CN109415753B - 鉴定细菌革兰氏类型的方法和系统 - Google Patents
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Abstract
革兰氏类型细菌菌株的检测包括:在415nm‑440nm波长范围照射在所述范围内具有天然电磁响应的所述菌株的至少一个细菌;在415nm‑440nm范围获取由所述受照射细菌反射或经过其透射的光强度;和根据在415nm‑440nm范围获取的光强度确定所述细菌菌株的革兰氏类型。
Description
技术领域
本发明涉及微生物学分析领域,具体涉及鉴定细菌的革兰氏类型。
有利地,本发明应用于细菌菌落的高光谱或多光谱图像分析,所述菌落在非生色、非荧光和无染料的营养培养基中生长。
现有技术
细菌菌株的革兰氏分类使得可以鉴定其细胞壁,例如其肽聚糖百分比,并用于细菌分类学或评估其对抗生素的敏感性。因此区分2种细菌类型,即革兰氏“阳性”菌和革兰氏“阴性”菌。关于细菌菌株革兰氏类型的知识使得可以例如选择合适测试鉴定菌株或进行抗生素敏感性测试,如选择合适卡片用于由申请人出售的2自动装置完成的抗生素敏感性测试。
在历史上,细菌菌株的革兰氏类型由称为“革兰氏染色”的人工技术确定,该技术包括大量手工步骤(固定、染色、蚀刻、洗涤、对比染色等),因而需要长时间来实施。因此,开发了多种技术以使细菌革兰氏类型的检测自动化,尤其是为了处理大量样品。然而,这些技术大部分继续改良细菌或其培养基的电磁响应以使其革兰氏类型易观察到。
例如,第一类技术包括使显微镜盖玻片上的细菌膜染色自动化,但决定革兰氏类型的最终步骤仍由在显微镜下观察盖玻片的技术员完成。因此,此类技术不完全自动化,并且难以自动化。这是因为革兰氏阳性菌与革兰氏阴性菌之间的颜色差异可能细微,解释了为什么仍需要实验室技术员参与。
第二类技术包括在底物存在下放置细菌,底物通过细菌膜肽聚糖起始的酶反应来降解。此反应生成发色团或荧光团,其浓度指示革兰氏。通常使用术语细菌的发色或荧光“染色”。尽管此类型的现有技术能自动化,例如通过用合适装置(如分光仪/荧光仪)测量发色团/荧光团的光强度和随后用计算机程序比较,然而,用预定阈值测量的强度需要设计特定发色团或荧光底物,这些通常昂贵。
另外,无论所用技术如何,细菌经历其天然状态修饰(例如,其包括染料,其具有结合的发色或荧光标记等),因而不能用于后续鉴定测试(如确定抗生素敏感性)。
发明内容
本发明目的是提供确定细菌菌株的革兰氏类型的方法,其是自动化的且不需要标记或染色细菌以确定其革兰氏类型。
为此,本发明主题是确定细菌菌株的革兰氏类型的方法,包括:
-在415nm-440nm波长范围照射在所述范围内具有天然电磁响应的所述菌株至少一个细菌;
-在415nm-440nm范围获取由所述受照射的细菌反射或经过其透射的光强度;和
-根据在415nm-440nm范围所获取的光强度确定细菌菌株的革兰氏类型。
出于本发明目的,表述“天然电磁”响应意在指细菌不通过元素(染料、发色基因、荧光基因等)方式修饰,这些元素至少在感兴趣波长范围内修饰细菌对照射的电磁响应。例如,菌落在非着色、非生色和非荧光的营养培养基中培养,在仍存在于其培养基中的菌落上直接进行照射/获取。
换言之,发明人发现了其中细菌“天然”具有其革兰氏类型特有的电磁特征的波长范围。因此,本发明所述方法包括测量此特征和随后从中提取革兰氏类型。由此,不必使用发色或荧光底物或染料。此外,本发明所述方法快速,因为其包括照射、测量光谱和进行此光谱的处理,尤其是计算机处理。
根据一个实施方案,所述细菌还在750nm-800nm波长范围内具有天然电磁响应;和:
-也在750nm-800nm波长范围照射所述细菌;
-在750nm-800nm范围获取由受照射细菌反射或经过其透射的光强度;和
-根据在所述415nm-440nm和750nm-800nm范围所获取的光强度确定细菌菌株的革兰氏类型。
换言之,细菌还包括在其革兰氏类型特有的750nm-800nm范围内的天然电磁特征。也能在此范围内检测其革兰氏类型。有利地,通过组合这两个波长范围,确定革兰氏类型时可获得较好精度。
根据一个实施方案,所述确定革兰氏类型包括:
-根据所获取的光强度计算所述受照射细菌的反射或吸收因数;
-根据计算的反射或吸收因数确定革兰氏类型。
换言之,反射或吸收因数更如实地反映细菌天然电磁行为,因为这校正关于照射光谱行为和传感器(如白点、黑点、感兴趣范围内照射的光谱非均匀性)的测量信号并因而允许更准确的检测。
具体地,所述确定革兰氏类型包括:
-计算所计算的反射或吸收因数的波长的一阶导数;
