CN109402224A - 制备带有双链分子标签的二代测序接头的方法 - Google Patents

制备带有双链分子标签的二代测序接头的方法 Download PDF

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郑贤杰
朱垚
曹振
曹欣茹
宋东亮
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6811—Selection methods for production or design of target specific oligonucleotides or binding molecules

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Abstract

本发明提供一种制备带有双链分子标签的二代测序接头的方法，其特征在于，包括：步骤一：合成接头序列，接头序列包含第一序列和第二序列，其中，所述第二序列包括：限制性内切酶的保护碱基和5个随机碱基的双链分子标签，以及限制性内切酶HpyAV的酶切位点，第一序列和第二序列中具有互补的序列片段，步骤二：接头序列退火，混匀第一序列和第二序列，在退火体系中按退火程序退火形成双链，步骤三：补齐步骤二中所形成的双链的接头，步骤四：酶切并回收接头。本发明的制备带有双链分子标签的第二代测序接头的方法，具有以下优势：接头中含有更长的双链分子标签，为生息分析提供更好的信息基础；适用于等多种测序平台。

Description

制备带有双链分子标签的二代测序接头的方法
技术领域
本发明涉及一种制备带有双链分子标签的二代测序接头的方法，属于分子生物学领域。
背景技术
在Illumina测序平台中，接头是二代测序建库中必要的元素，目前官方的接头包含多种类型，序列中包含了p5与p7扩增引物结合序列、 read1和read2测序引物结合序列、样本标签序列、分子标签序列等，并且带有用于A/T连接的3’-dT尾。
目前常于p7端设计单链分子标签用于给建库中的目标分子添加标签，使生信分析过程可以捕获到更精细的分子信息，降低变异分析的背景噪音。
另外，也可以通过双链分子标签，结合单链分子标签，通过生信将变异分析的背景噪音降得更低，使测序分析结果更加精准可靠。
但是，目前没有较好的双链标签添加方法方便于文库构建。
发明内容
本发明的目的在于提供制备带有双链分子标签的二代测序接头的方法，以解决上述问题。
本发明采用了如下技术方案：
一种制备带有双链分子标签的二代测序接头的方法，其特征在于，包括：
步骤一：合成接头序列，接头序列包含第一序列和第二序列，
其中，所述第二序列包括：限制性内切酶的保护碱基和5个随机碱基的双链分子标签，以及限制性内切酶HpyAV的酶切位点，第一序列和第二序列中具有互补的序列片段，
步骤二：接头序列退火，混匀第一序列和第二序列，在退火体系中按退火程序退火形成双链，
步骤三：补齐步骤二中所形成的双链的接头，
步骤四：酶切并回收接头。
进一步，本发明的制备带有双链分子标签的二代测序接头的方法，还具有这样的特征：其中，所述第二序列中还具有随机碱基的单链分子标签。
进一步，本发明的制备带有双链分子标签的二代测序接头的方法，还具有这样的特征：其中，所述第二序列中还具有样本标签。
进一步，本发明的制备带有双链分子标签的二代测序接头的方法，还具有这样的特征：制备带有双链分子标签的第二代测序接头的方法，其特征在于：步骤三中，采用T4DNA聚合酶延伸补平步骤二中的退火产物。
进一步，本发明的制备带有双链分子标签的第二代测序接头的方法，其特征在于：步骤四中，采用限制性内切酶HpyAV酶切步骤三中的延伸产物，然后去除50bp以内的残余双链小片段，保留接头。
进一步，本发明的制备带有双链分子标签的第二代测序接头的方法，其特征在于：
第一序列的序列如下：
5-A*A*TGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGAC-GCTC TTCCGAT*C*T-3。
进一步，本发明的制备带有双链分子标签的第二代测序接头的方法，其特征在于：
第二序列的序列如下：
5-NNNN-ANNNNNGAAGG-AG*A*TCGGAAGAGC-ACACGTCTGAACTCCA GTCAC-NNNN-NNNNNNNN-ATCTCGTATGCCGTCTTCTGCT*T*G-3
其中，第1至4位为限制性内切酶的保护碱基，碱基数0-10个，
第6位至第10位是四个随机碱基的双链分子标签，
第50位至第53位是四个随机碱基的单链分子标签，
第54位至第61位是6-8个碱基的样本标签，
第5位至第15位是为限制性内切酶HpyAV的酶切位点。
发明的有益效果
本发明的制备带有双链分子标签的第二代测序接头的方法，具有以下优势：
1.接头中含有更长的双链分子标签，为生息分析提供更好的信息基础；
2.可以有效、较经济实惠地合成获得接头；
3.适用于Illumina Hi-Seq、Mi-Seq等多种测序平台。
具体实施方式
以下结合具体实施方式来进一步阐述本发明的技术方案。
步骤一：合成接头序列。合成以下两种序列：
序列1：5-A*A*TGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGAC-GCTCTTCCGAT*C*T-3
序列2：
5-NNNN-ANNNNNGAAGG-AG*A*TCGGAAGAGC-ACACGTCTGAACTCCAGTCAC-NNNN-NNNNNNNN-ATCTCGTATGCCGTCT TCTGCT*T*G-3
序列中“*”为保护性修饰；
第1至4位的碱基为限制性内切酶的保护碱基，碱基数0-10个不等，具体碱基可变，具体根据实际案例设计而定；
第6位至第10位的碱基为5个随机碱基的双链分子标签；
第50位至第53位的碱基为4个随机碱基的单链分子标签，可根据应用更改碱基数；
第54位至第61位的碱基为测序接头中6-8碱基的样本标签，每次合成固定碱基的序列，次序列可变；
第5位至第15位的碱基为限制性内切酶HpyAV的酶切位点。
步骤二：接头序列退火
步骤三：延伸补齐接头。采用T4DNA聚合酶延伸补平步骤二中的退火产物。
步骤四：酶切回收3’-dT尾接头。采用限制性内切酶HpyAV酶切步骤三中的延伸产物，并采用上海翊圣生物科技有限公司的Hieff NGSTMSmarter DNA Clean Beads纯化回收接头，去除50bp以内的残余双链小片段，保留接头。
5N双链分子标签接头制备示例：
1、合成接头序列：
序列1：
5-A*A*TGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGAC-GCTC TTCCGAT*C*T-3
序列2：
5-TTTC-ANNNNNGAAGG-AG*A*TCGGAAGAGC-ACACGTCTGAACTCCAGT CAC-NNNN-NNNNNNNN-ATCTCGTATGCCGTCTTCTGCT*T*G-3
本实施方式中5’端的NNNN具体采用TTTC。
2、接头序列退火：
1:1混匀序列1和序列2，在退火体系中按退火程序退火形成双链，形成以下结构：
3、延伸补齐接头：
利用T4DNA聚合酶延伸补齐接头序列，如下：
4、酶切回收3’-dT尾接头：
利用HpyAV限制性内切酶酶切上述接头，并利用上海翊圣生物科技有限公司的Hieff NGSTMSmarter DNA Clean Beads纯化回收接头，接头如下：
本发明所提供方法的接头回收效率，在40％～80％。

