CN109415750A - 活化的梭菌神经毒素的生产 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种生产基本上不含未活化产物的活化梭菌神经毒素的方法，包含这种活化梭菌神经毒素的组合物及其在治疗中的用途。

Description

活化的梭菌神经毒素的生产
技术领域
本发明涉及一种生产基本上不含未活化产物的活化的梭菌神经毒素的方法，包含这种梭菌神经毒素的组合物及其在治疗中的用途。
背景
梭状芽孢杆菌(Clostridia)属细菌产生高度有效且特异性的蛋白质毒素，其可以毒害神经元和它们被递送到的其他细胞。此类梭菌毒素的实例包括由破伤风梭菌(TeNT)和肉毒梭菌(C.botulinum)(BoNT)血清型A-G产生的神经毒素，以及由巴氏梭菌(C.baratii)和丁酸梭菌(C.butyricum)产生的神经毒素。
梭菌神经毒素中已知有一些最有效的毒素。举例来说，取决于血清型，肉毒杆菌(botulinum)神经毒素对于小鼠的半数致死剂量(LD50)值为0.5至5ng/kg。破伤风和肉毒杆菌毒素都通过抑制受影响的神经元的功能，特别是神经递质的释放起作用。虽然肉毒杆菌毒素作用于神经肌肉接点并抑制外周神经系统中的胆碱能传递，但破伤风毒素在中枢神经系统中起作用。
在自然界中，梭菌神经毒素被合成为单链多肽，其被蛋白水解切割事件翻译后修饰以形成通过二硫键连接在一起的两条多肽链。切割发生在特定的切割位点，该位点通常称为位于提供链间二硫键的半胱氨酸残基之间的激活位点。正是这种双链形式是神经毒素的最具活性形式。这两条链被称为重链(H链)，其具有约100kDa的分子量，和轻链(L链)，其具有约50kDa的分子量。H链包含N-端易位组分(HN结构域)和C-端靶向组分(HC结构域)。切割位点位于L-链和易位结构域组分之间。在HC结构域与其靶神经元结合并通过内体将结合的毒素内化入细胞后，HN结构域将L链易位穿过内体膜并进入胞质溶胶，并且L-链提供蛋白酶功能(也称为非细胞毒性蛋白酶)。
非细胞毒性蛋白酶通过蛋白水解切割称为SNARE蛋白的细胞内转运蛋白(例如SNAP-25、VAMP或Syntaxin)来起作用-参见Gerald K(2002)“Cell and MolecularBiology”(第4版)John Wiley&Sons，Inc。首字母缩写词SNARE来源于术语Soluble NSFAttachment Receptor，其中NSF是指N-乙基马来酰亚胺敏感因子(N-Ethylmaleimide-Sensitive Factor)。SNARE蛋白与细胞内囊泡融合所必需的，因此是通过囊泡转运从细胞中分泌分子所必需的。蛋白酶功能是锌依赖性内肽酶活性并且对SNARE蛋白表现出高底物特异性。因此，一旦递送至期望的靶细胞，非细胞毒性蛋白酶能够抑制来自靶细胞的细胞分泌。梭菌神经毒素的L链蛋白酶是切割SNARE蛋白的非细胞毒性蛋白酶。
鉴于SNARE蛋白质的普遍性质，梭菌神经毒素如肉毒杆菌毒素已成功用于各种疗法中。
举例来说，我们提及William J.Lipham,Cosmetic and Clinical Applicationsof Botulinum Toxin(Slack,Inc.,2004)，其描述了使用梭菌神经毒素如肉毒杆菌神经毒素(BoNT)，BoNT/A，BoNT/B，BoNT/C1，BoNT/D，BoNT/E，BoNT/F和BoNT/G以及破伤风神经毒素(TeNT)，以在许多治疗和化妆或美容应用中抑制神经元传导-例如市售肉毒杆菌毒素产品目前被批准为用于适应证的治疗，所述适应证包括局灶性痉挛状态、上肢痉挛状态、下肢痉挛状态、颈部张力障碍、眼睑痉挛、半面痉挛、腋部多汗症、慢性偏头痛、神经性逼尿肌过度活动、眉间纹和严重外眦线。另外，描述了梭菌神经毒素疗法用于治疗神经肌肉病症(参见US 6,872,397)；用于治疗子宫病症(参见US 2004/0175399)；用于治疗溃疡和胃食管反流疾病(参见US 2004/0086531)；用于治疗张力障碍(参见US 6,319,505)；用于治疗眼睛病症(参见US 2004/0234532)；用于治疗眼睑痉挛(参见US 2004/0151740)；用于治疗斜视(参见US 2004/0126396)；用于治疗疼痛(参见US 6,869,610，US 6,641,820，US 6,464,986和US6,113,915)；用于治疗纤维肌痛(参见US 6,623,742，US 2004/0062776)；用于治疗腰痛(参见US 2004/0037852)；用于治疗肌肉损伤(参见US 6,423,319)；用于治疗窦性头痛(参见US6,838,434)；用于治疗紧张性头痛(参见US 6,776,992)；用于治疗头痛(参见US 6,458,365)；用于减轻偏头痛性头痛(参见US 5,714,469)；用于治疗心血管疾病(参见US 6,767,544)；用于治疗神经障碍例如帕金森病(参见US 6,620,415，US 6,306,403)；用于治疗神经精神障碍(参见US 2004/0180061，US 2003/0211121)；用于治疗内分泌失调(参见US 6,827,931)；用于治疗甲状腺病症(参见US 6,740,321)；用于治疗受胆碱能影响的汗腺病症(参见US 6,683,049)；用于治疗糖尿病(参见US 6,337,075，US 6,416,765)；用于治疗胰腺病症(参见US 6,261,572，US 6,143,306)；用于治疗癌症例如骨肿瘤(参见US 6,565,870，US 6,368,605，US 6,139,845，US 2005/0031648)；用于治疗耳部病症(参见US 6,358,926，US 6,265,379)；用于治疗自主神经障碍如胃肠肌肉障碍和其他平滑肌功能障碍(参见US5,437,291)；用于治疗与皮肤细胞增殖性病症相关的皮肤损伤(参见US 5,670,484)；用于治疗神经源性炎性病症(参见US 6,063,768)；用于减少脱发和刺激毛发生长(参见US 6,299,893)；用于治疗下行口(参见US 6,358,917)；用于减少食欲(参见US 2004/40253274)；用于牙科治疗和程序(参见US 2004/0115139)；用于治疗神经肌肉障碍和病症(参见US2002/0010138)；用于治疗各种病症和状况以及相关的疼痛(参见US 2004/0013692)；用于治疗由粘液高分泌导致的病症，如哮喘和COPD(参见WO 00/10598)；和用于治疗非神经元病症如炎症，内分泌疾病，外分泌疾病，免疫病症，心血管疾病，骨骼病症(参见WO 01/21213)。所有上述出版物均通过引用整体并入本文。
