JP2019522970A - 細菌のグラムタイプを特定するためのプロセス及びシステム - Google Patents
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Abstract
Description
第2のタイプの技法は、細菌細胞膜のペプチドグリカンによって開始される酵素反応によって分解する基質の存在下に細菌を配置することからなる。この反応は、その濃度がグラムの指標となる、発色団又はフルオロフォアを生成する。細菌の発色性又は蛍光性「染色」という用語は、通常使用されている。このタイプの先行技術は、適切なデバイス(例えば分光計/蛍光光度計)を使用して、例えば発色団/フルオロフォアの光強度を測定することによって、及び、その後、コンピュータープログラムを使用して、測定された強度をあらかじめ定義された閾値と比較することによって、自動化することができるが、それでもなお、それらは、高価であることが多い、特定の発色団又は蛍光発生基質の設計を必然的に伴う。
− 415nm〜440nmの波長範囲で、該範囲において自然電磁応答を有する前記株の少なくとも1つの細菌を照明すること;
− 415nm〜440nmの範囲で、前記照明された細菌によって反射される又は該細菌を透過する光強度を取得すること;及び
− 415nm〜440nmの範囲で取得された光強度の関数として細菌株のグラムタイプを決定すること
を含む、細菌株のグラムタイプを検出するためのプロセスである。
− 該細菌の照明もまた750nm〜800nmの波長範囲で行われ;
− 照明された細菌によって反射される又は該細菌を透過する光強度の取得もまた、750nm〜800nmの範囲で行われ;かつ
− 細菌株のグラムタイプの決定は、415nm〜440nm及び750nm〜800nmの範囲で取得した光強度の関数として行われる。
− 取得した光強度の関数としての前記照明された細菌の反射率又は吸収係数の計算
− 計算された反射率又は吸収係数の関数としてのグラムタイプの決定
を含む。
− 計算された反射率又は吸収係数の波長での一次導関数の計算;
− 計算された一次導関数の関数としてのグラムタイプの決定
を含む。
− 420nmにおける光強度に等しい値、又はそれから計算された値を、所定の第1の閾値及び所定の第2の閾値と比較し、グラム陰性染色からグラム陽性染色を分離することであって、第1の閾値が第2の閾値よりも大きく;
− 前記値が第1の閾値を上回る場合にグラム陰性と決定し、前記値が第2の閾値を下回る場合にグラム陽性と決定すること
を含む。
− 415nm〜440nmの波長範囲で、株の少なくとも1つの細菌を照明するように構成された照明;
− 415nm〜440nmの範囲で、前記照明された細菌によって反射される又は該細菌を透過する光強度を取得するように構成されたセンサ;及び
− 415nm〜440nmの範囲で取得された光強度の関数として細菌株のグラムタイプを決定するように構成されたコンピュータユニット
を含む、細菌株のグラムタイプを検出するためのシステムである。
− 照明は、750nm〜800nmの波長範囲で前記細菌を照明するように構成されており;
− センサは、750nm〜800nmの波長範囲で、前記照明された細菌によって反射される又は該細菌を透過する光強度を取得するように構成されており;かつ
− 前記コンピュータユニットは、415nm〜440nm及び750nm〜800nmの範囲で取得した光強度の関数として細菌株のグラムタイプを決定するように構成されている。
− ハイパースペクトル画像の取得のためのデバイス12;及び
− デバイス12を制御するため、かつ、該デバイス12によって取得された画像を受信し処理するために、デバイス12に接続(例えば有線又は無線リンクによって)された、データ処理コンピュータユニット14
を含む。
− 波長範囲[λmin;λmax]=[400;900]ナノメートルに感受性のCCD又はCMOSタイプのデジタルセンサなどの基本的センサのネットワークを含むデジタルセンサと、光散乱素子又は該センサによって取得される波長を選択するためのスペクトログラフとからなる、「ハイパースペクトル」カメラ18;
− カメラ18のデジタルセンサに、そのハイパースペクトル画像を取得することが望ましいペトリ皿22の光学像を集束させるための対物レンズ20;