-根据所计算的一阶导数确定革兰氏类型。
换言之,发明人注意到当对光强度或反射/吸收因数求导时,革兰氏类型特有电磁特征更具识别性,这允许更准确的检测。
根据一个实施方案,所述确定革兰氏类型根据415nm-440nm范围内的单一波长、特别是420nm波长处光强度进行。更具体地,所述确定革兰氏类型包括:
-比较等于在420nm处光强度的值或从中计算的值与预定第一阈值和预定第二阈值,所述阈值区分革兰氏阳性染色和革兰氏阴性染色,第一阈值大于第二阈值;
-如果所述值高于所述第一阈值,则确定革兰氏阴性,如果所述值低于所述第二阈值,则确定革兰氏阳性。
换言之,甚至用单一波长、特别是420nm获得良好的检测精确水平。具体地,简单阈值化使得具有最小80%精度成为可能。这使得简化计算机计算和/或照射及传感器成为可能。所述确定能在光强度自身基础上或在其预处理后(如滤除噪声、去除偏移、通过一阶和二阶导数)完成。
根据一个实施方案,所述确定革兰氏类型包括应用预定线性预测,所述预测将所获取的光强度或从中计算的值与革兰氏类型关联,然后是所应用的线性预测的结果的阈值化。这种技术使得实现高于[待完成]的精度水平成为可能。
作为一种变化,所述确定革兰氏类型包括将二类分类的SVM类型应用于所获取的光强度或从中计算的值。
根据一个实施方案,所述照射和获取直接在含细菌菌株菌落和所述菌落生长的营养培养基的样品上进行。
换言之,本发明有利地直接应用于通常在微生物工作流程即菌落生长中产生的样品,例如在皮氏培养皿上,从而本发明不涉及提供用于进行测试的特定样品制品。此外,菌落包括所述菌株的非常大量的细菌。因此,测量由菌落反射或经过其透射的强度使得自然增加检测可靠性程度成为可能,例如强度被自然平均。然而,应注意本发明应用于细菌的个体检测,当观察若干细菌时,使得进行统计研究成为可能。同样,本发明显然应用于皮氏培养皿常用那些(通常是琼脂)以外的培养基,例如,细菌悬浮于其中的液体培养基。
特别地,所述确定革兰氏类型根据所述营养培养基进行。换言之,营养培养基也在感兴趣波长范围内具有其自身“电磁特征”,并且因而能破坏革兰氏类型的检测。通过在处理期间或选择用于菌落生长的培养基期间考虑营养培养基,获得更好的检测精度。
特别地,在表面上生长菌落的不透明基材,所述基材优选具有的反射率ρ小于或等于10%,优选小于或等于5%。特别地,在基于反射光强度的检测中,获得更好的精度。
根据一个实施方案,所述光强度的获取包括获取菌株细菌菌落的高光谱或多光谱图像,光强度根据对应于菌落的所述图像至少一个像素来确定。特别地,光强度等于对应于菌落的所述图像的平均像素。
换言之,高光谱或多光谱成像使得通过单一传感器方式同时获取2个范围415nm-440nm和750nm-800nm成为可能,并且也使获得若干像素中所获取各波长的空间均值成为可能,从而增加检测精度。众所周知,术语“高光谱”对应于作为整体的波长范围(取样间隔内)的获取,而术语“多光谱”一般指在不同范围内的获取。
本发明的一个主题也是用于进行所描述方法的系统。特别地,本发明的一个主题是用于检测细菌菌株的革兰氏类型的系统,包括:
-照明设备(éclairage),配置成在415nm-440nm波长范围内照射所述菌株的至少一个细菌;
-传感器,配置成在415nm-440nm范围获取由所述受照射的细菌反射或经过其透射的光强度;和
-计算机单元,配置成根据在415nm-440nm范围所获取的光强度确定细菌菌株的革兰氏类型。
根据一个实施方案:
-照明设备,配置成在750nm-800nm波长范围内照射所述细菌;
-传感器,配置成在750nm-800nm波长范围获取由所述受照射的细菌反射或经过其透射的光强度;和
-计算机单元,配置成根据在所述415nm-440nm和750nm-800nm范围所获取的光强度确定细菌菌株的革兰氏类型。
根据一个实施方案,所述系统配置成照射包括所述菌株细菌菌落和其中生长所述菌落的营养培养基的样品、尤其是皮氏培养皿以及获取其图像。
附图简述
本发明通过阅读以下描述而被更清楚理解,所述描述仅通过举例方式给出并结合附图提供,其中相同的引用指示相同或类似元件,且其中
-图1是本发明用于预测革兰氏类型的系统的示意图;
-图2是通过图1的系统预测革兰氏类型的方法的流程图;
-图3A和3B是阐述在透明培养基上生长的细菌菌落的反射光谱的图;
-图4A和4B是阐述在不透明培养基上生长的细菌菌落的反射光谱的图;
-图5是阐述根据本发明一种变化用于预测的线性预测模型的图;
-图6是阐述就多种获取波长而言通过单通道线性预测模型获得的相关性的图;
-图7是阐述通过单通道线性预测模型预测革兰氏类型的结果的图;
