CN109439321B - 以蚕砂为原料的碳量子点、其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种碳量子点，以蚕砂为碳源制得，N、O掺杂的原子百分比分别为0.01～30％、0.05～5％，粒径为3～4nm；其制备方法为：(1)将蚕砂与碳化剂混合后进行微波反应(100～1000W，2～60min)，得反应溶液；(2)将去除不溶性杂质后得到的反应溶液进行透析，后经冷冻干燥即得；步骤(1)蚕砂与碳化剂的质量体积比为1g：1mL～1g：30mL，且微波反应需在搅拌或者转动状态下进行。本发明的碳量子点含氮修饰，水溶性好，光稳定性好，且能够在常温保存一年以上，可作为针对激发波长、pH、金属离子浓度、温度及溶剂极性的变化有着显著响应特性的荧光探针，为未来的生物检测和成像领域提供了广阔的应用前景。

Description

以蚕砂为原料的碳量子点、其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及碳纳米材料技术领域，更具体地，涉及一种以蚕砂为原料的碳量子点、其制备方法和应用。

背景技术

与众所周知并且已经商业化的量子点相比，碳量子点(Carbon dots,简称CDs)具有类似的特性，如发光亮度高、尺寸可调控，荧光发射波长可调、耐光漂白等。除此之外CDs中不含有毒元素，并且它们的使用不会给生态系统或有机体带来内在毒性的负担，因而是一种体内生物分析更为理想的材料。

迄今为止，CDs在能量转换与存储、生物成像、传感器、生物探针和各种其它领域都引起了极大的关注，并显示出巨大的应用潜力。自2006年Sun和同事首次用激光消融法制备CDs以来，许多研究都集中在亲水或疏水性CDs的合成方法上，目前已经提出了从自上而下或自下而上合成CDs的方法，前者基于从大的碳骨架上剥落下碳纳米颗粒的合成方法，后者则是以较小碳材料为碳源进行处理使其聚集成较大碳纳米颗粒的合成方法。具体的制备方法包括激光销蚀法，电化学法和弧光放电法等(自上而下合成CDs)，或化学氧化法，微波法，模版法，热分解法和反胶束法等(自下而上合成CDs)。

然而，大多数已报道的CDs合成路线需要以化学试剂作为碳来源，同时需要严苛的实验操作条件。近年来也有通过一些天然产物，如西瓜皮、牛奶、土豆等制备CDs的报道，从而大大拓展了CDs的初始碳源。蚕砂是家蚕的干燥粪便，作为丝绸产业的副产物，具有广泛的来源。中医上认为蚕砂性味甘温，入肝、脾、胃经，有燥湿、祛风、和胃化浊、活血定痛之功。民间用蚕砂作枕芯的填充物，有清肝明目之效。根据《中药大辞典》报道，蚕砂含83.77％～90.44％有机物、9.56％～16.23％灰分、1.91％～3.60％总氮量。蚕砂中含氮成分主要为尿嘧啶、二氢尿嘧啶等，其还含有0.25％～0.29％植物醇，不皂化成物β-谷甾醇、胆甾醇、麦角甾醇和廿四醇、蛇麻脂醇、β-谷甾醇-β-葡萄糖甙等。

蚕砂中含有的大量羟基、羧基化合物可作为制备CDs的理想起始材料，而含氮化合物更是可以作为氮源为CDs增加一系列独特的性质。

专利号为201710755244.4的中国专利公开了一种以蚕砂为原料制备荧光碳点的方法，其是将清理干净的蚕砂经一定温度和一定时间进行高温直接碳化或者水热碳化，之后再经过净化获得荧光碳点粉末，该方法用时长，制得的荧光碳点净化过程较复杂，蚕砂的碳化效果不完全且不均匀，因此需要采用超声的手段进一步把得到的产物打散分离，另外经实践该方法制备碳量子点的产率太低，基本在20％以下，同时产生了大量的碳化不完全的杂质，制备得到的碳量子点可能存在聚集，尺寸过大，不能表现出量子性质。

发明内容

根据本发明的一个方面，首先提供了一种碳量子点。

上述碳量子点以蚕砂为原料制得，其N掺杂的原子百分比为0.01～30％，O掺杂的原子百分比为0.05～5％，粒径为3～4nm。

本发明上述碳量子点是以蚕砂为主要碳源制得，由于蚕砂中含有有机氮，因此以蚕砂制得的碳量子点本身含有N掺杂，其性质更优异。

本发明制得的碳量子点除了多数碳量子点具有的性质(荧光具有激发波长依赖性)以外，其荧光强度还与溶液pH、温度、溶剂极性以及溶液中金属离子浓度具有一定可量化的关系，具体地，上述碳量子点具有以下性质：

