CN109402217B - 一种用于抗菌不锈钢抗菌效果的快速检测方法 - Google Patents

一种用于抗菌不锈钢抗菌效果的快速检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明的目的在于提供一种用于抗菌不锈钢抗菌效果的快速检测方法，由菌液配制、细菌接种、抗菌率计算三部分组成；其特征在于：改善原有抗菌检测方法中所使用样品的尺寸，细菌接种于样品的方式以及培养时间，使得细菌与材料进行直接而持续的接触，基于接触杀菌的杀菌原理使得细菌快速失活。本发明提供的检测方法工艺流程短，省时省力，准确高效，测试误差小，能充分体现抗菌不锈钢材料本体的抗菌功能，是十分理想的抗菌检测方法。

Description

一种用于抗菌不锈钢抗菌效果的快速检测方法
技术领域
本发明属于样品抗菌性能的技术检测领域，具体涉及一种用于抗菌不锈钢抗菌效果的快速检测方法，也称之为接触法。
背景技术
通常把在一定时间内能够将某些细菌抑制在一定水平以下的材料称为抗菌材料。其中抗菌不锈钢是一种结构功能一体化的绿色抗菌材料，一般分为涂层型、复合型和合金型，其表面均匀分布的Cu、Ag或稀土元素等抗菌因子，能够对细菌造成一定的损伤。研究表明，抗菌材料抗菌功能的发挥，不仅仅依赖于表面抗菌因子的溶出，还源于细菌与抗菌表面直接且持续的接触，接触过程不仅可有效促进抗菌因子向细菌内部的快速聚集，抗菌因子氧化还原反应的过程还会产生额外的活性氧压，对细胞造成进一步的损伤。此外抗菌因子溶出有限且过程缓慢，接触杀菌往往是一种更快速和有效的杀菌模式。
传统的抗菌检测方法主要有：日本的JIS2801，国际标准ISO22196以及我国的GB21551.2。这些标准所采用的抗菌方法一般称为覆膜法，主要思想是在材料或涂层表面接种浓度较低体积较大的细菌悬液并通过无菌聚丙烯膜或无菌载玻片使细菌和样品均匀接触一段时间，通常为(24±1)h。然后测得待检样品和对照样品的存活菌数，对比并计算出样品的抗菌率。该方法虽能比较普遍反映样品的抗菌性，但是存在如下缺陷：
(1)无法准确考量抗菌能力，覆膜法在操作过程中会使大量的细菌附着于聚丙烯膜或无菌载玻片的表面，导致在后续撤膜后，遗失了大量细菌。且覆膜法应用于表面积较大的样品，采用吹打的方式提取表面剩余菌，存在较大的人为操作误差。
(2)覆膜法的操作基于离子溶出机制，在材料或涂层表面接种浓度较低体积较大的细菌悬液，以期获得较多的抗菌离子溶出。此外，专利(公开号CN 106282306 A)公开了一种用于检测抗菌不锈钢长期抗菌效果的检测方法，该方法同样是基于离子溶出机制，主要采用抗菌不锈钢浸泡不同时间点后的浸提液进行抗菌测试，更适用于液态介质存在环境下对材料抗菌性能长效性的检测。然而，抗菌材料具有各种典型的应用环境，诸如在门把手，台面等相对干燥的应用场景下，溶液介质的缺失抑制了抗菌离子的溶出，此时抗菌材料抗菌行为的发生往往倾向于接触杀菌机制，采用该法或者覆膜法进行抗菌性能的检测无法具有良好的模拟评估意义。
传统的检测方法以及专利(公开号CN 106282306 A)公开的测试方法限制了细菌与材料以及材料浸提液的培养时间通常为(24±1)h才能显示一定的抗菌效果，所以完成整个抗菌测试流程比较耗时。
基于上述背景，如果有一种新的抗菌检测方法，能够匹配于抗菌不锈钢应用的各个场合，并且能够快速有效的检测材料的抗菌能力，将对于材料的抗菌性能有更高效和准确的评判，也对于抗菌材料在功能材料领域的合理应用具有指导意义。
因此，本申请拟提供一种抗菌不锈钢抗菌效果快速检测方法，在很大程度上解决现有问题，对抗菌不锈钢应用市场的拓展起到一定的积极作用。
发明内容
本发明具体提供了一种用于抗菌不锈钢抗菌效果的快速检测方法，该方法基于抗菌材料对细菌的接触杀菌机制，在原有抗菌检测方法的基础上，采用使细菌和被测材料表面充分接触的接种方式，使材料快速显示出其抗菌能力，从而高效得到检测结果，可广泛应用于科研机构、质检部门等。
本发明技术方案如下：
一种用于抗菌不锈钢抗菌效果的快速检测方法，由菌液配制、细菌接种、抗菌率计算三部分组成，其特征在于，操作步骤如下：