-图8阐述能用于根据本发明预测的不同决定变量的表格;
-图9是阐述通过多通道线性预测模型预测革兰氏类型的结果的图;
-图10是阐述多通道模型参数的图,作为获取波长的函数;
-图11是阐述基于SVM分类的预测模型组分的图,作为获取波长的函数;
-图12是阐述基于学习“fused Lasso”类型的预测模型组分的图,作为获取波长的函数;和
-图13A和13B是阐述在TSA和MH2培养基上生长的细菌菌落的反射光谱的图。
发明详述
在后续文本中,注释Ai,j涉及矩阵A第i行第j列的元素。
参考图1,用于根据第一实施方案检测细菌菌株的革兰氏类型的系统10包括:
-用于获取高光谱图像的装置12;和
-数据处理计算机单元14,连接(如通过有线或无线连接)装置12以控制其以及接受和处理装置12所获取的图像。
装置12,例如来自美国蒙大纳Resonon公司的参照“Pika II”高光谱成像系统,包括:
-“高光谱”相机18,由数字传感器和光散射元件或用于选择由传感器获取的波长的光谱仪组成,所述数字传感器包括以下的网络:基本传感器例如CCD或CMOS类型的数字传感器,在波长范围[λmin;λmax]=[400;900]纳米内敏感;
-物镜20,用于在相机18的数字传感器上聚焦皮氏培养皿22的光学图像,其需要获取高光谱图像;
-正面照明设备24,例如由一个或多个异源灯组成,如2或4个灯,能在[λmin;λmax]范围内发射光以产生皮氏培养皿22的均匀正面照明。例如,照明设备是白光灯;
-背面照明设备26,例如由白光LED矩阵组成,用于在[λmin;λmax]范围内产生皮氏培养皿22的均匀背面照明;和
-托架28,皮氏培养皿22位于其上且这允许后者在物镜20前面通过以通过扫描获得培养皿22的完整图像。
例如,装置12配置成获取90毫米x 90毫米区域的图像,取样间隔为160微米(估计空间分辨率在300微米)且对于[λmin;λmax]范围光谱分辨率为1.7纳米。
因此,装置12生成皮氏培养皿反射光的数字图像HSI,具有N行和M列,皮氏培养皿22优选打开(即没有其盖子):
像素亮度,通常称为“光强度”,这里对应于暴光阶段中相机18传感器的相应基本敏感位点表面上的入射光量,例如已知来自数字摄影视野本身。
各像素Radi,j(λ)由培养皿22辐射率的数字光谱构成,对应于多种波长[λmin;λmax]的像素,数字光谱根据以下关系表述:
数据处理单元14是例如个人电脑、平板电脑、智能手机、服务器、超级计算机,或更一般是基于一个或多个微处理器的任何系统,尤其是DSP(数字信号处理器)类型,基于FPGA类型电路,基于混合这些技术类型的电路等,配置成进行由获取装置12生成的HSI图像处理。单元14特定具有所有存储器(RAM、ROM、高速缓冲存储器、主存储器等)以保存装置12生成的图像,计算实施本发明方法的指令,用于此实施的参数和保存中间及最终计算结果,尤其是确定的革兰氏类型。单元14任选包括显示屏以呈现革兰氏类型测定的最终结果。尽管描述单一处理单元,本发明显然应用于通过若干处理单元进行的处理(如在相机18内安装的单元以进行HSI图像预处理和装置12外部的单元以进行剩余的处理)。此外,所述系统能补充有能输入样品相关数据到单元14的界面,尤其是当预测取决于培养基时使用的培养基类型,例如通过键盘/鼠标和操作员可用的向下滚动菜单、条形码/QR码读取器,其读取皮氏培养皿上存在的条形码/QR码且包括培养基上的信息等。
用于通过刚才所述系统确定细菌菌株的革兰氏类型的方法30现在结合图2流程表详述。
在所述方法的第一步骤32中,细菌菌株的至少一个菌落在营养培养基或“培养”基表面上培养,所述培养基置于皮氏培养皿中。营养培养基的主要目的是引起所述菌落生长,和任选通过限制光干扰来加强革兰氏类型的检测精度。优选关于根据反射光强度检测革兰氏类型,所述营养培养基是不透明的,从而增加检测的准确程度。特别地,所述不透明培养基具有的反射因数ρ小于或等于10%,优选小于或等于5%,甚至更优选小于或等于1%。例如,所述培养基是“CPSO”琼脂(含SiO2的“CPS”琼脂以使培养基不透明)、“Columbia”琼脂(或“CNA”琼脂)、带5%绵羊血的Columbia琼脂(或“COS”琼脂)、Man、Rogosa、Sharpe琼脂(“MRSM”琼脂)、巧克力琼脂(“PVX”琼脂)等。
由于此类菌落生长是常规的,随后不会更详细描述。可有利地由操作员手工进行,或通过自动化装置自动进行,以已知方式接种。有利地,制备以这样的方式进行,从而菌落彼此有一定距离,在其基础上进行革兰氏类型的预测,且这种方式使得菌落表面对应于装置12所获取图像的像素集合。这尤其使得促进所获取图像中的后续鉴定成为可能。