(1)其荧光强度随含碳量子点的溶液的pH的增大而逐渐减弱；

(2)在含有Cu²⁺、Ni²⁺或Fe²⁺的pH为6.5～7.5的溶液中，其荧光强度随Cu²⁺浓度的增大而逐渐减弱；

(3)在20～70℃内，其荧光强度随温度的升高而逐渐减弱；

(4)其最大荧光发射波长随着溶剂极性的增加而逐渐红移；

(5)将该碳量子点进行荧光发射实验，其最大荧光发射波长与最大荧光激发波长的的关系如式(1)所示：

式中λ_em,max为碳量子点的最大荧光发射波长，λ_ex,max为碳量子点的最大荧光激发波长，λ₀，A，B，C分别为530.59，333.82，1.25及50.63。

除此之外，上述碳量子点还具有很好的储存稳定性，区别于现有其他已知的碳量子点(现有已知碳量子点溶解在水中，其一般只能保存7天到3个月，如果是溶解在有机溶剂中，其一般保存半年到1年)，本发明的碳量子点分散在水中避光保存的话，可以在常温(25℃)保存一年以上，如果是将碳量子点直接以冻干粉末的形式保存，其常温保存2年后仍然不会失去其特有的性能。

本发明上述碳量子点之所以具备良好的储存稳定性，是得益于碳量子点表面具有丰富的氮修饰或其他官能团(羟基、羧基)，这些基团容易与水中的离子(或者缓冲液中的解离离子)形成稳定的电荷保护层，从而不会表现出聚沉(一般是形成絮状沉淀)。

同时，上述碳量子点还具有很好的光稳定性：在同等实验条件下，本发明的碳量子点在氙灯或LED等连续光源或脉冲散射光源连续照射2小时，CDs的荧光强度不发生明显变化，而其他现有已知的碳量子点一般照射1小时以上就会出现明显的荧光强度下降或荧光峰偏移，说明CDs发生分解或是变质。

根据本发明的另一个方面，还提供一种荧光探针，该荧光探针即为上述碳量子点。

根据本发明的另一个方面，还提供上述荧光探针的应用，上述应用为在检测溶液pH值上的应用，其检测方法包括以下步骤：将碳量子点溶于待测溶液中，检测溶液中的碳量子点的荧光发射光谱，并通过式(2)计算待测溶液的pH值，

λ_em,max＝A+B·pH (2)

式中λ_em,max为碳量子点的最大荧光发射波长，A，B取值分别为2.79及535.73。

或者，上述应用为在检测溶液中金属离子浓度上的应用，该金属离子选自Cu²⁺、Ni^{2 +}及Fe²⁺中的任意一种。

在一些更为具体的实施方式中，当CDs处于中性环境(pH为6.5～7.5)的溶液中时，可分别用于检测溶液中Cu²⁺、Ni²⁺或Fe²⁺的浓度，其检测方法包括以下步骤：将碳量子点与含有Cu²⁺、Ni²⁺或Fe²⁺的待测溶液混合，检测混合后溶液中的碳量子点的荧光发射光谱，并通过式(3)计算待测溶液中Cu²⁺、Ni²⁺或Fe²⁺的浓度，

其中I_F0为无Cu²⁺、Ni²⁺或Fe²⁺存在时溶液中碳量子点的荧光强度，I_F为Cu²⁺、Ni²⁺或Fe²⁺存在时溶液中碳量子点的荧光强度，[Q]为Cu²⁺、Ni²⁺或Fe²⁺浓度；所述金属离子为Cu²⁺时，K_SV为0.798±0.035L·mol^-1，所述金属离子为Ni²⁺时，K_SV为0.245±0.023L·mol^-1，所述金属离子为Fe²⁺时，K_SV为0.925±0.0034L·mol^-1；

或者，上述应用为在检测溶液温度上的应用，其检测方法包括以下步骤：将碳量子点溶于待测溶液中，检测溶液中的碳量子点的荧光发射光谱，并通过式(4)计算待测溶液的温度，

I_F＝a+b·T (4)