预计非细胞毒性蛋白酶如梭菌神经毒素(例如BoNT和TeNT)在人类和其他哺乳动物的治疗和美容治疗中的应用将扩大到可受益于这些毒素的性质的不断扩大的疾病和病痛范围。
传统上，肉毒梭菌神经毒素的产生是通过肉毒梭菌细菌培养，然后通过梭菌神经毒素复合物的分离和纯化来进行。然而，肉毒梭菌是孢子形成细菌，因此需要专门的培养设备和设施，这些设备和设施不是培养细菌如大肠杆菌(E.coli)所必需的。因此，越来越多的梭菌神经毒素使用导致需要用于生产和纯化梭菌神经毒素的替代和/或改进方法。
梭菌神经毒素最初表达为单链多肽。为了完全活化，单链形式必须转化为双链形式，这需要定位在轻链和重链之间的位点处的蛋白水解切割(“活化环”)。梭菌神经毒素的体外活化可以通过添加合适的蛋白酶来实现。然而，本领域中反复出现的问题是，在实现完全活化之前，在活化环外部的位点经常发生不需要的蛋白水解活性，导致不希望的“截短的”(或“过度活化的”)产物的形成。当活化的双链梭菌神经毒素意图用作药物产品时，这种产品的形成特别成问题，因为需要高纯度和功能性的制品。
公布的该问题的解决方案需要某种形式的BoNT氨基酸序列的序列修饰；实例包括在活化环内特异性蛋白酶识别位点的插入，从而改变其序列。
例如，WO0114570描述了编码BoNT蛋白的重组核酸分子。然而，修饰WO0114570的核酸分子以用非天然切割位点替换天然切割位点。因此，WO0114570的方法还教导了最佳BoNT表达所需要的非天然切割位点的插入。
US20080103098描述了用于产生双链形式的重组BoNT蛋白的方法，包括在大肠杆菌宿主细胞中表达重组核酸构建体。然而，所述方法需要将特异的非天然(即非梭菌)五肽序列插入神经毒素的环结构域中。插入的五肽序列形成活化切割位点，其在细胞裂解时被内源性大肠杆菌蛋白酶切割。因此，US20080103098的方法教导了为了实现最佳的BoNT表达，必须通过非天然切割位点的插入来修饰BoNT序列。
WO2010094463描述了一种从未加工或部分加工的BoNT中分离加工的BoNT的方法，该方法需要针对蛋白水解未加工和/或部分加工的BoNT的抗体的使用。
WO2012020057中描述的另一种方法基于修饰的接头的插入，其赋予轻链和重链之间的物理化学性质，该接头侧翼为蛋白酶切割位点。接头的物理化学性质例如是必须允许将部分加工或未加工的BoNT与加工的(活化的)BoNT分离。
因此，本领域需要生产基本上纯的生物活性的全长活化的梭菌神经毒素制品的方法，该制品不依赖于外源序列的插入。本发明通过提供权利要求中所述的新方法解决了这个问题，该方法避免了修饰梭菌神经毒素氨基酸序列或使用纯化标签的要求。
发明概述
根据第一方面，本发明提供了一种产生活化的梭菌神经毒素的方法，包括使单链梭菌神经毒素与活化酶接触，直至至少90％的单链梭菌神经毒素多肽转化为双链形式。
在第二方面，本发明提供了通过根据本发明的方法获得的活性双链梭菌神经毒素。
在第三方面，本发明提供了药物组合物，包含根据本发明的活性双链梭菌神经毒素，其基本上不含单链梭菌神经毒素。
发明的详细描述
本发明涉及通过反直观的方法制备生物活性的、全长的、基本上纯的梭菌神经毒素制品的方法。
生产基本上纯的梭菌神经毒素制品问题的直观解决方案是调节活化过程的条件，以便形成最少量的截短产物。然而，本发明人已经发现使用这种方法导致一部分梭菌神经毒素保持未切割(未活化)。换句话说，这种方法产生全长活化的、全长未活化的(单链)和截短的梭菌神经毒素产物的混合物。在这方面，重要的是要注意全长未活化和截短的活化产物是不希望的，当活化的双链梭菌神经毒素意图用作药物产品时更是如此。因此，必须在制造过程的后续步骤中除去这些不希望的产物。
本发明人进一步发现，将全长活化的梭菌神经毒素(双链)与全长未活化的梭菌神经毒素(单链)分开是极其困难的。
本发明人惊奇地发现，通过使活化步骤进行到基本上没有残留全长未活化产物的后期阶段，使得在随后的纯化步骤中更容易除去不需要的副产物(过度活化或截短的产物)。
不愿意受理论束缚，假设关于从全长未活化的肉毒杆菌毒素中分离全长活化的肉毒梭菌毒素所遇到的困难是由于全长活化的肉毒杆菌毒素与全长未活化的肉毒杆菌毒素之间的可利用的物理化学差异不足。进一步假设由于产物之间的一级氨基酸序列的变化，与活化的全长梭菌神经毒素相比，不需要的截短的梭菌神经毒素副产物具有更大的物理化学差异。这些更大的物理化学差异可以通过本领域已知的纯化技术，例如柱色谱法来利用，以实现全长活化的梭菌神经毒素的分离，并获得适合用于治疗的基本上纯的产物。
因此，在第一方面，提供了一种生产活化的梭菌神经毒素的方法，包括使单链梭菌神经毒素与活化酶接触，直至超过90％的单链梭菌神经毒素多肽转化为双链形式。
优选地，使单链梭菌神经毒素与活化酶接触，直至超过95％的单链梭菌神经毒素多肽转化为双链形式。更优选地，使单链梭菌神经毒素与活化酶接触，直至超过96％，97％，98％，99％，99.5％，99.9％或100％的单链梭菌神经毒素多肽转化为双链形式。
术语“活性梭菌神经毒素”在本文中是指能够结合靶细胞，内化到所述细胞中并抑制所述细胞中SNARE驱动的神经递质的分泌的梭菌神经毒素。本领域众所周知，当梭菌神经毒素处于双链(或“活化”)形式时，梭菌神经毒素的生物活性水平比单链形式时高得多。因此，具生物活性的梭菌神经毒素优选为双链(或“活化的”)梭菌神经毒素。