一旦菌落生长结束,皮氏培养皿打开,置于托架28上,照明设备24和26打开且皮氏培养皿的至少一个高光谱图像HSI通过获取装置12在34获取并保存于处理单元14,其完成计算机处理以在所获取图像的基础上确定菌株的革兰氏类型。
单元14任选通过预处理噪声在36开始,由以下处理操作之一或这些处理操作的任何组合组成:
a.以已知方式校正相机18的传感器噪声,尤其是其偏移、其空间噪声等;
b.处理寄生尤其是镜面反射,其形成HSI图像中的“过度亮点”,例如进行阈值化以消除具有的值高于预定阈值的像素,如高于或等于像素可具有的最大值的三分之二(即在0-255的8比特上编码的像素情况中,高于或等于170);
c.辐射测量处理使得减少外部波动如照明变化导致的图像变化成为可能,这是通过将HSI图像除以某一波长处的反射光强度,在该处波长不改变细菌类型和所用琼脂类型;
d.如果获得若干HSI图像,搜索和消除异常像素值和/或对所获取图像取平均值。
处理在38继续,将预处理HSI图像(保存在不同波长的辐射率值)转变成反射的高光谱图像以提取由皮氏培养皿单独产生的信号。这特别使得能在照明源24,26的发射光谱中过滤波动。例如,完成“平场校正”(FFC)类型的校正以获得反射率,这也具有校正像素-像素传感器响应分散(分散暗电流、分散增益)的优势。例如,此转变是根据以下关系的校正:
其中Υ(λ)是反射图像,W是保存于单元14的、高反射率中性物体的并由照明设备24,26例如高于90%的均匀反射率片(如“白色”片或带有小于10%的栅格图(charte degris)的片)照射的高光谱图像,B是保存于单元14的低反射率中性物体的高光谱图像,例如阻断物镜20的黑色覆盖物的图像,以及m(λmin+p×Δλ)=1或等于矩阵W(λmin+p×Δλ)-B(λmin+p×Δλ)均值。
在步骤38后或平行于前面的步骤,单元14在40执行鉴定细菌菌落的算法,如来自HSI(λ)或Υ(λ)图像。任何传统形状和目标识别算法能用于提取对应于菌落的图像区,称为"Col(λ)"。作为一种变化,此选择由操作员手工完成,操作员在显示屏和例如鼠标型的指向机制的协助下选择该区域。例如,区域Col(λ)由属于菌落的像素坐标列表组成。所选像素区由单元14保存。
所述方法在42继续,根据纳入区域Col(λ)的图像Υ(λ)的像素计算决定变量Xcol(λ),此变量是预测革兰氏类型应用的规则。在一个变化中,所述决定变量Xcol(λ)仅基于图像Υ(λ)。其它变化中,图像Υ(λ)补充有一个或多个其它类型的参数或者由其取代,所述参数根据反射图像Υ(λ)计算,这后续会更详细描述。为此,因而任选进行反射图像Υ(λ)的处理。特别地,单元14计算以下参数的一个和/或另一个:
i.吸光度图像A(λ),例如通过Beer-Lambert转换(关系(4))或Kubelka-Munk转换(关系(5))。不受理论约束,发明人认为革兰氏阴性菌与革兰氏阳性菌的差异在于细胞色素含量更高,细胞色素在[415-440]nm范围内吸收,这使得在吸光度图像中鉴定转变成为可能:
ii.已标准化的反射图像Υ(λ),或已标准化的吸光度图像A(λ),以降低光学效应引起的变化性。例如,所述单元完成面积标准化、单元载体标准化、均值标准化、最大值标准化、范围标准化或峰值标准化。例如,这些标准化描述于K.Varmuza和P.Filzmoser,“Introduction to Multivariate Statistical Analysis in Chemometrics”,CRCPress,2009的文献和A.Rinnan,F.van den Berg和S.Engelsen,“Review of the mostcommon pre-processing techniques for near-infrared spectra”,Trends inAnalytical Chemistry,第28卷,第10期,2009的文献;
iii.标准化或未标准化的反射图像Υ(λ)的波长的一阶导数或二阶导数或者标准化或未标准化的吸光度图像A(λ)的波长的一阶导数或二阶导数以强调光谱行为的变化并降低基线。优选地,多项式局部滤波算法用于减少误差传播,有利地描述于A.Savitzky和M.J.E.Golay“Smoothingand differentiation of data by simplifiedleast squares procedures”,Anal.Chem.,第36卷,第1627-1639页,1964年文献的算法。