式中I_F为碳量子点的荧光强度，a，b分别取值为321.3和-2.3；

或者，所述应用为在检测溶剂极性上的应用，其检测方法包括以下步骤：将碳量子点溶于待测溶剂中，检测溶剂中碳量子点的荧光发射光谱，并通过式(5)计算出待测溶剂的E_T，通过与标准的E_T值进行比对从而得出待测溶剂的极性，

I_F＝a+b·E_T (5)

式中I_F为碳量子点的荧光强度，E_T为溶剂极性经验参数，a，b分别取值为506.3和0.67。

综上所述，对于碳量子点作为荧光探针这一应用，现有已知的碳量子点一般最多可作为检测溶液pH、温度和/或金属离子浓度这3种变化的荧光探针，而本发明的碳量子点针对激发波长、pH、金属离子浓度、温度及溶剂极性的变化这5种特性具备显著响应特性，即可以作为检测激发波长、pH、金属离子浓度、温度及溶剂极性这5种变化的碳量子点型荧光探针，相对于现有已知碳量子点，本发明的碳量子点应用范围更为广泛，更具备应用价值。

根据本发明的另一个方面，还提供上述以蚕砂为原料的碳量子点的制备方法，包括以下步骤：

(1)将蚕砂与碳化剂混合后进行微波反应得微波反应溶液；

(2)将微波反应溶液去除不溶性杂质后，进行透析，后经冷冻干燥即得碳量子点粉末；

其中，步骤(1)蚕砂与碳化剂的质量体积比为1g：1mL～1g：30mL，且微波反应需在搅拌或者转动状态下进行，微波反应条件为：100～1000W，2～60min。

本发明采用了碳化剂，配合微波反应这一较为剧烈的条件，可以加速蚕砂的碳化，同时提高碳化效率，微波反应过程中转动或是搅拌能够促使CDs较好的分散而不发生聚集，本发明上述制备方法得到的CDs含有的杂质较少，而且产率较高，均在75％以上。

另外，本发明需要控制蚕砂和碳化剂的用量比，若蚕砂(g)与碳化剂(mL)的质量体积比小于1:1，则容易造成碳化不完全，基本上都是杂质或是聚集量子点；若碳化剂用量太大，则会使得CDs再次被反应，产生二氧化碳、二氧化氮等有毒产物，同时大大降低CDs的产率。

在一些更为具体的实施方式中，本发明制备方法中，蚕砂最少用量为0.1g，最多用量为5g(基于25mL反应釜)。

本发明制备的CDs的浓度有两种确定方法：

其一是用称取冻干得到的CDs粉末，再次分散到适量水或缓冲溶液中，得到确定的浓度，单位为g/mL；

其二是不经过冻干，直接选用透析得到的CDs溶液，用光学方法测量，根据Parker规则：

分别测得CDs的荧光强度I，量子产率

摩尔吸收ε，构型系数k，光程长度d及光源强度I₀，即可推知浓度c。

在一些实施方式中，需要限定后续处理中透析的操作，即步骤(2)的透析操作具体为：将微波反应溶液去除不溶性杂质后，置于透析袋中，每10～30min更换透析用的去离子水，透析5～10次。

上述透析的时间和透析液(去离子水)换液的频率可以进一步保证获得的碳量子点为纳米级。

在一些实施方式中，上述碳化剂选自浓硫酸、浓硝酸、五氧化二磷、N-(三乙基铵磺酰)氨基甲酸甲酯中的任意一种。

当以浓硫酸或者五氧化二磷为碳化剂按照上述方法制备碳量子点时，所获得的碳量子点中N掺杂的原子百分比为0.01～10％，O掺杂的原子百分比为0.05～5％，当以浓硝酸作为碳化剂按照上述方法制备碳量子点时，所获得的碳量子点中N掺杂的原子百分比为1～30％，O掺杂的原子百分比为0.05～5％，当以N-(三乙基铵磺酰)氨基甲酸甲酯作为碳化剂按照上述方法制备碳量子点时，所获得的碳量子点中N掺杂的原子百分比为1～15％，O掺杂的原子百分比为1～5％。

利用本发明上述方法制备得到的碳量子点的粒径为3～4nm，平均水合粒径为4.86nm，且含氮修饰，其水溶性好，能够在常温保存一年以上，且其光稳定性良好，可作为针对激发波长、pH、金属离子浓度、温度及溶剂极性的变化有着显著响应特性的碳量子点型荧光探针，从而为未来的生物检测和成像领域提供了广阔的应用前景。