术语“活化”在本文中是指将单链梭菌神经毒素多肽转化为双链(或活性)形式。
本文所用的“活化酶”(或“活化蛋白酶”)是指内肽酶，其能够在位于梭菌神经毒素轻链和重链之间的位点处切割单链梭菌神经毒素(在本领域称为“活化环“)，例如以允许完全活性的双链梭菌神经毒素(或“活化的梭菌神经毒素”)的形成。
适用于本发明的活化酶的实例包括半胱氨酸、丝氨酸和金属蛋白酶家族的成员，例如胰蛋白酶，Lys-C，Lys-N和精氨酰内肽酶(内蛋白酶Arg-C，LeR)，以及活性BoNT水解酶，如在EP 2524 963 A1中公开的，其全部内容在此引入作为参考。
在优选的实施方案中，活化酶是胰蛋白酶。
在最优选的实施方案中，活化酶是牛胰蛋白酶。
本发明人确实发现牛胰蛋白酶比其他胰蛋白酶来源(例如猪胰蛋白酶)更适合于激活肉毒杆菌神经毒素。实际上，本发明人发现，与使用猪胰蛋白酶相比，使用牛胰蛋白酶可以实现完全活化，同时出现非常少的不需要的截短产物。
鉴于猪胰蛋白酶氨基酸序列是最常用的重组GMP级胰蛋白酶序列并且似乎是用于此目的的明显胰蛋白酶来源，这对于发明人来说是令人惊讶的发现。确实需要使用GMP级无动物原料来制造预定用于治疗的GMP级梭菌神经毒素。
在优选的实施方案中，活化酶是GMP级酶，例如GMP级胰蛋白酶，更优选GMP级牛胰蛋白酶，更优选还是GMP级重组牛胰蛋白酶。“GMP级”是指按照质量标准制造，并具有适用于GMP(良好生产规范)制造的可追溯性。
在优选的实施方案中，活化酶是牛胰蛋白酶，例如从牛胰腺(TPCK处理的或非TPCK处理的)或重组牛胰蛋白酶获得的天然胰蛋白酶。
根据本发明，牛胰蛋白酶是与SEQ ID NO：1(UniProtKB登录号P00760)具有至少90％，例如至少91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或100％的同一性的蛋白质。
牛胰蛋白酶可以从任何合适的来源获得，并且可商购获自，例如AppliedBiotechnology Institute或者，可以通过重组表达编码与SEQ ID NO：1具有至少90％同一性的蛋白质的氨基酸序列来获得牛胰蛋白酶。
本发明人还发现，牛胰蛋白酶对BoNT/E的活化环的特异性在Ph6-7左右处更高。该结果是出乎意料的，因为胰蛋白酶的性能在本领域中广为人知的是在约pH8时是最佳的。
在一个优选的实施方案中，使单链梭菌神经毒素与牛胰蛋白酶接触的步骤在pH5至7.5之间，优选6至7之间，例如在大约pH6.5下进行。
使单链梭菌神经毒素与活化酶，优选胰蛋白酶接触的步骤优选进行10至50小时，优选15至30小时，例如约15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29或30小时。
使单链梭菌神经毒素与胰蛋白酶接触的步骤优选在室温(或环境温度)下进行。室温通常为16至27℃，优选18至25℃，例如约18，19，20，21，22，23，24或25℃。
胰蛋白酶的浓度通常为每mg梭菌神经毒素0.5至50μg，优选每mg梭菌神经毒素1至20μg，更优选每mg梭菌神经毒素2至10μg，例如每mg梭菌神经毒素约2，3，4，5，6，7，8，9或10μg胰蛋白酶。
胰蛋白酶的浓度可以以USP(美国药典)单位表示，在这种情况下，其通常为每mg梭菌神经毒素1至500USP单位，优选每mg梭菌神经毒素3至100USP单位，更优选每mg梭菌神经毒素5至50USP单位，例如每mg梭菌神经毒素约5，7.5，10，12.5，15，20，25，30，35，40，45或50USP单位的胰蛋白酶。
根据优选的实施方案，使单链梭菌神经毒素与胰蛋白酶接触的步骤在室温下在6至7的pH下进行，其中牛胰蛋白酶浓度为每mg梭菌神经毒素1至20μg，持续时间为15至30小时。
根据另一个优选的实施方案，使单链梭菌神经毒素与胰蛋白酶接触的步骤在室温下在6至7的pH下进行，其中牛胰蛋白酶浓度为每mg梭菌神经毒素3至100USP单位，持续15至30小时。
根据本发明的一个实施方案，该方法还包括去除截短的(过度活化的)梭菌神经毒素，特别是截短的双链梭菌神经毒素的步骤。
术语“截短的双链梭菌神经毒素”(或“不需要的副产物”或“过度活化的梭菌神经毒素”)是指在多于一个位点和/或活化环外部位点处切割单链肉毒杆菌神经毒素产生的产物。
许多不同类型的梭菌神经毒素适用于本发明。因此，在本发明的上下文中，术语“梭菌神经毒素”(或梭菌毒素)包括由肉毒梭菌(C.botulinum)(肉毒杆菌神经毒素血清型A、B、C1、D、E、F和G)、破伤风梭菌(C.tetani)(破伤风神经毒素)、丁酸梭菌(C.butyricum)(肉毒杆菌神经毒素血清型E)和巴氏梭菌(C.baratii)(肉毒杆菌神经毒素血清型F)产生的毒素，以及修饰的梭菌神经毒素或衍生自前述任一种的衍生物。术语“梭菌神经毒素”也包含天然存在的肉毒神经毒素杂合体、镶嵌体和嵌合体。
因此，在一个实施方案中，可以从一种或多种选自肉毒梭菌、破伤风梭菌、巴氏梭菌和丁酸梭菌获得本发明的或用于本发明的梭菌神经毒素。
肉毒杆菌神经毒素(BoNT)由肉毒梭菌以大蛋白复合物的形式产生，其由与许多辅助蛋白复合的BoNT本身组成。目前有七种不同类型的肉毒神经毒素，即：A、B、C1、D、E、F和G型肉毒杆菌神经毒素血清型，它们都具有相似的结构和作用模式。不同的BoNT血清型可基于通过特异性中和抗血清失活而区分，通过血清型的这种分类与氨基酸水平上的百分比序列同一性相关。根据氨基酸百分比序列同一性将给定血清型的BoNT蛋白进一步分成不同的亚型。
适宜地，本发明的或用于本发明的梭菌神经毒素可以是肉毒杆菌神经毒素(BoNT)，优选选自BoNT/A，BoNT/B，BoNT/C1，BoNT/D，BoNT/E，BoNT/F和BoNT/G中的一种或多种。
在一个实施方案中，梭菌神经毒素可以是BoNT/A。参考BoNT/A序列具有UniProtKB登录号P10845(SEQ ID NO：2)。
在另一个实施方案中，梭菌神经毒素可以是BoNT/B。参考BoNT/B序列具有UniProtKB登录号P10844(SEQ ID NO：3)。