随后由单元14在44根据变量Xcol(λ)通过应用预定义确定规则预测各菌落的革兰氏类型,其变化如下所述。预测的革兰氏类型保存于单元44和/或显示于屏幕上。例如,此预测被递送给另一微生物分析仪器以用于鉴别/鉴定菌落的后续步骤。
A.单通道方法
第一变化中,单变量和单通道方法由单元14实施。根据此方法,决定变量Xcol(λ)下降到在415nm-440nm波长范围内预定义波长λc处获得的单一值,如菌落的(标准化或未标准化)反射率,或菌落的(标准化或未标准化)吸光度,或其一阶导数或二阶导数。
在基于反射的第一变化中,单元14在42计算菌落的反射光谱,如根据以下关系的菌落像素上的平均光谱:
其中Ncol是区域Col(λ)的像素数。然后,决定变量Xcol(λ)等于Υcol(λc)。单元14还计算在波长λc的菌落测量误差,尤其是属于像素区Col(λ)的所有像素值Υi,j(λc)的标准偏差,表示为“SD”。
在44,单元14随后将以下对比规则应用于光谱Υcol(λc)的值:
图3A阐述在透明培养基(此情况中是CPSE)上生长的菌落的平均光谱Υcol(λ),即10个革兰氏阴性(“GN”)菌株(大肠杆菌(Escherichia coli)(3株)、阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)、奇异变形杆菌(Proteus mirabilis)、斯氏普罗威登斯菌(Providencia stuartii)、粘质沙雷氏菌(Serratiamarcescens)、肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)、摩氏摩根菌(Morganella morganii)、弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacterfreundii))和10个革兰氏阳性(“GP”)菌株(腐生葡萄球菌(Staphylococcussaprophyticus)、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)(2株)、无乳链球菌(Streptococcusagalactiae)、腐生葡萄球菌(2株)、无乳链球菌、屎肠球菌(Enterococcus faecium)、无乳链球菌)。图3B是415nm-440nm范围的更详细视图。图4A和4B阐述同一光谱,但用于在不透明培养基(此情况中是CPSO,不同于包含SiO2颗粒的CPSE)上生长的菌株。如在这些实例中注意到的,至少在415nm-440nm范围内,2种革兰氏类型彼此不同,差异就不透明培养基而言非常显著。特别地,在415nm-440nm范围内,观察到革兰氏阴性菌的光谱低于革兰氏阳性菌的光谱。
对于各培养基在30株培养的细菌菌株上测试第一变化,所述菌株是最常见参与临床感染的,即(括号之中是每种的菌株数目):
-用于革兰氏阴性:大肠杆菌(1),肺炎克雷伯菌(1),产酸克雷伯菌(Klebsiellaoxytoca)(1),奇异变形杆菌(1),摩氏摩根菌(1),嗜麦芽寡养单胞菌(Stenotrophomonasmaltophilia)(1),鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumanii)(1),阴沟肠杆菌(1),粘质沙雷氏菌(1),克氏柠檬酸杆菌(Citrobacter koseri)(1),产气肠杆菌(Enterobacteraerogenes)(1),卡他莫拉菌(Moraxella catarrhalis)(1),蜂窝哈夫尼亚菌(Hafniaalvei)(1),铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)(1),流感嗜血杆菌(Haemophilusinfluenzae)(1);
-用于革兰氏阳性:杰氏棒杆菌(Corynebacterium jeikeium)(1),无枝菌酸棒杆菌(Corynebacterium amycolatum)(1),粪肠球菌(1),屎肠球菌(1),金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)(1),表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)(1),溶血葡萄球菌(Staphylococcus haemolyticus)(1),溶血性葡萄球菌(Staphylococcus hominis)(1),肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)(1),无乳链球菌(1),酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)(1),咽峡炎链球菌(Streptococcus anginosus)(1),草绿色链球菌(Streptococcus viridans)(1)。
