CN109452286B - 甲吡唑在杀灭松材线虫中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种甲吡唑在杀灭松材线虫中的应用，甲吡唑在24小时内对松材线虫的半致死浓度为0.01‑0.08mM，能够有效抑制松材线虫的乙醇脱氢酶的活性，降低松材线虫的运动和繁殖力，杀灭松材线虫。本发明具有操作方法简单，成本低廉，高效的杀线活性，且在松材线虫体内的作用位点明确等优点，在控制松材线虫病方面有良好的应用前景，能够应用于杀松材线虫的农药制剂。

Description

甲吡唑在杀灭松材线虫中的应用

技术领域：

本发明涉及一种甲吡唑在杀灭松材线虫中的应用，属于林业病虫害防治技术领域。

背景技术：

由松材线虫(Bursaphelenchus xylophilus)引起的松树萎蔫病(pine wiltdisease)是一种极具毁灭性的松林病害，在世界范围内引起了巨大的经济损失和严重的生态环境破坏，因此，包括中国在内的众多国家都已将松材线虫列为重要的检疫对象。松树萎蔫病目前呈快速蔓延之势，尚没有有效的防治方法，因此，深入研究高效低毒的杀松材线虫成分已成为松树萎蔫病防治研究的重要内容。

在前期研究中发现，采用RNAi技术沉默松材线虫乙醇脱氢酶基因adh-1之后，松材线虫运动与繁殖显著降低，这说明adh-1所编码的乙醇脱氢酶在调节松材线虫运动与繁殖等方面发挥了重要的作用。作为一种竞争性的乙醇脱氢酶抑制剂，甲吡唑(fomepizole)，又称4-甲基吡唑(4-methylpyrazole)，被应用在本次研究中。结果发现，低浓度甲吡唑溶液(0.02mM)处理松材线虫24小时之后，线虫的运动与繁殖出现显著降低(Wang L S,Zhang TT,Pan Z S,Lin L L,Dong G Q,Wang M,Li R G.The alcohol dehydrogenase with abroad range of substrate specificity regulates vitality and reproduction ofthe plantparasitic nematode Bursaphelenchus xylophilus.Parasitology,Accept)。后续研究中发现，0.05mM甲吡唑处理松材线虫24小时之后，线虫死亡率接近100％，这为开发防治松树萎蔫病的新型药物打下坚实的基础。

本发明公布了甲吡唑在杀灭松材线虫中的应用，以期为新型松材线虫防治药物的开发开辟新途径。

发明内容：

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种甲吡唑在杀灭松材线虫中的应用，甲吡唑价格低廉，且具有高效的杀线活性，在松材线虫体内的作用位点明确等优点。

为了实现上述发明目的，本发明所提供的甲吡唑在杀灭松材线虫中的应用，其特征在于甲吡唑在24小时内对松材线虫的半致死浓度为0.01-0.08mM，能够有效抑制松材线虫的乙醇脱氢酶的活性，降低松材线虫的运动和繁殖力,杀灭松材线虫，用于杀松材线虫的农药制剂。

所述具有杀松材线虫活性的甲吡唑浓度优选0.05mM。

甲吡唑的结构式为：

在甲吡唑杀松材线虫生测实验中，在无菌24孔板中用400μL不同浓度的甲吡唑溶液(0.010mM-0.080mM)重新悬浮松材线虫，使试验体系中松材线虫数量调整为大约200条，无菌蒸馏水为阴性对照；25℃避光培养24小时后，体式显微镜下观察松材线虫形态，计算松材线虫的存活及死亡条数，重复以上实验；视野下松材线虫呈僵直状不动为死亡，否则为存活，分别计算不同梯度下24小时的松材线虫校正死亡率，结果用SPSS 17.0进行统计分析，计算公式如下所示：

