链多糖，由多个β-(1-4)-连接的D-葡糖胺组成，具有下式：

上式示出两个N-乙酰基-D-葡糖胺单元重复，以β-(1-4)-连接形式形成长链。

壳聚糖是一种线性多糖，由随机分布的β-(1-4)连接的D-葡糖胺和N-乙酰基-D-葡糖胺组成，化学式为：

壳聚糖可以从贝类的坚硬外骨骼中获得，包括螃蟹、龙虾或虾。

表2：实施例1.用于预防或尽量减少与线虫相关的植物病害的组合物。

组分	浓度
		微生物成分	1.0X 10<sup>6</sup>CFU/ml及以上的细胞密度
多糖	0.1-10％

表3：实施例2.用于预防或尽量减少与线虫相关的植物病害的组合物。

表4：实施例3.用于预防或尽量减少与线虫相关的植物病害的组合物。

组分	浓度
		微生物成分	1.0X 10<sup>6</sup>CFU/ml及以上的细胞密度
壳聚糖-几丁质基材料	0.1-10％

表5：实施例4.用于预防或尽量减少与线虫相关的植物病害的组合物。

表6：实施例5.用于预防或尽量减少与线虫相关的植物病害的组合物。

组分	浓度
		微生物成分：芽孢杆菌	1.0X 10<sup>6</sup>CFU/ml及以上的细胞密度
多糖：壳聚糖	0.1-10％

表7：实施例6.用于预防或尽量减少与线虫相关的植物病害的组合物。

组分	浓度
		角质孢子芽孢菌	1.0X 10<sup>9</sup>CFU/ml
壳聚糖	2.5％

初始实验：制备具有细胞密度例如为1.0×10⁶CFU/ml及以上，优选细胞密度为1.0×10⁹CFU/ml的细菌物种，优选芽孢杆菌，更优选角质孢子芽孢菌的接种物。尽管已知市售的角质孢子芽孢菌并且可以用作生物杀虫剂组合物的第一组分，但是角质孢子芽孢菌最初是从德克萨斯州金斯维尔(克雷伯县)附近的棉田的农业土壤中分离出来的。对土壤进行取样。分离微生物并进行表征研究。经过生化和酶学表征后，筛选出角质孢子芽孢菌变种101，测定并培养。角质孢子芽孢菌变种101是革兰氏阳性菌，形成内生孢子的运动细菌，其优选在pH为3-11的范围内的嗜温生长条件。该细菌产生并分泌高浓度剂量的几丁质酶，该酶是选择性地靶向环境中的几丁质的酶。几丁质是真菌细胞壁和线虫幼虫囊肿的基本组成部分。因此，人们认为一旦角质孢子芽孢菌变种101分泌细胞外几丁质酶，然后酶将会降解其附近的几丁质复合物聚合物，将其还原成其简单组分，从而裂解细胞壁并将其细胞内组分暴露于环境，导致幼虫细胞死亡。由于环境中的渗透压差异，线虫幼虫将裂解。

向细菌接种物中，将0.1-10％壳聚糖-几丁质基材料，优选2.5％壳聚糖混合，以形成根据实施例1-6的组合物。将该组合物施加到番茄植物。测试土壤样品的类型(即物种)和发现的每个物种的数量，以确定线虫负荷。表8(如下)示出用该组合物处理的番茄植物相对于对照组的初始实验结果，其中对照组番茄植物未用该组合物处理。对照组的总线虫负荷为720/500cc。处理组的总线虫负荷为8/500cc。表5(如下)示出用所施用的组合物处理的番茄植物相对于对照组的其他实验结果，其中对照组番茄植物未用该组合物处理。对照组的总线虫负荷为864/500cc。处理组的总线虫负荷为72/500cc。因此，线虫负荷减少了10倍。

表8：初始实验：结果1：确定番茄植物生长中使用该组合物和不使用该组合物的线虫物种和数量的存在。

表9：初始实验：结果2：确定番茄植物生长中使用该组合物和不使用该组合物的线虫物种和数量的存在。

柑橘树：

制备具有优选细胞密度为1.0×10⁹CFU/ml的细菌物种，优选芽孢杆菌，更优选角质孢子芽孢菌的接种物。向细菌接种物中，将0.1-10％壳聚糖-几丁质基材料，优选2.5％壳聚糖混合，以形成根据实施例1-6的组合物。将该组合物施加到柑橘植物。初步实验表明，组合物的施加具有减少线虫负荷的作用，参见表6。

表10：组合物对两种线虫物种的影响：柑橘植物。

如表10所示，测试了两种线虫物种，半穿刺线虫属物种(柑橘线虫)和剑线虫。当用该组合物处理树丛时，检测到的柑橘线虫数量减少。剑线虫的数量也在处理后减少。

本说明书中提及的所有专利和出版物表示本发明所属领域的技术人员的水平。所有专利和出版物在此通过引入并入，其程度如同每个单独的出版物被具体地和单独地指出以通过引用并入。