对于415nm-440nm范围内的各通道λ,测定革兰氏阳性菌株在值λ处光谱的最小同样,测定革兰氏阴性菌株在值λ处光谱的最大就培养基保留的通道λc是使范围最大的,并且就培养基保留的预定义阈值分别是值和对于CPSE培养基,预测革兰氏类型与上面所列相同的物种的19个菌株具有接近90%的成功率,包括10个革兰氏阳性菌株和9个革兰氏阳性菌株。对于CPSO培养基,这些相同菌株的成功是100%。
在基于反射率一阶导数的第二变化中,单元14在42计算菌落的反射光谱,如在上述菌落像素上的平均光谱Υcol(λ),然后计算平均光谱的一阶导数随后,决定变量Xcol(λ)等于在44,单元14将预测模型应用于所述变量,例如根据以下关系区分的线性模型:
如果Gram<0.5则菌落是革兰氏阴性 (11)
如果Gram>0.5则菌落是革兰氏阳性 (12)
其中Gram是评分,参数a和b是保存于单元14的预定义系数且优选取决于培养基。
在52个菌株上测试第二变化,28个是革兰氏阴性且24个是革兰氏阳性,属于最常见参与临床感染中的19个不同物种,即(括号之中是每种菌株数目):
-用于革兰氏阴性:大肠杆菌(9),肺炎克雷伯菌(3),阴沟肠杆菌(1),粘质沙雷氏菌(2),弗氏柠檬酸杆菌(2),奇异变形杆菌(2),斯氏普罗威登斯(1),摩氏摩根菌(2);
-用于革兰氏阳性:腐生葡萄球菌(9),无乳链球菌(7),屎肠球菌(3),粪肠球菌(3),金黄色葡萄球菌(1),白色念珠菌(Candida albicans)(1)。
图5阐述关系(10)的学习模型,观测到的革兰氏阴性被赋予值0,观测到的革兰氏阳性被赋予值1。进行观测与预测的革兰氏之间的线性回归,从而以已知方式确定参数a和b。模型就400nm-900nm范围的各波长进行学习,图6阐述相关系数,作为就透明培养基(此情况中是CPSE)而言是波长的函数。此相关图的最大值对应于波长λc,因而观测到415nm-440nm范围的识别特征自动通过线性回归发现,λc事实上等于415.3纳米。图7阐述就CPSE培养基而言,预测的革兰氏类型作为上述已知菌株革兰氏类型的函数,成功率大于80%。此外,不透明培养的成功率是100%。测试数个决定变量,图8的表列出所述变量。看来未标准化的反射率的一阶和二阶导数是产生最高成功率的变量,然而,根据精简原则优选一阶导数。
B.多通道方法
根据此方法,使用415nm-440nm波长范围的数个通道,有利地且任选地与750nm-800nm范围的通道组合。决定变量是Xcol(λ),例如,平均光谱反射(标准化或未标准化),吸光度(标准化或未标准化),在完整400nm-900nm范围的一阶导数或二阶导数。
根据第一变化和出于上面提及的原因,使用未标准化的反射率的一阶导数。单元14因而在42计算400nm-900nm范围内平均光谱Υcol(λ)的一阶导数如前所述,此导数构成决定变量Xcol(λ)。单元14在44将预测模型应用于所述变量,例如根据以下关系的线性模型:
如果Gram<0.5则菌落是革兰氏阴性 (14)
如果Gram>0.5则菌落是革兰氏阳性 (15)
其中Gram是分数,参数ap和b是保存于单元14的预定义系数且优选取决于培养基。关系(13)的预测模型以与前述类似的方式通过线性回归学习。图9阐述了预测的革兰氏,作为就CPSE培养基观察的Gram的函数。对于后者,相关程度是95%。图10阐述了系数ap。这里应注意,预测模型使用预测模型中的2个主要波长范围,即415nm-440nm范围、更特别是421nm-436nm范围,和750nm-800nm范围。因而观察到750nm-800nm范围也包括涉及细菌革兰氏类型的区分光谱信息。
根据第二变化,决定变量是多通道且也是多像素的,使用菌落的各像速的光谱信息,且如前所述未取平均值。与术语“平均”相反,像素相关的光谱信息以术语“个体”指示。特别地,决定变量Xcol(λ)由所有以下个体光谱组成:反射(标准化或未标准化),吸光度(标准化或未标准化),在区域Col(λ)中像素的一阶导数或二阶导数。