附图说明

图1为实施例5水溶性CDs的透射电镜图(图1a)和动态光散射测定的CDs的水合粒径分布图(图1b)；

图2为实施例5水溶性CDs的红外光谱图；

图3为实施例5水溶性CDs(实施例5步骤(2)制备得到的CDs溶于在pH为7的BR缓冲液中得到)的荧光发射光谱(图3a)和归一化发射光谱(图3b，λ_ex＝360,380,400,420,440,460,480,500,520nm，其中内插图为最大发射波长λ_em,max对最大激发波长λ_ex,max的变化关系图)；

图4为实施例5水溶性CDs在不同pH值的缓冲液中的荧光发射光谱(图4a)、归一化发射光谱图(图4b，其中λ_ex＝440nm，pH＝2.18、3.59、4.33、5.56、6.37、7.63、8.35、9.25、10.24)、最大发射波长λ_em,max对pH的变化关系(图4c)、不同pH下CDs发射光谱的色度变化(图4d)、对比例1的CDs最大发射波长与pH的变化关系(图4e)，以及不同pH值下CDs颜色变化(图4f，从左到右,pH分别为2.18、3.59、4.33、5.56、6.37、7.63、8.35、9.25、10.24)；

图5为实施例5水溶性CDs分别在含有Cu²⁺的HEPES缓冲液(pH＝7)中的荧光发射光谱(图5a)(λ_ex＝440nm，C_Cu＝2×10^-4，4×10^-4，6×10^-4，8×10^-4mol L^-1)、在含有0.01M EDTA的荧光发射光谱(图5b)(V_EDTA＝0,20,40,60,80μL)、在含有Cu²⁺的HEPES缓冲液中的Stern-Volmer猝灭关系(图5c)、在含有其他金属离子的HEPES缓冲液(pH＝7)时的I_F0/I_F值(图5d)；

图6为实施例5水溶性CDs在BR缓冲液中(pH＝5.56)，λ_ex＝440nm时不同温度下荧光发射光谱(图6a)、荧光发射强度随温度的变化关系(图6b)；

图7为实施例5水溶性CDs在不同极性溶剂下荧光发射光谱(图7a)、荧光发射强度随溶剂极性的变化关系(图7b)。

具体实施方式

下面结合附图对本发明作进一步详细的说明

实施例1

基于蚕砂的碳量子点粉末的制备方法，其包括以下步骤：

(1)将0.5g正常饲喂桑叶获得的蚕砂与5mL浓硫酸(浓硫酸中硫酸的质量分数为98％)混合后，置于25mL微波反应釜中，加入磁子搅拌或是旋转微波反应器配套转盘，500W功率下微波反应，3min得到深黄色碳量子点溶液；

(2)过滤去除不溶性杂质，将得到的反应溶液置于透析袋(1,000～10,000Da)中进行透析，每30min更换透析用的去离子水，共计5次，可得CDs水溶液；

(3)在-10℃～-50℃条件下冷冻干燥24h即可。

实施例2

基于蚕砂的碳量子点粉末的制备方法，其包括以下步骤：

(1)将0.2g正常饲喂桑叶获得的蚕砂与5mL浓硝酸(浓硝酸中硝酸的质量分数为68％)混合后，置于25mL微波反应釜中，加入磁子搅拌或是旋转微波反应器配套转盘，100W功率下微波反应，5min得到深黄色碳量子点溶液；

(2)过滤去除不溶性杂质，将得到的反应溶液置于透析袋(1,000～10,000Da)中进行透析，每20min更换透析用的去离子水，共计6次，可得CDs水溶液；

(3)在-10℃～-50℃条件下冷冻干燥24h即可。

实施例3

基于蚕砂的碳量子点粉末的制备方法，其包括以下步骤：

(1)将0.3g正常饲喂桑叶获得的蚕砂与5g五氧化二磷水溶液(现配现用，五氧化二磷的质量分数为60％)混合后，置于25mL微波反应釜中，加入磁子搅拌或是旋转微波反应器配套转盘，700W功率下微波反应，10min得到深黄色碳量子点溶液；