应当理解，虽然示出了本发明的某种形式，但是本发明不限于这里描述和示出的部件的具体形式或布置。对于本领域技术人员显而易见的是，在不脱离本发明的范围的情况下可以进行各种改变，并且本发明不应被视为限于说明书中示出和描述的内容。

本领域技术人员将容易理解，本发明非常适合于实现所述目的并获得所提到的目的和优点，以及其中固有的目的和优点。本文所述的实施例、方法、程序和技术目前是优选实施方案的代表，旨在是示例性的，并不意图作为对范围的限制。本领域技术人员将想到其中的变化和其他用途，这些变化包含在本发明的精神内并且由所附权利要求的范围限定。尽管已经结合特定的优选实施例描述了本发明，但是应该理解，所要求保护的本发明不应该不适当地限于这些特定的实施例。实际上，对于本领域技术人员显而易见的是，用于实施本发明的所述模式的各种修改旨在落入所附权利要求的范围内。

Claims (19)

1.一种用于预防或尽量减少植物病害的组合物，所述组合物包含：

至少一种微生物菌株，所述微生物菌株具有几丁质酶活性；和

底物，所述底物刺激几丁质酶产生，其与所述至少一种微生物菌株组合，预防或尽量减少植物或作物病害。

2.根据权利要求1所述的用于预防或尽量减少植物病害的组合物，其中所述至少一种具有几丁质酶活性的微生物菌株和所述刺激几丁质酶产生的底物是有效量的，用于抑制或杀死至少一种线虫。

3.根据权利要求1所述的用于预防或尽量减少植物病害的组合物，其中所述至少一种具有几丁质酶活性的微生物菌株是芽孢杆菌菌株。

4.根据权利要求1所述的用于预防或尽量减少植物病害的组合物，其中所述芽孢杆菌菌株是角质孢子芽孢菌。

5.根据权利要求1所述的用于预防或尽量减少植物病害的组合物，其中所述刺激几丁质酶产生的底物是壳聚糖-几丁质基材料。

6.根据权利要求3所述的用于预防或尽量减少植物病害的组合物，其中所述芽孢杆菌菌株的细胞密度至少为1.0×10⁶CFU/ml。

7.根据权利要求3所述的用于预防或尽量减少植物病害的组合物，其中所述芽孢杆菌菌株的细胞密度介于1.0×10⁶CFU/ml和1.0×10⁹CFU/ml之间。

8.根据权利要求5所述的用于预防或尽量减少植物病害的组合物，其中所述壳聚糖-几丁质基材料的浓度介于0.1％和10％之间。

9.根据权利要求1所述的用于预防或尽量减少植物病害的组合物，其中所述组合物是液体形式或可溶性干粉形式。

10.一种预防或尽量减少植物病害的方法，所述方法包括：

将有效量的组合物施加到植物或植物组分，以尽量减少或预防植物或作物病害，所述组合物包含至少一种具有几丁质酶活性的微生物菌株；和刺激几丁质酶产生的底物。

11.根据权利要求10所述的预防或尽量减少植物病害的方法，所述方法还包括以下步骤：

监测所述植物或植物组分，用于改善植物病害；和

如果需要，重复施加所述组合物，用于治疗所述植物或植物组分中的所述植物病害。

12.根据权利要求10所述的预防或尽量减少植物病害的方法，其中所述组合物的施加减少了与所述植物或植物组分相关的线虫物种的数量。

13.根据权利要求10所述的预防或尽量减少植物病害的方法，其中所述至少一种具有几丁质酶活性的微生物菌株是角质孢子芽孢菌。

14.根据权利要求10所述的预防或尽量减少植物病害的方法，其中所述刺激几丁质酶产生的底物是壳聚糖-几丁质基材料。

15.根据权利要求13所述的预防或尽量减少植物病害的方法，其中所述角质孢子芽孢菌的细胞密度至少为1.0×10⁶CFU/ml。

16.根据权利要求13所述的预防或尽量减少植物病害的方法，其中所述角质孢子芽孢菌的细胞密度介于1.0×10⁶CFU/ml和1.0×10⁹CFU/ml之间。

17.根据权利要求14所述的预防或尽量减少植物病害的方法，其中所述壳聚糖-几丁质基材料的浓度介于0.1％和10％之间。

18.根据权利要求10所述的预防或尽量减少植物病害的方法，其中所述组合物是以液体形式或可溶性干粉形式施加。

19.一种用于预防或尽量减少与线虫相关的植物病害的组合物，所述组合物包含：

分离或纯化的角质孢子芽孢菌菌株；和

壳聚糖-几丁质基材料，其与所述角质孢子芽孢菌组合，杀死或预防至少一种与植物病害相关的线虫种类的生长。