例如,通过在400nm-900nm范围中考虑标准化的反射光谱{Υi,j(λ)}(i,j)∈Col(λ)(例如将各个体光谱除以其欧几里得范数),单元14在44根据以下关系实施基于两类分类的预测规则(即革兰氏阳性,例如赋予正值,而革兰氏阴性,例如赋予负值):
如果Npos(Gram)>Nneg(Gram),则菌落是革兰氏阳性 (17)
如果Npos(Gram)<Nneg(Gram),则菌落是革兰氏阴性 (18)
其中Gram是维度向量,等于400nm-900nm范围内通道的数目P,Xcol(λ)在此情况中是矩阵,其中的行分别等于标准化的反射个体光谱{Υi,j(λ)}(i,j)∈col(λ),是等于P的预定义列向量,Npos(Gram)是为正的Gram向量的分量数目,Nneg(Gram)是为负的Gram向量的分量数目。保存于单元14的参数和β0优先取决于培养基。基于多数票决的预测能作为根据向量平均值形成的变量,如果此平均值为负,则预测革兰氏阴性,如果此平均值为正,则预测革兰氏阳性。
在第一实例中,关系(14)的预测模型在前述52个菌株的像素基础上学习,根据以下关系解决SVM(支持向量机)类型优化问题:
约束条件为:
其中N是以Υm(λ)表示的用于学习的标准化的反射个体光谱的数目,从1编号到M,qm∈{-1,1},如果第m个光谱与革兰氏阳性菌相关,则qm=1,如果第m个光谱与革兰氏阴性菌相关,则qm=-1,且C是预定义标量。
所述模型在10个革兰氏阴性菌株(大肠杆菌(3株),阴沟肠杆菌,奇异变形杆菌,斯氏普罗威登斯,粘质沙雷氏菌,肺炎克雷伯菌,摩氏摩根菌,弗氏柠檬酸杆菌)和10个革兰氏阳性菌株(腐生葡萄球菌,粪肠球菌(2株),无乳链球菌,腐生葡萄球菌(2株),无乳链球菌,屎肠球菌,无乳链球菌)上验证。对于不透明培养基(如CPSO),成功率是100%。对于透明培养基(如CPSE),革兰氏阴性菌的成功率接近94%,革兰氏阳性菌的成功率接近98%。如图10所示,显示向量的分量作为通道的函数,基于SVM分类的预测不允许出现特定波长范围。
在第二实例中,关系(14)的预测模型通过根据以下关系解决“FusedLasso”类型优化问题在前述52个菌株的像素基础上学习:
其中μ1和μ2是分别调节模型精简(即不为零的分量数目)和模型规律性(即2个连续分量之间的变异性)的2个参数。如图12可见,当在学习(μ1=0.0001和μ2=0.0025)期间强制精简和规律性时,自动保留的的非零分量是范围为415nm-440nm和750nm-800nm的那些。不透明培养基(如CPSO)的成功率是100%,对于透明培养基(如CPSE),革兰氏阳性的成功率是92%且革兰氏阴性的成功率是84%。
描述了通过400nm-900nm范围内的高光谱相机进行获取。显然,本发明也应用于通过多光谱相机进行的获取,这需要2个分开范围内的光谱,分别包括415nm-440nm和750nm-800nm范围或由其组成。同样,本发明应用配置为分别获取这些范围的2个不同相机。
描述了在比415nm-440nm更宽的范围中获取,尤其是750nm-800nm范围内获取,这包括区分细菌革兰氏类型的光谱信息。作为一个变化,获取仅在400nm-500nm范围内进行,更优选415nm-440nm范围进行,预测革兰氏类型仅根据来自此范围的光谱信息进行。显然,本发明应用于含415nm-440nm范围的任何获取范围,联合仅在此范围内进行的处理以预测革兰氏类型。
描述了图像获取,即获取空间和光谱信息。很明显,本发明也应用于仅获取光谱信息,例如通过显微光谱学方式。例如,菌落可通过标准成像系统或操作员事先定位,随后,由菌落发射的反射或透射光谱通过显微光谱学获取并处理以预测革兰氏类型。
描述了2种培养基,即CPSE(透明)和CPSO(不透明)。测试了其它培养基,产生类似结果。例如,图13A和13B中,在TSA(胰蛋白胨大豆琼脂)和MH2(米勒海顿2琼脂)培养基上观察到革兰氏阳性与革兰氏阴性至少在415nm-440nm范围上彼此不同。如前所述,优选不透明培养基,因为其有利于预测革兰氏类型。本发明因而适用于任何类型的透明和未着色培养基,如本领域的那些,其中加入遮光剂如SiO2颗粒。
描述了多种预测(阈值化、线性模型、SVM、Lasso)。当然,本发明适用于任何处理类型,所述处理使得以两类(革兰氏阳性与革兰氏阴性)分类测量成为可能,例如光谱比较算法(如重心法)、基于神经元网络的分类、基于树的分类(如CART,用于“分类和回归树”,算法)等。例如,这类方法是描述于Eric Laloum,“Une method chimiométrique originaled’identification de produits par spectroscopie proche infrarouge”[“通过近红外光谱鉴定产物的原始化学计量学方法(An original chemometric method foridentifying products by near infrared spectroscopy)”],Spectra Analyse,第33卷,第237期,2004年中所述的那些。