(2)过滤去除不溶性杂质，将得到的反应溶液置于透析袋(1,000～10,000Da)中进行透析，每25min更换透析用的去离子水，共计7次，可得CDs水溶液；

(3)在-10℃～-50℃条件下冷冻干燥24h即可。

实施例4

基于蚕砂的碳量子点粉末的制备方法，其包括以下步骤：

(1)将5g正常饲喂桑叶获得的蚕砂与5mL N-(三乙基铵磺酰)氨基甲酸甲酯丙酮溶液，((N-(三乙基铵磺酰)氨基甲酸甲酯的质量分数为45％)混合后，置于25mL微波反应釜中，加入磁子搅拌或是旋转微波反应器配套转盘，1000W功率下微波反应，60min得到深黄色碳量子点溶液；

(2)过滤去除不溶性杂质，将得到的反应溶液置于透析袋(1,000～10,000Da)中进行透析，每10min更换透析用的去离子水，共计10次，可得CDs水溶液；

(3)在-10℃～-50℃条件下冷冻干燥24h即可。

对比例1

基于蚕砂的碳量子点的制备方法：取1.5g蚕砂粉末，加入适量去离子水，置于反应釜中于微波炉中，500W下处理5min后取出，自然冷却至室温，在功率为500W的超声波清洗器中超声处理10min,得到分散均匀的悬浊液，悬浊液经10000r/min离心20min，将获得的上清液用0.22μm的微孔滤膜过滤，然后用3500Da透析袋透析24h，将透析后的溶液进行旋转蒸发浓缩，然后于-50℃下冷冻干燥，最终得到荧光碳点粉末。

可称取10mg荧光碳点粉末，分散在10mL超纯水中，得到对照CDs水溶液。

实施例5水溶性碳量子点溶液的制备

水溶性基于蚕砂的碳量子点的制备方法，其包括以下步骤：

(1)将0.5g正常饲喂桑叶获得的蚕砂与5mL浓硫酸(浓硫酸中硫酸的质量分数为98％)混合后，置于25mL微波反应釜中，加入磁子搅拌或是旋转微波反应器配套转盘，500W功率下微波反应，3min得到深黄色碳量子点溶液；

(2)过滤去除不溶性杂质，将得到的反应溶液置于透析袋(1,000～10,000Da)中进行透析，每30min更换透析用的去离子水，共计5次，可得CDs水溶液；

(3)将透析后的CDs水溶液分散在10mL三酸混合缓冲液(即BR缓冲液,pH＝5.56)中，得到棕黄色水溶性的CDs储备液，其中CDs的浓度约为8×10^-5mol L^-1。

一、性能表征

将实施例5制备得到的水溶性CDs通过透射电镜和红外光谱进行检测，结果如图1和图2。

从CDs的透射电镜(图1a)中可知碳量子点分布均匀，颗粒较小，粒径大约在3～4nm左右。利用动态光散射方法测得分散在水中的CDs粒径为4.86nm(图1b)，较透射电镜结果稍大，应是结合了部分溶剂水分子导致的。

同样将上述制备得到的水溶性CDs用于红外光谱检测，结果如图2所示，图2中，3296cm^-1归属为O-H键，2750～3000cm^-1的几个强峰归属为C-H或N-H键，1762cm^-1及1695cm^-1归属为C＝O键，1000～1250cm^-1归属于C-N及C-O-C键的伸缩振动，1350～1500cm^-1及400～650cm^-1处的峰为C-H的振动峰。综上，红外数据显示所制得的碳量子点中可能含有羟基，羰基，酯基、醚键、碳氮键等基团。

二、荧光性质

检测实施例5制备得到的水溶性CDs对激发波长为360～520nm激发的荧光发射谱，以及发射400～700nm下的荧光激发谱。

结果如图3a所示，随着激发波长从360nm增加到520nm，其荧光强度呈现为先增大后减小的趋势，而在激发波长为440nm时，得到最大发射波长为548nm；随着激发波长的增大，发射光谱也随之红移，且在400～700nm存在一个极具特征的宽峰，这表明CDs表面有不同荧光发射基团相互影响。

将所有激发波长下的发射光谱对最大激发波长(440nm)下的发射光谱的最大强度作归一化处理，得到图3b。可看出随激发波长的增大，最大发射波长红移趋势更为明显。以最大发射波长λ_em,max对最大激发波长λ_ex,max的变化拟合，可得如式(1)的变化关系。

式中λ₀，A，B，C均为常数，当取值分别为530.59，333.82，1.25及50.63时，拟合效果最好R＝0.993。利用上述关系可以作为判别最大发射波长λ_em,max与最大激发波长λ_ex,max二者的标准曲线，当已知CDs任意一个最大发射波长时，即可推知其最大激发波长，反之亦然。