在另一个实施方案中，梭菌神经毒素可以是BoNT/C。参考BoNT/C1序列具有UniProtKB登录号P18640(SEQ ID NO：4)。
在另一个实施方案中，梭菌神经毒素可以是BoNT/D。参考BoNT/D序列具有UniProtKB登录号P19321(SEQ ID NO：5)。
在另一个实施方案中，梭菌神经毒素可以是BoNT/E。参考BoNT/E序列具有UniParcI.D UPI00000010A3(SEQ ID NO:6)。
在另一个实施方案中，梭菌神经毒素可以是BoNT/F。参考BoNT/F序列具有UniProtKB登录号YP_001390123(SEQ ID NO：7)。
在另一个实施方案中，梭菌神经毒素可以是BoNT/G。参考BoNT/G序列具有UniProtKB登录号Q60393(SEQ ID NO：8)。
在一个实施方案中，梭菌神经毒素可以是TeNT。参考TeNT序列具有UniProtKB登录号P04958(SEQ ID NO：9)。
在一个实施方案中，本发明的梭菌神经毒素或用于本发明的梭菌神经毒素包含BoNT/E活化环。BONT/E活化环可以定义为包含SEQ ID NO：10：“CKNIVSVKGIRKSIC”(对应于SEQ ID NO：6的氨基酸残基C412至C426)，或者与SEQ ID NO：10差别1，2，3，4或5个氨基酸残基插入、缺失或取代的序列。
在一个实施方案中，BONT/E活化环具有由SEQ ID NO：10组成的序列。在另一个实施方案中，BONT/E活化环具有与SEQ ID NO：10差异1个氨基酸残基插入、缺失或取代的序列。在另一个实施方案中，BONT/E活化环具有与SEQ ID NO：10差异2个氨基酸残基插入、缺失或取代的序列。在另一个实施方案中，BONT/E活化环具有与SEQ ID NO：10差异3个氨基酸残基插入、缺失或取代的序列。在另一个实施方案中，BONT/E活化环具有与SEQ ID NO：10差异4个氨基酸残基插、缺失或取代的序列。在另一个实施方案中，BONT/E活化环具有与SEQID NO：10差异5个氨基酸残基插入、缺失或取代的序列。
在一个优选的实施方案中，梭菌神经毒素是BoNT/E，例如与SEQ ID NO：6具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或100％的同一的氨基酸序列的BoNT/E。
术语“梭菌神经毒素”也旨在包含修饰的梭菌神经毒素及其衍生物，包括但不限于下文所述的那些。修饰的梭菌神经毒素或衍生物可含有与梭状神经毒素的天然(未修饰)形式相比已经修饰的一个或多个氨基酸，或可含有一个或多个不存在于天然(未修饰的)形式的梭菌神经毒素的插入的氨基酸，或者与梭菌神经毒素的天然(未修饰)形式相比可以含有一个或多个缺失的氨基酸。举例来说，相对于天然(未修饰的)梭菌神经毒素序列，修饰的梭菌神经毒素可以在一个或多个结构域中具有修饰的氨基酸序列。这种修饰可以修饰神经毒素的功能方面，例如生物活性或持久性。
修饰的梭菌神经毒素可以在重链的氨基酸序列中具有一个或多个修饰(例如修饰的HC结构域)，其中所述修饰的重链以比天然(未修饰的)梭菌神经毒素更高或更低的亲和力结合靶标神经细胞。HC结构域中的这种修饰可以包括修饰HC结构域的神经节苷脂结合位点中的残基或修饰改变与神经节苷脂受体和/或靶神经细胞的蛋白质受体的结合的蛋白质(SV2或突触结合蛋白)结合位点中的残基。WO2006/027207和WO2006/114308中描述了这种修饰的梭菌神经毒素的实例，两者全部通过引用并入本文。
修饰的梭菌神经毒素可以在轻链的氨基酸序列中具有一个或多个修饰，例如可以改变或修饰经修饰的LC的SNARE蛋白特异性的底物结合或催化结构域中的修饰。WO2010/120766和US2011/0318385中描述了这种修饰的梭菌神经毒素的实例，两者全部通过引用整体并入本文。
修饰的梭菌神经毒素可包含增加或降低经修饰的梭菌神经毒素的生物活性和/或生物持久性的一种或多种修饰。
术语“梭菌神经毒素”旨在包含嵌合的(或杂合的)梭菌神经毒素。嵌合的梭菌神经毒素包含来自一种梭菌神经毒素类型或其亚型的轻链的至少一部分和来自另一种梭菌神经毒素类型或亚型的重链的至少一部分。
在一个实施方案中，嵌合的梭菌神经毒素可含有来自一种梭菌神经毒素类型或亚型的完整轻链和来自另一种梭菌神经毒素类型或亚型的重链。在另一个实施方案中，嵌合的梭菌神经毒素可含有一种梭菌神经毒素类型或亚型重链的一部分(例如结合结构域)，而另一部分重链来自另一种梭菌神经毒素类型或亚型。类似地或备选地，治疗元件可以包含来自不同梭菌神经毒素类型或亚型的轻链部分。这样的杂合或嵌合的梭菌神经毒素例如可用作将此类梭菌神经毒素的治疗益处递送给对给定梭菌神经毒素亚型具有免疫抗性的患者，可能具有对给定的梭菌神经毒素重链结合结构域的低于平均浓度的受体的患者，或可能具有膜或囊泡毒素底物的蛋白酶抗性变体(例如SNAP-25，VAMP和突触融合蛋白)的患者。杂交和嵌合的梭菌神经毒素描述于US 8,071,110和GB1607901.4(尚未公开)中，其通过引用整体并入本文。因此，在一个实施方案中，根据本发明的方法或用途进行纯化的梭菌神经毒素可以是工程化的梭菌神经毒素，适宜地它可以是工程化的嵌合梭菌神经毒素。
术语“梭菌神经毒素”旨在包含重新靶向的梭菌神经毒素。在重新靶向的梭菌神经毒素中，梭菌神经毒素被修饰以包括称为靶向部分(TM)的外源配体。选择TM以提供对期望的靶细胞的结合特异性，并且作为重新靶向过程的一部分，可以去除梭菌神经毒素的天然结合部分(例如HC结构域或HCC结构域)。例如，在下列文献中描述了重新靶向技术：EP-B-0689459；WO 1994/021300；EP-B-0939818；US 6,461,617；US 7,192,596；WO 1998/007864；EP-B-0826051；US 5,989,545；US 6,395,513；US 6,962,703；WO 1996/033273；EP-B-0996468；US 7,052,702；WO 1999/017806；EP-B-1107794；US 6,632,440；WO 2000/010598；WO 2001/21213；WO 2006/059093；WO 2000/62814；WO 2000/04926；WO 1993/15766；WO2000/61192；和WO 1999/58571；其全部通过引用整体并入本文。因此，在一个实施方案中，用于本发明的工程化梭菌神经毒素可以是工程化的重新靶向的梭菌神经毒素。