− 例えば、ペトリ皿22の均一な前面照明を生成するために、範囲[λmin;λmax]で発光可能な、例えば2つ又は4つのランプなど1つ以上のアロジェニックなランプからなる、前面照明24。例えば、照明は白色ランプである;
− 範囲[λmin;λmax]でペトリ皿22の均一な背面照明を生成するために、例えば白色LEDマトリクスからなる、背面照明26;及び
− ペトリ皿22を着座させ、走査することによってペトリ皿22の全体画像を得るために、該ペトリ皿22が対物レンズ20の前を通過することを可能にする、キャリッジ28
を含む。
式中、Δλはスペクトル分解能であり、pは、
に属する正の整数である。取得波長λmin+p×Δλは、通常、用語「チャネル」で表される。
a.それ自体知られている方法でのカメラ18のセンサのノイズ、特にそのオフセット、その空間ノイズ等の補正;
b.例えば、ピクセルが有することができる最大値の例えば3分の2以上(すなわち、8ビットで符号化された、0〜255のピクセルの場合には、170以上)など、所定の閾値を上回る値を有するピクセルを排除するために行われる閾値化など、寄生、特に鏡面反射性の、HSI画像に「過度に明るい点」を形成する反射の処理;
c.細菌のタイプ及び使用される寒天のタイプによって変動しない波長で反射された光強度でHSI画像を除算することによって、照明の変動などの外部変動によって生じる画像の変動の低減を可能にする、ラジオメトリック処理;
d.幾つかのHSI画像が取得された場合に、異常なピクセル値を検索及び除去し、及び/又は、取得された画像を平均化すること。
式中、γ(λ)は反射率の画像であり、Wは、照明24、26を照射された、高反射率の中性物体、例えば90%を超える均一な反射率のシート(例えば、「白色」シート又は10%未満のグレーチャートを有するもの)の、ユニット14に保存されたハイパースペクトル画像であり、Bは、低反射率の中性物体、例えば対物レンズ20を遮蔽する黒色のカバーの画像の、ユニット14に保存されたハイパースペクトル画像であり、m(λmin+p×Δλ)=1であるか、又はマトリクスW(λmin+p×Δλ)−B(λmin+p×Δλ)の平均に等しい。
i.例えば、ベール−ランベルト変換(関係(4))又はクベルカ−ムンク変換(関係(5))による、吸光度画像A(λ)。理論に縛られることなく、本発明者らの意見では、グラム陰性細菌は、[415〜440]nmの範囲の吸収剤であるチトクロームの含量がより高い点でグラム陽性細菌と異なり、吸光度画像への変換を特徴付け可能にする:
ii.光学効果による変動を低減するために正規化された反射率画像γ(λ)又は正規化された吸光度画像A(λ)。ユニットは、例えば、面積正規化、単位ベクトル正規化、平均正規化、最大正規化、範囲正規化、又はピーク正規化を実行する。これらの正規化は、例えば、文献K. Varmuza and P. Filzmoser, “Introduction to Multivariate Statistical Analysis in Chemometrics”, CRC Press, 2009及び文献A. Rinnan, F. van den Berg and S. Engelsen, “Review of the most common pre-processing techniques for near-infrared spectra”, Trends in Analytical Chemistry, vol. 28, No. 10, 2009に記載されている;
iii.スペクトルの挙動の変化を強調し、かつ、ベースラインを低減するために、正規化又は非正規化された反射率画像γ(λ)若しくは正規化又は非正規化された吸光度画像A(λ)の波長の一次導関数
又は、二次導関数
。好ましくは、多項式局所フィルタリングアルゴリズムは、エラー伝播を低減するために使用され、有利には、文献A. Savitzky and M.J.E. Golay “Smoothing and differentiation of data by simplified least squares procedures”, Anal. Chem., vol. 36, pp.1627-1639, 1964に記載されるアルゴリズムである。