三、pH对水溶性CDs荧光性质的影响

分别在实施例5中制备得到的20μL CDs水溶液加入3mL，pH＝2.18,3.59,4.33,5.56,6.37,7.63,8.35,9.25,10.24的BR缓冲液混匀，即可得到不同pH的CDs缓冲溶液(图4f)，分别测试不同条件下CDs的荧光发射光谱。

同样，将对比例1中制备得到的20μL CDs水溶液加入3mL，pH＝2.18,3.59,4.33,5.56,6.37,7.63,8.35,9.25,10.24的BR缓冲液混匀，即可得到不同pH的CDs对照缓冲溶液，分别测试不同条件下对比例1中CDs的荧光发射光谱。

CDs在不同pH的BR缓冲液中测得CDs的荧光发射谱的变化情况如图4a所示。在相同激发条件和浓度条件下，所得CDs的荧光强度随pH的升高而降低，并且CDs发射峰位置随pH的升高而红移(图4b)。更换缓冲体系后(如改用HAc-NaAc缓冲体系)，CDs荧光强度随pH的变化规律并没有发生变化，说明CDs的荧光强度随pH的变化与缓冲体系无关，而是主要由pH变化引起的。

联系图2红外图谱的相关数据，可以做出推断：由于所合成的CDs表面富含羰基，羟基和酯基等含氧基团，容易与H⁺及OH^-相互作用，因此其对pH的变化有一定的响应能力。以最大发射波长λ_em,max对pH的变化拟合，可得如式(2)的变化关系。

λ_em,max＝A+B·pH (2)

式中A，B均为常数，当取值分别为2.79及535.73时，拟合效果最好R＝0.995(图4c)。利用上述关系可以作为判别最大发射波长λ_em,max与pH二者的标准曲线，当已知任意一个CDs的最大发射波长时，即可得出其所处的环境的pH值，反之亦然。我们将上述归一化发射光谱变化转换为色坐标，绘制于CIE色度图中(图4d)，这样就可以通过肉眼或是相机识别色彩变化从而读取对应的pH值，成为一类光学“pH试纸”。其中色坐标的坐标轴xy分别表示颜色色度的不同。

另外，同样方法检测显示对比例1的CDs对照缓冲溶液随着pH的增加呈现最大发射波长蓝移的现象，且对比例1的CDs的荧光强度随pH变化没有显著的规律可言(图4e)。

四、金属离子浓度对CDs荧光性质的影响

分别将实施例5中制备得到的10μL CDs水溶液加入1.5mL pH＝7的HEPES缓冲溶液中混匀，即可得到中性CDs缓冲溶液，再加入1.5mL不同浓度的不同金属离子溶液，以Cu²⁺为例，使最终溶液中铜离子浓度为2×10^-4，4×10^-4，6×10^-4，8×10^-4mol L^-1。

而后分批次加入0.01mol L^-1EDTA溶液(V_EDTA＝0,20,40,60,80μL)，分别测试不同条件下CDs的荧光发射光谱。

以Cu²⁺的检测为例。随着铜离子的加入，CDs的荧光强度发生了显著的猝灭(图5a)，推测是由于CDs结合Cu²⁺后吸附到颗粒表面，引起电子转移或CDs聚集，导致CDs荧光强度下降。随Cu²⁺浓度增加，荧光强度减弱。荧光淬灭的原因可能是Cu²⁺与碳量子点中N或O的螯合作用使它们间的距离更紧凑，并发生自淬灭。

因此设计了竞争实验进行验证。在CDs与Cu²⁺的混合溶液中加入络合能力更强的配体EDTA将竞争性地与铜离子结合，从而引起Cu²⁺从CDs表面解离，与EDTA结合重新扩散到溶液中去，CDs的荧光则会恢复。当往聚集体中加入强的络合配体EDTA后，实验结果证实了我们这一设想，CDs的荧光有所恢复(图5b)。猝灭的过程通常可以用Stern-Volmer关系进行描述，即：