Claims (7)

1.一种制备带有双链分子标签的二代测序接头的方法，其特征在于，包括：
步骤一：合成接头序列，接头序列包含第一序列和第二序列，其中，所述第二序列包括：限制性内切酶的保护碱基和5个随机碱基的双链分子标签，以及限制性内切酶HpyAV的酶切位点，第一序列和第二序列中具有互补的序列片段，
步骤二：接头序列退火，混匀第一序列和第二序列，在退火体系中按退火程序退火形成双链，
步骤三：补齐步骤二中所形成的双链的接头，
步骤四：酶切并回收接头。
2.如权利要求1所述的制备带有双链分子标签的二代测序接头的方法，其特征在于：
其中，所述第二序列中还具有随机碱基的单链分子标签。
3.如权利要求1所述的制备带有双链分子标签的二代测序接头的方法，其特征在于：
其中，所述第二序列中还具有样本标签。
4.如权利要求1所述的制备带有双链分子标签的第二代测序接头的方法，其特征在于：
步骤三中，采用T4DNA聚合酶延伸补平步骤二中的退火产物。
5.如权利要求1所述的制备带有双链分子标签的第二代测序接头的方法，其特征在于：
步骤四中，采用限制性内切酶HpyAV酶切步骤三中的延伸产物，然后去除50bp以内的残余双链小片段，保留接头。
6.如权利要求1所述的制备带有双链分子标签的第二代测序接头的方法，其特征在于：
第一序列的序列如下：
5-A*A*TGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGAC-GCTCTTCCGAT*C*T-3。
7.如权利要求1所述的制备带有双链分子标签的第二代测序接头的方法，其特征在于：
第二序列的序列如下：
5-NNNN-ANNNNNGAAGG-AG*A*TCGGAAGAGC-ACACGTCTGAACTCCAGTCAC-NNNN-NNNNNNNN-ATCTCGTATGCCGTCTTCTGCT*T*G-3
其中，第1至4位为限制性内切酶的保护碱基，碱基数0-10个，第6位至第10位是五个随机碱基的双链分子标签，
第50位至第53位是四个随机碱基的单链分子标签，
第54位至第61位是6-8个碱基的样本标签，
第5位至第15位是为限制性内切酶HpyAV的酶切位点。
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