/本发明还包括使用包含“破坏性切割位点”的梭菌神经毒素。在所述梭菌神经毒素中，将非天然蛋白酶切割位点并入梭菌神经毒素中被选择的位置使得在所述位点的切割将降低梭菌神经毒素的活性或使其失活。在梭菌神经毒素施用后迁移至非靶位置的情况下，破坏性蛋白酶切割位点可能易受局部蛋白酶切割的影响。适当的非天然蛋白酶切割位点包括上述那些。包含破坏性切割位点的梭菌神经毒素描述于WO2010/094905和WO2002/044199中，两者均通过引用整体并入本文。
在一个优选的实施方案中，本发明的或用于本发明的梭菌神经毒素不含存在于天然存在的梭菌神经毒素复合物中的复合蛋白。
在一个实施方案中，本发明的或用于本发明的梭菌神经毒素可包含SEQ ID No：2，3，4，5，6，7，8，9所示的多肽序列或与其具有至少65％或70％序列同一性的多肽序列。
在一个实施方案中，本发明或用于本发明的梭菌神经毒素可包含如SEQ ID No：2，3，4，5，6，7，8或9所示的多肽序列或与其具有至少75％或80％序列同一性的多肽序列。
在一个实施方案中，本发明的或用于本发明的梭菌神经毒素可包含如SEQ ID No：2，3，4，5，6，7，8或9所示的多肽序列或与其具有至少85％或90％序列同一性的多肽序列。
在一个实施方案中，本发明的或用于本发明的梭菌神经毒素可包含SEQ ID No：2，3，4，5，6，7，8或9所示的多肽序列或与其具有至少95％或99％序列同一性的多肽序列。
在一个实施方案中，本发明的或用于本发明的梭菌神经毒素包含SEQ ID No：6所示的多肽序列或与其具有至少65％，70％，75％，80％，85％，90％，95％或99％序列同一性的多肽序列。
两个或更多个核酸或氨基酸序列之间的“百分比序列同一性”是序列共享的相同位置的数目的函数。因此，同一性％可以计算为相同核苷酸/氨基酸的数目除以核苷酸/氨基酸的总数，乘以100。序列同一性％的计算还可以考虑空位数目和为优化两个或更多序列的比对而需要引入的每个空位的长度。序列比较和两个或更多个序列之间的百分比同一性的确定可以使用专业技术人员熟悉的特定数学算法，例如BLAST来进行。
在一个实施方案中，用于本发明的单链梭菌神经毒素是通过在异源宿主细胞(例如细菌，昆虫，酵母，微生物，哺乳动物或植物细胞)中或在无细胞系统中表达编码单链梭菌神经毒素的基因而获得的。优选地，异源宿主细胞是大肠杆菌。
另一方面，本发明提供了可通过根据本发明的方法获得的活性双链梭菌神经毒素。
另一方面，本发明提供了药物组合物，包含根据本发明的活性双链梭菌神经毒素，其中所述组合物基本上不含单链梭菌神经毒素。
本文所用的术语“基本上纯的”或“基本上不含”是指不希望的污染物(或副产物)的水平低于10％，例如低于9％，8％，7％，6％，5％，4％，3％，2％，1％或低于0.1％。
在优选的实施方案中，根据本发明的药物组合物包含小于10％，例如小于9％，8％，7％，6％，5％，4％，3％，2％，1％或小于0.1％的单链梭菌神经毒素。
在更优选的一个实施方案中，根据本发明的药物组合物还包含小于10％，例如小于9％，8％，7％，6％，5％，4％，3％，2％，1％或小于0.1％的截短(过度活化的)梭菌神经毒素。
在一个优选的实施方案中，根据本发明的药物组合物包含小于5％的单链梭菌神经毒素和小于5％的截短的双链梭菌神经毒素。
在更优选的实施方案中，根据本发明的药物组合物包含小于1％的单链梭菌神经毒素和小于1％的截短的双链梭菌神经毒素。
在更优选的实施方案中，根据本发明的药物组合物包含小于0.1％的单链梭菌神经毒素和小于0.1％的截短的双链梭菌神经毒素。
单链，双链和截短的双链梭菌神经毒素的相对量可以通过本领域熟知的方法评估，例如通过使用SDS-PAGE，然后通过光密度测定分析来确定相对量(参见例如实施例1)，通过毛细管电泳或通过UPLC(超高效液相色谱)方法来评估纯度(尺寸排阻，离子交换，反相，疏水相互作用色谱)。
在一个实施方案中，根据本发明的药物组合物用于治疗。
根据本发明的药物组合物可用于治疗或预防选自肌肉病症，神经肌肉病症，神经病症，眼科病症，疼痛病症，心理病症，关节病症，炎性病症，内分泌病症和泌尿学病症的疾病、病况或综合征，包括：
·眼科病症，选自由睑痉挛、斜视(包括限制性或肌源性斜视)、弱视、振动幻视、保护性上睑下垂、为保护角膜的治疗性上睑下垂、眼球振颤、estropia、复视、睑内翻、眼睑回缩、眶肌病、隐斜视、伴发性失调、非伴发性失调、原发性或继发性内斜视或外斜视、核间性眼肌麻痹、反向偏斜、杜安综合征和上睑回缩组成的组；
·运动障碍，包括半面痉挛、斜颈、儿童或成人(例如在脑瘫、中风后、多发性硬化、外伤性脑损伤或脊髓损伤患者中)的痉挛状态、特发性病灶性肌张力障碍、肌强直、书写痉挛、手张力障碍、VI型神经麻痹、口颚肌张力障碍、头震颤、迟发性运动障碍、迟发性肌张力障碍、职业性痉挛(包括音乐家痉挛)、面神经麻痹、颌闭合痉挛、面痉挛、联带运动、震颤、原发性书写震颤、肌阵挛、僵人综合征、足张力障碍、面神经麻痹、臂痛及指动综合征、抽搐性运动障碍、张力障碍性抽搐、图雷特综合征、神经性肌强直、下颚震颤、外直肌瘫痪、张力障碍性足内翻、下颚张力障碍、Rabbit综合征、小脑性震颤、III型神经麻痹、腭肌阵挛、静坐不能(akasthesia)、肌痉挛、IV型神经麻痹、步态冻结、躯干伸肌张力障碍、面神经麻痹后联带运动、继发性肌张力障碍、帕金森氏病、亨廷顿舞蹈病、癫痫、无效期(off period)张力障碍、头部破伤风、肌纤维颤搐和良性痉挛-肌束颤搐综合征；