其中I_F0为无Cu²⁺存在时溶液中碳量子点的荧光强度，I_F为Cu²⁺存在时溶液中碳量子点的荧光强度，K_SV为Stern-Volmer淬灭常数，[Q]为淬灭剂浓度。利用上式拟合Cu²⁺对CDs的猝灭关系，可得如图5c所示的线性关系(F₀/F相当于y，[Q]相当于x，Ksv是斜率0.798，截距为1)。图中斜率K_SV与淬灭速率和无淬灭剂时荧光分子的激发态寿命有关，当K_SV取值为0.798±0.035L·mol^-1时，拟合效果最好，R＝0.993(图5c)。该线性关系可以作为判别CDs荧光强度变化与铜离子浓度的标准曲线，利用荧光强度变化实现铜离子浓度的准确测量。

在相同浓度下，在HEPES缓冲溶液中(图5d)往CDs中加入其他常见的二价及三价金属离子，大部分不会引起CDs荧光的显著变化，体现了较好的选择性，其中Fe²⁺，Ni²⁺对探针有一定的干扰。上述结果说明，在中性条件下，基于蚕砂的CDs可以在无其他离子干扰的情况下，分别实现对Cu²⁺、Ni²⁺及Fe²⁺的检测(当分别检测Ni²⁺或Fe²⁺的浓度时，实验方法同检测Cu²⁺的方法，同样可以用式(3)分别计算Ni²⁺或Fe²⁺的浓度，当检测金属离子为Ni²⁺时，K_SV为0.245±0.023L·mol^-1，当检测金属离子为Fe²⁺时，K_SV为0.925±0.0034L·mol^-1)。

利用对比例1制备得到的CDs水溶液进行上述同样的金属离子实验，结果显示：对比例1的CDs水溶液对于常见金属离子均没有明显的响应结果，随着金属离子的加入，CDs的荧光强度未发生显著变化，Cu²⁺、Fe³⁺、Al³⁺、Ni²⁺及Fe²⁺的I_F0/I_F值均在1～1.08之间。

五、温度对CDs荧光性质的影响

将实施例5中制备得到的3mL CDs储备液放入牛津仪器公司OptistatDN2型号的低温恒温器中(温度控制范围77～500K)，调节温度变化范围设定为20～70℃，分别测试不同条件下CDs的荧光发射光谱。

由于分散在水中，因而温度变化范围设定为20～70℃。在该温度范围内，CDs的荧光强度会随着温度的升高显著降低(图6a)，但荧光峰并未发生明显的移动。上述现象可能是由于温度升高导致分子运动速度加快，CDs之间的碰撞概率增加，从而使得非辐射跃迁几率大大增加，从而降低了CDs的荧光效率。CDs的荧光强度I_F与温度之间满足如式(4)所示的线性关系：

I_F＝a+b·T (4)

式中a，b均为常数，当斜率b和截距a分别取值为-2.3及321.3时，线性关系最好，R＝0.999(图6b)。该线性关系可以作为判别CDs荧光强度变化与温度变化的标准曲线，利用荧光强度变化实现对温度的传感和监测。

利用对比例1制备得到的CDs水溶液进行上述同样的温度实验，即检测不同温度下CDs的荧光发射光谱，结果显示：

对比例1的CDs的荧光强度也会随着温度的升高降低，并且也呈现出线性变化规律，但是其变化幅度较小，在50℃的温度变化区间内，其线性关系对应的斜率为-1.5，说明对比例1的CDs对温度的响应没有实施例5中制备得到的CDs对于温度的响应灵敏。

六、溶剂极性对CDs荧光性质的影响

分别取用100mg实施例1制备得到的粉末溶解于100mLDMF、丙酮、甲醇、乙醇、乙酸乙酯、乙腈、水等7种不同溶剂中，测量其荧光光谱。

结果表明：基于蚕砂制备的CDs不仅可以较好地分散在水中，当换用其他不同溶剂时，如DMF、丙酮、甲醇、乙醇、乙酸乙酯及乙腈时，CDs均可以较好地分散在其中。随着溶剂极性的增加，CDs的最大荧光发射波长随之红移(图7a)。这几种溶剂的极性经验参数及分散在其中CDs的最大荧光发射波长如表1所示。

表1溶剂极性经验参数E_T(30℃)及分散在其中CDs的最大发射波长

	水	甲醇	乙醇	乙腈	丙酮	DMF	乙酸乙酯
								E<sub>T</sub>/kcalmol<sup>-1</sup>	63.1	55.4	51.9	45.6	42.2	43.2	38.1
λ<sub>em,max</sub>/nm	547.6	543.2	540.2	539.8	534.8	532.6	531.4