第1の変形では、単一変数及びシングルチャネルアプローチがユニット14で実行される。この手法によれば、決定変数Xcol(λ)は、例えば、コロニーの(正規化又は非正規化された)反射率、又はコロニーの(正規化又は非正規化された)吸光度、又はそれらの一次導関数又は二次導関数など、415nm〜440nmの波長範囲のあらかじめ定義された波長λcをとる単一の値になる。
式中、Ncolは、ゾーンCol(λ)のピクセルの数である。よって、決定変数Xcol(λ)はγcol(λc)に等しい。ユニット14はまた、波長λcにおけるコロニーの測定の誤差、特に、ピクセルゾーンCol(λ)に属するピクセルのすべての値γi,j(λc)の「SD」で示される標準偏差も計算する。
式中、
及び
は、培養培地に優先的に依存し、ユニット14に保存される、2つのあらかじめ定義された閾値である。変形として、測定誤差SDとしてゼロを選択することができる。
− グラム陰性:大腸菌(1)、クレブシエラ・ニューモニエ(1)、クレブシエラ・オキシトカ(Klebsiella oxytoca)(1)、プロテウス・ミラビリス(1)、モルガネラ−モルガニイ(1)、ステノトロホモナス・マルトフィリア(Stenotrophomonas maltophilia)(1)、アシネトバクター・バウマニ(Acinetobacter baumanii)(1)、エンテロバクター・クロアカ(1)、セラチア・マルセッセンス(1)、シトロバクター・コセリ(Citrobacter koseri)(1)、エンテロバクター・アエロゲネス(Enterobacter aerogenes)(1)、モラクセラ・カタラーリス(Moraxella catarrhalis)(1)、ハフニア・アルベイ(Hafnia alvei)(1)、緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)(1)、インフルエンザ菌(Haemophilus influenzae)(1);
− グラム陽性:コリネバクテリウム・ジェイケイウム(Corynebacterium jeikeium)(1)、コリネバクテリウム・アミコラツム(Corynebacterium amycolatum)(1)、エンテロコッカス・フェカーリス(1)、エンテロコッカス・フェシウム(1)、黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)(1)、表皮ブドウ球菌(Staphylococcus epidermidis)(1)、スタフィロコッカス・ヘモリチカス(Staphylococcus haemolyticus)(1)、スタフィロコッカス・ホミニス(Staphylococcus hominis)(1)、肺炎連鎖球菌(Streptococcus pneumoniae)(1)、B群溶血性連鎖球菌(1)、化膿連鎖球菌(Streptococcus pyogenes)(1)、ストレプトコッカス・アンギノサス(Streptococcus anginosus)(1)、ストレプトコッカス・ビリダンス(Streptococcus viridans)(1)。
が決定される。同様に、グラム陰性株の値λにおけるスペクトルの最大値
が決定される。よって、培養培地で保持されるチャネルλcは、範囲
を最大化するものであり、該培地で保持されるあらかじめ定義された閾値は、それぞれ、値
及び
である。CPSE培地では、10種のグラム陽性株及び9種のグラム陽性株を含む、上に列挙したものと同一の19の株種のグラムタイプを、90%に近い成功率で予測した。CPSO培地では、これらの同一の株の成功は100%である。
を計算する。よって、決定変数Xcol(λ)は、
に等しい。44において、ユニット14は、例えば、次の関係に従って判別する線形モデルなどの予測モデルを上記変数に適用する:
式中、グラムはスコアであり、パラメータa及びbは、ユニット14に保存され、かつ、培養培地に優先的に依存する、あらかじめ定義された係数である。
− グラム陰性:大腸菌(9)、クレブシエラ・ニューモニエ(Klebsiella pneumoniae)(3)、エンテロバクター・クロアカ(1)、セラチア・マルセッセンス(2)、シトロバクター・フロインディー(2)、プロテウス・ミラビリス(2)、プロビデンシア・スチュアーティイ(1)、モルガネラ−モルガニイ(2);