·耳鼻咽喉学病症，包括痉挛性发声困难、耳病症、听力损伤、耳喀喇音、耳鸣、眩晕、梅尼埃病、耳蜗神经功能障碍、口吃、环咽肌性咽下困难、夜磨牙症、慢性吸气中的喉闭合、声襞肉芽肿、室性张力障碍、室性发声困难、转变性发声困难、牙关紧闭、打鼾、声音震颤、吸气(aspiration)、舌伸出肌张力障碍、腭震颤、唇深覆牙合和喉张力障碍；第一口综合征；
·胃肠障碍，包括弛缓不能、肛裂、便秘、颞下颌关节功能障碍、胆道口括约肌功能障碍、持续性胆道口括约肌高压、肠肌肉病症、耻骨直肠肌综合征、肛门痉挛(anismus)、幽门痉挛、胆囊功能障碍、胃肠或食管运动功能障碍、弥散性食管痉挛和胃肌轻瘫；
·泌尿生殖病症，包括逼尿肌括约肌协同失调、逼尿肌反射亢进、神经源性膀胱功能障碍(例如在帕金森氏病、脊髓损伤、中风或多发性硬化患者中)、膀胱过动症(overactive bladder)、神经源性逼肌过度活动、膀胱痉挛、尿失禁、尿潴留、肥大性膀胱颈、排泄功能障碍、间质性膀胱炎、阴道痉挛、子宫内膜异位症、骨盆疼痛、前列腺增大(良性前列腺增生症)、前列腺痛症、前列腺癌和阴茎异常勃起；
·皮肤病学病症，包括皮肤细胞增生性病症、皮肤创伤、牛皮癣、酒渣鼻、痤疮；罕见的遗传性皮肤病，如Fox-Fordyce综合征或Hailey-Hailey病；瘢痕疙瘩和肥厚性瘢痕减少；孔径减小；皮肤炎症状况；疼痛的皮肤炎症状况；
·疼痛病症，包括背部疼痛(上背痛、下背痛)、肌盘膜痛、紧张性头痛、纤维肌痛、疼痛综合征、肌痛、偏头痛、鞭子式损伤(whiplash)、关节疼痛、手术后疼痛、与肌肉痉挛无关的疼痛和与平滑肌病症有关的疼痛；
·炎性病症，包括胰腺炎、神经源性炎性病症(包括痛风、腱炎、滑囊炎、皮肌炎和强直性脊柱炎)；
·分泌性病症，例如腺体分泌过多、多汗症(包括腋窝多汗症，手掌多汗症和弗雷氏综合征)、多涎、涎分泌过多(sialorrhoea)、臭汗症、粘液分泌过多、过度流泪、全质分泌腺功能障碍；皮脂分泌过多；
·呼吸性病症，包括鼻炎(包括过敏性鼻炎)、COPD、哮喘和肺结核；
·肥大性病症，包括肌肉肥大、咬肌肥大、肢端肥大症和伴有肌痛的神经源性胫骨前肌肥大；
·关节病症，包括网球肘(或肘部上髁炎)、关节的炎症、髋关节病、骨关节炎、肩部的回旋肌盖病理、类风湿性关节炎和腕管综合征；
·内分泌病症如2型糖尿病、hyperglucagonism、胰岛素过多、胰岛素分泌不足、高钙血症、低钙血症、甲状腺病症(包括Grave's病、甲状腺炎、桥本(Hashimoto's)甲状腺炎、甲状腺功能亢进和甲状腺功能减退)、副甲状腺紊乱(包括甲状旁腺功能亢进和甲状旁腺功能减退)、库欣综合征和肥胖；
·自身免疫性疾病如系统性红斑狼疮；
·增殖性疾病，包括副神经节肿瘤、前列腺癌和骨肿瘤；
·创伤性损伤，包括运动损伤、肌肉损伤、腱创伤和骨折；和
·兽医用途(例如哺乳动物的固定、马的急腹痛、动物弛缓不能或动物肌痉挛)。根据本发明的药物组合物在化妆品或美容中的用途也是本发明的一个方面，例如用于治疗或预防治疗或防止皮肤皱纹，特别是面部皱纹，如面部抬头纹(facial frown lines)，眼周皱纹(wrinkles of the contour of the eye)，眉间皱眉纹，嘴角下垂。
根据本发明的药物组合物还可以用于美容医学(即用于改善美容外观)，特别是用于治疗或预防皮肤皱纹，特别是面部皱纹，例如面部抬头纹，眼周皱纹，眉间皱眉纹，嘴角下垂，颈部(颈阔肌带)皱纹，下巴皱纹(mentalis、peau d’orange、dimpled chin)，前额纹，“划伤皮肤”皱纹，鼻升(nasal lift)治疗或睡眠线(sleep lines)。
除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。Singleton等人，DICTIONARY OF MICROBIOLOGY ANDMOLECULAR BIOLOGY，第20版，John Wiley and Sons，New York(1994)和Hale&Marham，THEHARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY，Harper Perennial，NY(1991)向本领域技术人员提供了在本公开中使用的许多术语的通用词典。
本公开不受本文公开的示例性方法和材料的限制，并且与本文所述的那些类似或等同的任何方法和材料可以用于本公开的实施方案的实践或测试中。数字范围包括定义该范围的数字。除非另有说明，否则任何核酸序列均以5'至3'的方向从左至右书写；氨基酸序列从氨基到羧基方向从左到右书写。
本文提供的标题不是对本公开的各个方面或实施方式的限制，其可以作为对说明书整体参考。因此，下面直接定义的术语通过参考说明书整体更全面地定义。
氨基酸在本文中使用氨基酸的名称、三字母缩写或单字母缩写进行引用。
如本文所用，术语“氨基酸序列”与术语“多肽”和/或术语“蛋白质”是同义的。在一些情况下，术语“氨基酸序列”与术语“肽”同义。在一些情况下，术语“氨基酸序列”与术语“酶”同义。
如本文所用，术语“蛋白质”包括蛋白质、多肽和肽。
术语“蛋白质”和“多肽”在本文中可互换使用。在本公开和权利要求书中，可以使用用于氨基酸残基的常规单字母和三字母编码。根据IUPACIUB生化命名联合委员会(JCBN)定义氨基酸3字母代码。还应理解的是，由于遗传密码的简并性，多肽可由多于一个核苷酸序列编码。
术语的其他定义可以在整个说明书中出现。在更详细地描述示例性实施方案之前，应该理解，本公开不限于所描述的特定实施方案，因此当然可以变化。还应理解的是，这里使用的术语仅用于描述特定实施方案的目的，并且不旨在限制，因为本公开的范围将仅由所附权利要求限制。