描述了基于反射光谱的实施方案。作为一种变化,获取透射光谱,如前所述进行处理操作以预测革兰氏类型应用。
Claims (20)
1.细菌菌株革兰氏类型的检测,所述检测包括:
-在415nm-440nm波长范围照射在所述范围内具有天然电磁响应的所述菌株的至少一个细菌;
-在415nm-440nm范围获取由所述受照射的细菌反射或经过其透射的光强度;和
-根据在415nm-440nm范围所获取的光强度确定细菌菌株的革兰氏类型。
2.权利要求1所述的细菌菌株革兰氏类型的检测,其中所述细菌还在750nm-800nm波长范围内具有天然电磁响应,其中:
-也在750nm-800nm波长范围照射所述细菌;
-也在750nm-800nm范围获取由受照射的细菌反射或经过其透射的光强度;和
-根据在所述415nm-440nm和750nm-800nm范围所获取的光强度确定细菌菌株的革兰氏类型。
3.权利要求1或2所述的检测,其中所述确定革兰氏类型包括:
-根据所获取的光强度计算所述受照射的细菌的反射或吸收因数;
-根据所计算的反射或吸收因数确定革兰氏类型。
4.权利要求3所述的检测,其中所述确定革兰氏类型包括:
-计算所计算的反射或吸收因数的波长的一阶导数;
-根据所计算的一阶导数确定革兰氏类型。
5.权利要求1所述的检测,其中所述确定革兰氏类型根据415nm-440nm范围的单一波长处的光强度进行。
6.权利要求5所述的检测,其中所述确定革兰氏类型根据波长420nm处的光强度进行。
7.权利要求5或6所述的检测,其中所述确定革兰氏类型包括:
-将等于在420nm处光强度的值或从中计算的值与第一预定阈值和第二预定阈值比较,所述阈值区分革兰氏阳性染色和革兰氏阴性染色,所述第一阈值大于第二阈值;
-如果所述值高于第一阈值,则确定为革兰氏阴性,如果所述值低于第二阈值,则确定为革兰氏阳性。
8.权利要求1所述的检测,其中所述确定革兰氏类型包括应用预定的线性预测,然后是所应用线性预测的结果的阈值化,所述预测将所获取的光强度或从中计算的值与革兰氏类型关联。
9.权利要求1所述的检测,其中所述确定革兰氏类型包括将二类分类的SVM类型应用于所获取的光强度或从中计算的值。
10.权利要求1所述的检测,其中所述照射和获取直接在包含细菌菌株的菌落和所述菌落生长的营养培养基的样品上进行。
11.权利要求10所述的检测,其中所述确定革兰氏类型根据所述营养培养基进行。
12.权利要求10或11所述的检测,其中所述营养培养基是菌落在其表面生长的不透明基材。
13.权利要求12所述的检测,其中所述基材具有的反射率ρ小于或等于10%。
14.权利要求13所述的检测,其中所述基材具有的反射率ρ小于或等于5%。
15.权利要求1所述的检测,其中所述获取光强度包括获取所述菌株的细菌的菌落的高光谱或多光谱图像,且其中所述光强度根据对应于所述菌落的所述图像的至少一个像素来确定。
16.权利要求15所述的检测,其中所述光强度等于对应于所述菌落的所述图像的平均像素。
17.一种用于检测细菌菌株革兰氏类型的系统,所述系统包括:
-照明设备,配置成在415nm-440nm波长范围照射所述菌株的至少一个细菌;
-传感器,配置成在415nm-440nm范围获取由所述受照射的细菌反射或经过其透射的光强度;和
-计算机单元,配置成根据在415nm-440nm范围所获取的光强度确定所述细菌菌株的革兰氏类型。
18.权利要求17所述的系统,其中:
-所述照明设备配置成在750nm-800nm波长范围照射所述细菌;
-所述传感器配置成在750nm-800nm范围获取由所述受照射的细菌反射或经过其透射的光强度;和
-所述计算机单元配置成根据在所述415nm-440nm和750nm-800nm范围所获取的光强度确定所述细菌菌株的革兰氏类型。
19.权利要求17或18所述的系统,其配置成照射包含所述菌株细菌菌落和其中生长所述菌落的营养培养基的样品,以及获取其图像。
20.权利要求17或18所述的系统,其配置成照射包含所述菌株细菌菌落和其中生长所述菌落的营养培养基的皮氏培养皿,以及获取其图像。
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