− グラム陽性:スタフィロコッカス・サプロフィティカス(9)、B群溶血性連鎖球菌(7)、エンテロコッカス・フェシウム(3)、エンテロコッカス・フェカーリス(3)、黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)(1)、カンジダ・アルビカンス(Candida albicans)(1)。
この手法によれば、415nm〜440nmの波長範囲の幾つかのチャネルが、有利には、任意選択的に、750nm〜800nmの範囲のチャネルと組み合わせて使用される。決定変数Xcol(λ)は、例えば、400nm〜900nmの範囲全体にわたる、平均スペクトル反射率(正規化又は非正規化された)、吸光度(正規化又は非正規化された)、一次導関数又は二次導関数である。
を計算し、この導関数は、決定変数Xcol(λ)を構成する。44において、ユニット14は、例えば、次の関係に従う線形モデルなどの予測モデルを上記変数に適用する:
式中、グラムはスコアであり、パラメータap及びbは、ユニット14に保存され、かつ、培養培地に優先的に依存する、あらかじめ定義された係数である。関係(13)についての予測モデルは、線形回帰によって、上述のものと同様の方式で学習される。図9は、CPSE培地について観察されたグラムの関数としての予測されたグラムを示している。観察されたグラムについては、相関の程度は95%である。図10は、係数apを示している。本明細書では、予測モデルは、該予測モデルの2つの原則的な波長範囲、すなわち、415nm〜440nmの範囲、より詳細には421nm〜436nmの範囲、及び750nm〜800nmの範囲を使用することに留意されたい。よって、750nm〜800nmの範囲はまた、細菌のグラムタイプに関する特徴的なスペクトル情報も含むことが観察される。
を考慮することにより、(例えば、各個別のスペクトルをそのユークリッド・ノルムで除算することにより)、ユニット14は、44において、次の関係に従って、2クラス分類に基づいた予測規則(すなわち、例えば陽性の値に割り当てられる、グラム陽性、及び、例えば陰性の値に割り当てられる、グラム陰性)を実行する:
式中、グラムは、400nm〜900nmの範囲のチャネルの数Pに等しい次元ベクトルであり、Xcol(λ)は、この場合、反射率
の正規化個別スペクトルにそれぞれ等しい行列であり、
は、Pに等しい、次元のあらかじめ定義された列ベクトルであり、Npos(グラム)は、正のグラムベクトルの成分の数であり、Nneg(グラム)は、負のグラムベクトルの成分の数である。ユニット14に保存されるパラメータ
及びβ0は、培養培地に優先的に依存する。予測は、多数決に基づいて、変形として、ベクトル
の平均について行うことができ、この平均が負の場合にグラム陰性が予測され、この平均が正の場合にグラム陽性が予測される。
該式は、次の制約を受ける:
式中、Nは反射率の正規化された個別スペクトルの数であり、γm(λ)で示され、学習に用いられ、1からMまで番号が付され、
において、m番目のスペクトルがグラム陽性細菌に関連付けられている場合、qm=1であり、m番目のスペクトルがグラム陰性細菌に関連付けられている場合、qm=−1であり、Cは、あらかじめ定義されたスカラーである。
の成分を示す図10から分かるように、SVM分類に基づく予測は、特定の範囲の波長を出現させない。
式中、μ1及びμ2は、それぞれ、モデルの節約(すなわち、0ではない、
の成分の数)及びモデルの規則性(すなわち、
の2つの連続成分間のばらつき)を規制する、2つのパラメータである。図12に見られるように、節約及び規則性が
の学習中に強制される場合(μ1=0.0001及びμ2=0.0025)、自動的に保持される
の非ゼロ成分は、415nm〜440nm及び750nm〜800nmの範囲のものである。成功率は、不透明培地(例えばCPSO)については100%であり、透明培地(例えばCPSE)については、成功率は、グラム陽性では92%であり、グラム陰性では84%である。
Claims (16)
- 細菌株のグラムタイプの検出であって、
− 415nm〜440nmの波長範囲で、該範囲において自然電磁応答を有する該株の少なくとも1つの細菌を照明すること;
− 415nm〜440nmの範囲で、該照明された細菌によって反射される又は該細菌を透過する光強度を取得すること;及び
− 415nm〜440nmの範囲で取得した光強度の関数として細菌株のグラムタイプを決定すること