CDs的荧光强度I_F与溶剂极性经验参数E_T之间满足如式(5)所示的线性关系：

I_F＝a+b·E_T (5)

式中a，b均为常数，当斜率b和截距a分别取值为0.67及506.3时，线性关系最好，R＝0.911(图7b)。其中CDs在乙腈及DMF中最大发射波长位置偏离线性最为明显。该线性关系可以作为判别CDs荧光强度变化与溶剂极性的标准曲线，可粗略判断CDs分散的溶剂极性。

利用对比例1制备得到的CDs水溶液进行上述同样的溶剂极性实验，结果显示：

对比例1制备得到的CDs几乎不分散在乙酸乙酯及乙腈中，不能测到其荧光发射光谱。而在水、甲醇、乙醇、DMF、丙酮这几种溶剂中，其荧光最大发射波长随极性变化比较微小，变化杂乱无章，没有明显规律，甚至可以用一条水平线拟合(R²＝0.973)。

以上所述的仅是本发明的一些实施方式。对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。

Claims (3)

1.荧光探针的应用，其特征在于，所述荧光探针为碳量子点，其制备方法包括如下步骤：

(1)将蚕砂与碳化剂混合后进行微波反应得微波反应溶液；

(2)将微波反应溶液去除不溶性杂质后，进行透析，后经冷冻干燥即得碳量子点粉末；

其中，步骤(1)蚕砂与碳化剂的质量体积比为1g：1mL～1g：30mL，且微波反应需在搅拌或者转动状态下进行，微波反应条件为：100～1000W，2～60min；

步骤(1)所述碳化剂选自浓硫酸、浓硝酸、五氧化二磷、N-(三乙基铵磺酰)氨基甲酸甲酯中的任意一种；

所述应用为在检测溶液pH值上的应用，其检测方法包括以下步骤：将碳量子点溶于待测溶液中，检测溶液中的碳量子点的荧光发射光谱，并通过式(2)计算待测溶液的pH值，

λ_em,max＝A+B·pH (2)

式中λ_em,max为碳量子点的最大荧光发射波长，A，B取值分别为2.79及535.73；

或者，所述应用为在检测溶液中金属离子浓度上的应用，所述金属离子选自Cu²⁺、Ni²⁺及Fe²⁺中的任意一种，其检测方法包括以下步骤：将碳量子点与含有Cu²⁺、Ni²⁺或Fe²⁺的待测溶液混合，检测混合后溶液中的碳量子点的荧光发射光谱，并通过式(3)计算待测溶液中Cu²⁺、Ni²⁺或Fe²⁺的浓度，

其中I_F0为无Cu²⁺、Ni²⁺或Fe²⁺存在时溶液中碳量子点的荧光强度，I_F为Cu²⁺、Ni²⁺或Fe²⁺存在时溶液中碳量子点的荧光强度，[Q]为Cu²⁺、Ni²⁺或Fe²⁺浓度；所述金属离子为Cu²⁺时，K_SV为0.798±0.035L·mol^-1，所述金属离子为Ni²⁺时，K_SV为0.245±0.023L·mol^-1，所述金属离子为Fe²⁺时，K_SV为0.925±0.0034L·mol^-1；

或者，所述应用为在检测溶液温度上的应用，其检测方法包括以下步骤：将碳量子点溶于待测溶液中，检测溶液中的碳量子点的荧光发射光谱，并通过式(4)计算待测溶液的温度，

I_F＝a+b·T (4)

式中I_F为碳量子点的荧光强度，a，b分别取值为321.3和-2.3；

或者，所述应用为在检测溶剂极性上的应用，其检测方法包括以下步骤：将碳量子点溶于待测溶剂中，检测溶剂中碳量子点的荧光发射光谱，并通过式(5)计算出待测溶剂的E_T，通过与标准的E_T值进行比对从而得出待测溶剂的极性，

I_F＝a+b·E_T (5)

式中I_F为碳量子点的荧光强度，E_T为溶剂极性经验参数，a，b分别取值为506.3和0.67。

2.根据权利要求1所述的荧光探针的应用，其特征在于，所述待测溶液的pH为6.5～7.5。

3.根据权利要求1或2所述的荧光探针的应用，其特征在于，碳量子点的制备方法中，步骤(2)的透析操作具体为：将微波反应溶液去除不溶性杂质后，置于透析袋中，每10～30min更换透析用的去离子水，透析5～10次。

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