在提供数值范围的情况下，应该理解的是，除非上下文另有明确规定，否则在该范围的上限和下限之间的每个中间值(至下限单位的十分之一)也被具体公开。在所述范围内的任何规定值或中间值与该规定范围内的任何其他规定值或中间值之间的每个较小范围包含在本公开内。这些较小范围的上限和下限可以独立地包括在该范围内或排除在外，并且其中上限和下限中任一个、没有一个或两个都包括在较小范围内的每个范围也包含在本公开内容中，受制于规定的范围中任何特别排除的范围。在所述范围包括一个或两个限制的情况下，排除这些被包括的限制中的任一个或两个的范围也包括在本公开中。
必须注意的是，除非上下文另有明确规定，否则如本文和所附权利要求中所使用的，单数形式“一”、“一个”和“该”包括复数指代。因此，例如，对“一个梭菌神经毒素”的提及包括多种这样的候选剂，并且对“该梭菌神经毒素”的引用包括对本领域技术人员已知的一种或多种梭菌神经毒素及其等同物的引用等等。
本文讨论的出版物仅在本申请的提交日期之前被提供用于其公开。本文中任何内容都不应被解释为承认这些出版物构成了所附权利要求的现有技术。
现在将参照下面的附图和实施例仅以举例的方式描述本发明。
附图简述
现在将参照下面的附图仅以举例的方式描述本发明的实施方案，其中：
图1示出了在20℃下pH 8和蛋白质浓度为0.55mg/mL的未活化的肉毒杆菌神经毒素样品用最终浓度分别为0.3和0.4μg/mL的重组猪胰蛋白酶(Roche)温育后，全长活化的肉毒杆菌神经毒素(内切阴性)和截短的活化肉毒杆菌神经毒素重链的相对量。取出样品用于SDS-PAGE分析。通过光密度测定法分析每个SDS-PAGE样品。
图2示出了在还原条件下，在pH8.0下用不同浓度的牛胰蛋白酶(Sigma-Aldrich)活化单链内切阴性肉毒杆菌神经毒素E(0.55mg/mL)并在20℃温育8小时后通过SDS-PAGE的分析。(泳道1：分子量标志物；泳道2：-20℃对照；泳道3：+20℃对照；泳道4：0.2μg/mL胰蛋白酶；泳道5：0.4μg/mL胰蛋白酶；泳道6：0.6μg/mL胰蛋白酶；泳道7：0.8μg/mL胰蛋白酶；泳道8：1.0μg/mL胰蛋白酶)。
图3示出了用重组牛胰蛋白酶在pH6.5，7.0，7.5和7.8活化并在20℃温育16小时后的内切阴性肉毒杆菌神经毒素E重链(HC)，轻链(LC)和截短重链(tHC)的各百分比。(神经毒素浓度：0.55mg/mL，重组牛胰蛋白酶(Sigma-Aldrich)浓度：1.5μg/mL)。通过光密度测定法在还原条件下通过SDS-PAGE分析样品。
图4示出了在用牛胰蛋白酶活化并使用陶瓷羟基磷灰石II型色谱柱分离后，可以实现全长双链肉毒杆菌神经毒素E(内切阴性)与截短的双链肉毒杆菌神经毒素的分离。通过在线A280nm读数监测来自柱的全长双链肉毒杆菌神经毒素和截短的双链肉毒杆菌神经毒素的洗脱，合并经选择的仅含有全长双链肉毒杆菌神经毒素的级分，并通过SDS-PAGE在还原和非还原条件下进行分析。
图5：BoNT/A的蛋白质序列-UniProtKB登录号P10845(SEQ ID NO：2)。
图6：BoNT/B的蛋白质序列-UniProtKB登录号P10844(SEQ ID NO：3)。
图7：BoNT/C的蛋白质序列-UniProtKB登录号P18640(SEQ ID NO：4)。
图8：BoNT/D的蛋白质序列-UniProtKB登录号P19321(SEQ ID NO：5)。
图9：BoNT/E的蛋白质序列-UniParc I.D UPI00000010A3(SEQ ID NO：6)。
图10：BoNT/F的蛋白质序列-UniProtKB登录号YP_001390123(SEQ ID NO：7)。
图11：BoNT/G的蛋白质序列-UniProtKB登录号Q60393(SEQ ID NO：8)。
图12：TeNT的蛋白质序列-UniProtKB登录号P04958(SEQ ID NO：9)。
图13：牛胰蛋白酶的蛋白质序列(SEQ ID NO：1)。
实施例
在上述说明书中提到的所有出版物均通过引用并入本文。在不脱离本发明的范围和精神的情况下，本发明所描述的方法和系统的各种修改和变型对于本领域技术人员而言将是显而易见的。尽管已经结合具体的优选实施方案描述了本发明，但应该理解，所要求保护的本发明不应该不适当地限于这些具体实施方案。实际上，对于生物化学和生物技术或相关领域的技术人员来说显而易见的用于实施本发明的所描述的模式的各种修改旨在落入以下权利要求的范围内。
实施例1
在20℃下将pH8和蛋白质浓度为0.55mg/mL的单链肉毒杆菌神经毒素E(内切阴性)样品与终浓度为0.3和0.4μg/mL的重组猪胰蛋白酶(Roche)一起温育。取出样品，在还原条件下每30分钟至6小时进行SDS-PAGE分析，之后每60分钟进行一次，最多达9小时。通过光密度测定法分析每个SDS-PAGE样品以确定全长双链肉毒杆菌神经毒素，截短的双链肉毒杆菌神经毒素重链和单链肉毒杆菌神经毒素的相对量。然后将全长双链肉毒杆菌神经毒素和截短的双链肉毒杆菌神经毒素的值绘制在图表上(图1)。当与猪胰蛋白酶接触时，在肉毒杆菌神经毒素完全活化之前发生截短的双链肉毒杆菌神经毒素。
实施例2-用不同浓度的牛胰蛋白酶的活化
在20℃下，pH8.0，蛋白质浓度为0.55mg/mL的单链肉毒杆菌神经毒素E(内切阴性)样品与终浓度分别为为0.2，0.4，0.6，0.8和1.0μg/mL的牛胰蛋白酶(Sigma-Aldrich)一起温育。8小时后，取出样品在还原条件下通过SDS-PAGE用于分析。图2中显示的结果显示，在完全活化实现之前，在每个样品中观察到重链截短。
实施例3-用不同pH的牛胰蛋白酶的活化
在20℃下，pH 6.5，7.0，7.5和7.8，蛋白质浓度为0.55mg/mL的单链肉毒杆菌神经毒素E(内切阴性)样品与，终浓度为1.5μg/mL的重组牛胰蛋白酶(Sigma-Aldrich)一起温育。16小时后，取出样品在还原条件下通过SDS-PAGE用于分析。通过光密度测定法分析每个SDS-PAGE样品以确定截短的双链肉毒杆菌神经毒素重链的相对量。结果如图3和表1所示。截短的双链肉毒杆菌神经毒素形成在较高pH下更容易发生。
表1-不同pH下截短重链的百分比(<LOD：低于检测极限)
实施例4-用牛胰蛋白酶活化后活化的神经毒素的纯化