结果显示，甲吡唑在24小时对松材线虫的半致死浓度为0.01-0.08mM。

本发明具有操作方法简单，成本低廉，高效的杀线活性，且在松材线虫体内的作用位点明确等优点，在控制松材线虫病方面有良好的应用前景，可应用于杀松材线虫的农药制剂。

具体实施方式：

下面结合具体实施例对本发明做进一步的阐述。

实施例1、甲吡唑对松材线虫醇脱氢酶的抑制作用

在甲吡唑对松材线虫醇脱氢酶的抑制作用实验中，为了获取松材线虫总蛋白，将大约3000条无菌松材线虫用无菌蒸馏水洗涤三遍，3000rpm离心5分钟，弃上清，然后将收集到的松材线虫破碎，100μL生理盐水悬浮，12000rpm 4℃离心30分钟，取上清作为供试酶液。醇脱氢酶酶活测定反应体系：100mM Tris-HCl buffer(pH＝8.3)，5mM NAD⁺，50μL供试酶液，100mM乙醇，0.02mM甲吡唑。混匀后立即在340nm处测定紫外吸收值，并计算单位时间内吸收值的变化率。不含甲吡唑的反应体系作为对照。酶活单位(U)定义为：25℃温度下，每1min增加1μmol NADH所需要的酶量。酶的比活力(U/mg)定义为：每1mg酶蛋白具有的酶活力单位。本次酶活测定实验中，每个反应做三次重复。

结果显示，甲吡唑处理组松材线虫的醇脱氢酶活性只有对照组松材线虫的31％。这表明甲吡唑可以有效地抑制松材线虫的脱氢酶活性。

实施例2、甲吡唑对松材线虫运功与繁殖的影响。

在甲吡唑对松材线虫运功与繁殖影响的实验中，大约3000条松材线虫浸泡于0.02mM甲吡唑溶液中，25℃孵育24小时。相同条件下，浸泡于无菌水中的松材线虫作为对照。每个实验重复三次。

在甲吡唑对松材线虫运功影响的实验中，松材线虫头部每分钟摆动的次数被用来评估松材线虫运动性强弱。结果显示，甲吡唑处理组的松材线虫每分钟头部摆动的次数是16，而对照组松材线虫的摆动次数是46次。这表明甲吡唑处理组松材线虫运动性显著弱于对照组松材线虫。

在甲吡唑对松材线虫繁殖影响的实验中，15对经0.02mM甲吡唑溶液浸泡的雄虫与雌虫接种于长满灰葡萄孢的PDA平板上，25℃培养9天后，通过贝尔曼漏斗法分离松材线虫，并在体视显微镜下观察并计算松材线虫的数量。浸泡于无菌水中的松材线虫作为对照。结果显示，实验组松材线虫的数量只有对照组的16％,且实验组松材线虫对灰葡萄孢的取食率明显低于对照组。这表明甲吡唑对松材线虫繁殖与取食具有显著的影响。

实施例3、甲吡唑的杀松材线虫活性测定。

在甲吡唑杀松材线虫生测实验中，在无菌24孔板中用400μL不同浓度甲吡唑溶液(0.010mM-0.080mM)重新悬浮松材线虫，使试验体系中松材线虫数量调整为大约200条，以无菌蒸馏水处理的松材线虫为阴性对照；25℃避光培养24小时后，体式显微镜下观察松材线虫形态，计算松材线虫的存活及死亡条数，重复以上实验；视野下松材线虫呈僵直状不动为死亡，否则为存活，分别计算不同梯度下24小时的松材线虫校正死亡率，结果用SPSS17.0进行统计分析，计算公式如下所示：

结果显示，甲吡唑在24小时对松材线虫的半致死浓度为0.01-0.08mM。

Claims (3)

1.一种甲吡唑在杀灭松材线虫中的应用，其特征在于甲吡唑在24小时内对松材线虫的半致死浓度为0.01-0.08mM，能够有效抑制松材线虫的乙醇脱氢酶的活性，降低松材线虫的运动和繁殖力,杀灭松材线虫。

2.根据权利要求1所述的甲吡唑在杀灭松材线虫中的应用，其特征在于在甲吡唑杀松材线虫生测实验中，在无菌24孔板中用400μL浓度为0.01-0.08mM的甲吡唑溶液重新悬浮松材线虫，使试验体系中松材线虫数量调整为200条，无菌蒸馏水为阴性对照；25℃避光培养24小时后，体式显微镜下观察松材线虫形态，计算松材线虫的存活及死亡条数，重复以上实验；视野下松材线虫呈僵直状不动为死亡，否则为存活，分别计算不同梯度下24小时的松材线虫校正死亡率，结果用SPSS 17.0进行统计分析。

3.根据权利要求1所述的甲吡唑在杀灭松材线虫中的应用，其特征在于在甲吡唑对松材线虫醇脱氢酶的抑制作用实验中，甲吡唑处理组松材线虫的醇脱氢酶活性只有对照组松材线虫的31％。