を含む、検出。 - 前記細菌が、750nm〜800nmの波長範囲における自然電磁応答も有し、かつ、
− 前記細菌の照明もまた750nm〜800nmの波長範囲で行われ;
− 照明された細菌によって反射される又は該細菌を透過する光強度の取得もまた、750nm〜800nmの範囲で行われ;かつ
− 細菌株のグラムタイプの決定が、前記415nm〜440nm及び750nm〜800nmの範囲で取得した光強度の関数として行われる、
請求項1に記載の細菌株のグラムタイプの検出。 - 前記グラムタイプの決定が、
− 取得した光強度の関数として前記照明された細菌の反射率又は吸収係数を計算すること;
− 計算された反射率又は吸収係数の関数としてグラムタイプを決定すること
を含む、請求項1又は2に記載の検出。 - 前記グラムタイプの決定が、
− 計算された反射率又は吸収係数の波長における一次導関数を計算すること;
− 計算された一次導関数の関数としてグラムタイプを決定すること
を含む、請求項3に記載の検出。 - 前記グラムタイプの決定が、415nm〜440nmの範囲の単一波長、特に420nmの波長における光強度の関数として行われる、請求項1から4の何れか一項に記載の検出。
- 前記グラムタイプの決定が、
− 420nmにおける光強度に等しい値、又はそれから計算された値と、第1の所定の閾値及び第2の所定の閾値とを比較して、グラム陰性染色からグラム陽性染色を分離することであって、第1の閾値が第2の閾値よりも大きく;
− 前記値が第1の閾値を上回る場合にグラム陰性と決定し、前記値が第2の閾値を下回る場合にグラム陽性と決定すること
を含む、請求項5に記載の検出。 - 前記グラムタイプの決定が、取得した光強度、又はそれから計算された値を関連する、所定の線形予測をグラムタイプに適用し、その後、適用された線形予測の結果を閾値化することを含む、請求項1から4の何れか一項に記載の検出。
- 前記グラムタイプの決定が、取得した光強度、又はそれから計算された値にSVMタイプの2クラス分類を適用することを含む、請求項1から4の何れか一項に記載の検出。
- 前記照明すること及び前記取得することが、細菌株のコロニーと該株が成長した栄養培地とを含むサンプルに対して直接行われる、請求項1から8の何れか一項に記載の検出。
- 前記グラムタイプの決定が、前記栄養培地の関数として行われる、請求項9に記載の検出。
- 前記栄養培地が、その表面でコロニーが成長した不透明の基質であり、該基質が、好ましくは、10%以下、好ましくは5%以下の反射率ρを有する、請求項9又は10に記載の検出。
- 前記光強度を取得することが、株の細菌のコロニーのハイパースペクトル又はマルチスペクトル画像を取得することを含み、該光強度が、コロニーに対応する前記画像の少なくとも1つのピクセルの関数として決定される、請求項1から11の何れか一項に記載の検出。
- 前記光強度がコロニーに対応する前記画像の平均ピクセルに等しい、請求項12に記載の検出。
- 細菌株のグラムタイプを検出するためのシステムであって、
− 415nm〜440nmの波長範囲で、該株の少なくとも1つの細菌を照明するように構成された照明;
− 415nm〜440nmの範囲で、前記照明された細菌によって反射される又は該細菌を透過する光強度を取得するように構成されたセンサ;及び
− 415nm〜440nmの範囲で取得された光強度の関数として細菌株のグラムタイプを決定するように構成されたコンピュータユニット
を含む、システム。 - − 前記照明が、750nm〜800nmの波長範囲で前記細菌を照明するように構成されており;
− 前記センサが、750nm〜800nmの波長範囲で、前記照明された細菌によって反射される又は該細菌を透過する光強度を取得するように構成されており;かつ
− 前記コンピュータユニットが、前記415nm〜440nm及び750nm〜800nmの範囲で取得した光強度の関数として細菌株のグラムタイプを決定するように構成されている、
請求項14に記載のシステム。 - 前記株の細菌のコロニー及び前記コロニーが成長した栄養培地、特にペトリ皿を含むサンプルを照明し、その画像を取得するように構成されている、請求項14又は15に記載のシステム。
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