将通过与78.57μgTrypzean(牛胰蛋白酶)在20℃温育18小时而活化的26mg含有内切阴性BoNT/E(已被活化)的总蛋白质施加到5mL陶瓷羟基磷灰石II型柱上。用结合缓冲液(25mM磷酸钠，pH6.5)洗涤柱，然后用35倍柱体积洗脱，使用结合缓冲液和洗脱缓冲液(500mM磷酸钠pH6.5)以线性梯度增加磷酸钠浓度，收集2.5mL级分。通过在线A280nm读数监测来自柱的全长双链肉毒杆菌神经毒素和截短的双链肉毒杆菌神经毒素的洗脱，合并所选择的仅含有全长双链肉毒杆菌神经毒素的级分，并通过SDS-PAGE在还原和非还原条件下进行分析(图4)。
实施例5-全长活化的肉毒杆菌神经毒素E制品
通过解冻种子库小瓶并接种含有100mL改良的Terrific Broth(mTB)的摇瓶来制备肉毒杆菌神经毒素E接种物大肠杆菌培养物。然后将烧瓶在25℃下在振荡培养箱中温育17小时。使用接种培养物用于接种五个摇瓶，每个摇瓶含有1L的mTB。将细胞在37℃振荡培养箱中培养至指数生长期；培养物的温度降至16℃；并通过加入异丙基β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)至终浓度为0.1mM来诱导培养物。诱导后20小时通过切向流过滤(TFF)使用中空纤维膜收获细胞。首先将培养物浓缩5倍，然后用5倍体积的裂解缓冲液(100mM磷酸钠，100mM NaCl，1.3M(NH4)2SO4，pH7.8)渗滤。
将所得的细胞糊浆料通过机械细胞破碎器两次均化。通过离心沉淀不溶性细胞碎片并回收上清液，施加到装填有Butyl Sepharose 4FF(GE Lifesciences)的柱上，用结合缓冲液(100mM磷酸钠，100mM NaCl，1.25M(NH4)2SO4)，pH7.8)洗涤。使用三步梯度，利用以下的结合和洗脱(100mM磷酸钠，100mM NaCl，pH7.8)缓冲液的混合物从柱中洗脱未活化的肉毒杆菌神经毒素E，产物在步骤2中洗脱。
步骤1 88％上样缓冲液；12％洗脱缓冲液
步骤2 58％上样缓冲液；42％洗脱缓冲液
步骤3 100％洗脱缓冲液
然后使用中空纤维膜通过TFF将来自步骤2的材料浓缩大约两倍，然后用10体积的25mM磷酸钠pH 6.5缓冲液渗滤。渗滤后，通过离心沉淀渗余物中的任何不溶物质，并将上清液在阴性色谱步骤中施加到装填有Q Sepharose HP(GE Lifesciences)的柱上。收集含有未活化的肉毒杆菌神经毒素的流出液，用25mM磷酸钠pH6.5洗涤柱以使产物回收率最大化。
然后用25mM磷酸钠pH 6.5将流出液稀释至总蛋白质浓度为0.5mg/ml，并与7.27USP单位/mL重组牛胰蛋白酶在室温下温育21小时。温育后，将活化的肉毒杆菌神经毒素E施加到陶瓷羟基磷灰石II型柱上，用结合缓冲液(25mM磷酸钠pH6.5)洗涤。使用结合缓冲液和洗脱缓冲液(500mM磷酸钠pH6.5)以线性梯度从柱上洗脱活化的肉毒杆菌神经毒素。
合并含有全长活化的肉毒杆菌神经毒素的级分，并在阴性色谱步骤中将其应用于装填有苯甲脒琼脂糖FF(high-sub)(GE Lifesciences)的柱。收集含有全长活化的肉毒杆菌神经毒素的流出液，并用上样缓冲液(110mM磷酸钠，pH6.5)洗涤柱以使产物回收最大化。使用中空纤维滤筒将流出液通过TFF渗滤到具有5体积的25mM磷酸钠，100mM NaCl，pH6.5的最终储存缓冲液中。

Claims (17)

1.生产活化的梭菌神经毒素的方法，包括使单链梭菌神经毒素与活化酶接触，直至至少90％的单链梭菌神经毒素转化为双链梭菌神经毒素。
2.根据权利要求1的方法，其中所述活化酶是胰蛋白酶。
3.根据权利要求2的方法，其中所述胰蛋白酶是牛胰蛋白酶，并且其中所述牛胰蛋白酶具有与SEQ ID NO：1具有至少90％同一性的氨基酸序列。
4.根据权利要求3的方法，其中所述牛胰蛋白酶选自获自牛胰腺的天然胰蛋白酶和重组牛胰蛋白酶。
5.根据权利要求3或4的方法，其中使所述单链梭菌神经毒素与牛胰蛋白酶接触的所述步骤在pH5和7.5，优选6和7之间进行，例如在约pH6.5下进行。
6.根据权利要求5的方法，其中使单链梭菌神经毒素与所述牛胰蛋白酶接触的步骤在室温下在pH6和7之间进行15至25小时的持续期，并且其中所述牛胰蛋白酶的浓度为每mg梭菌神经毒素0.5和3μg之间。
7.根据权利要求1至6中任一项的方法，还包括去除截短的梭菌神经毒素的步骤。
8.根据权利要求7的方法，其中所述去除截短的梭菌神经毒素的步骤包括使所述活化的梭菌神经毒素与混合模式色谱树脂接触。
9.根据权利要求1至8中任一项的方法，其中所述梭菌神经毒素选自BoNT/A、BoNT/B、BoNT/C、BoNT/D、BoNT/E、BoNT/F、BoNT/G和TeNT。
10.根据权利要求1-9中任一项的方法，其中所述梭菌神经毒素是与野生型肉毒杆菌神经毒素相比的经修饰的肉毒杆菌神经毒素，例如突变的梭菌神经毒素、嵌合梭菌神经毒素或重新靶向的梭菌神经毒素。
11.根据权利要求1至10中任一项的方法，其中所述梭菌神经毒素包括BoNT/E活化环。
12.根据权利要求1-11中任一项的方法，其中所述梭菌神经毒素是BoNT/E。
13.根据权利要求1至12中任一项的方法，其中所述单链梭菌神经毒素通过在异源宿主细胞，优选在大肠杆菌中表达编码所述单链梭菌神经毒素的基因而获得。
14.一种活性双链梭菌神经毒素，其能通过权利要求1-13中任一项的方法获得。
15.包含权利要求14的活性双链梭菌神经毒素的药物组合物，其中所述组合物基本上不含单链梭菌神经毒素。
16.根据权利要求15的药物组合物，其用于治疗，例如用于治疗眼科病症，运动病症，耳鼻喉科病症，胃肠道病症，泌尿生殖系统病症，皮肤病学病症，疼痛病症，炎性病症，分泌性病症，呼吸病症，肥大性病症，关节病症，内分泌病症，自身免疫疾病，增殖性疾病，创伤性损伤，兽医用途。
17.根据权利要求15的药物组合物在化妆品或美容中的用途。
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