(1)细菌悬液制备：用接种环从新鲜培养物上刮1-2环新鲜细菌，并依次做10倍递增稀释液，选择菌液浓度为(1.0～2.0)×107CFU/mL的稀释液作为试验用菌液；
(2)细菌接种于样品表面：采用表面积为10×10mm或表面直径为Φ10mm的试样，试验开始前样品表面做灭菌处理，将样品放入24孔板中，用无菌枪头吸取3-7μL107CFU/mL菌浓的菌液滴加到每个孔中的样品表面上，由于表面张力的作用，使菌液完全铺平以至于表面液膜厚度几乎为0，确保细菌与样品表面的充分接触；在(37±1)℃、相对湿度RH＞90％条件下培养1-4h；
(3)到达相应时间点后将样品连同其上菌液一同取出，放入离心管中，加入2-5ml的缓冲液稀释细菌悬液，充分涡旋振荡；最后吸取0.1mL的细菌悬液均匀涂布在琼脂培养基平板上，37℃恒温培养24h，到达时间点后，取出平板进行菌落计数；
试验同时设对照样品和空白样品组，对照样品组除了以不具备抗菌功能的样品代替实验组样品外，其它操作程序均与实验组相同；空白样品，即是稀释菌液在(37±1)℃、相对湿度RH＞90％条件下培养与实验组对照组相同时间，细菌自然的生长状态；
抗菌率计算公式为：R(％)＝(A－B)/A×100
式中：
R—抗菌率(％)；
A—对照样品表面平均回收菌数(CFU/片)；
B—实验样片表面平均回收菌数(CFU/片)。
本发明所述快速检测方法，其特征在于：所述抗菌不锈钢材料为含铜、银、稀土之一种或多种的不锈钢材料；所用试验菌为革兰氏阳性菌和/或革兰氏阴性菌。
如图1是以含铜抗菌不锈钢为例的两种检测方式的杀菌机理图，a)覆膜法，b)接触法。由图1(b)可以看出，相比于覆膜法，接触法不会使细菌悬液在材料表面形成液态介质膜，从而使得细菌与材料能够进行充分持久的直接接触，根据接触杀菌的作用机制，该过程不仅有稳态抗菌因子Cu2+的作用，还有亚稳态抗菌因子Cu+的毒性作用，而覆膜法仅仅有稳态抗菌因子Cu2+的作用。此外，材料和细菌之间存在特定的电势差，液体膜的缺失避免了材料细菌体系之间的溶液电阻，从而加大了材料与细菌之间的作用电流，使得接触杀菌是一个快速的过程。
本发明的有益效果是：
1、该抗菌方法工艺流程短，抗菌速度快，效率高，可控性强，避免了一些人为操作误差，且使用的细菌悬液浓度较高，可以更准确评估抗菌材料本身的抗菌性能。
2、检测范围广，适用于各种抗菌不锈钢的抗菌性能检测，提供了一种非液态介质存在条件下的抗菌性能检测方法，可以有效弥补现有抗菌检测方法存在的不足，为抗菌材料在各种环境中的合理应用提供了理论支持。
3、适用机构多，该方法较为省时简便，各类卫生消毒检验部门、科研院所、社会公共检测机构、企业的研发、质控部门均可依据本法对抗菌材料抗菌性能进行评价。
附图说明
图1是以含铜抗菌不锈钢为例的两种检测方式的杀菌机理图，a)覆膜法，b)接触法。
具体实施方式
以含铜抗菌不锈钢为例，根据本发明检测参数和细菌与材料的最佳接触时间，针对抗菌测试的操作参数设定实施例和对比例。其中实验组420-Cu抗菌不锈钢的化学成分为(wt.％)：C：0.25，Si：0.55，Mn：0.45，Cr：13.28，Cu：4.10，余量为Fe；对照组普通420不锈钢的化学成分为(wt.％)：C：0.26，Si：0.48，Mn：0.67，Cr：13.25，余量为Fe。样品的尺寸均为表面积：10×10mm。
抗菌不锈钢抗菌效果的快速检测操作步骤如下：
(1)细菌悬液制备：用接种环从新鲜培养物上刮1环新鲜细菌，并依次做10倍递增稀释液，选择菌液浓度为1.0×107CFU/mL的稀释液作为试验用菌液；
(2)细菌接种于样品表面：采用表面积为10×10mm的试样，开始前试样表面做灭菌处理，将样品放入24孔板中，用无菌枪头吸取菌液滴加到每个孔中的样品表面上，确保细菌与样品表面的充分接触；在37±1℃、相对湿度RH＞90％条件下培养(1-4)h；
(3)到达相应时间点后将样品连同其上菌液一同取出，放入离心管中，加入缓冲液稀释细菌悬液，充分涡旋振荡；最后吸取0.1mL的细菌悬液均匀涂在琼脂培养基平板上，37℃恒温培养24h，到达时间点后，取出平板进行菌落计数；对照样品组操作程序均与实验组相同。
抗菌性能测试
表1定量测试了在抗菌检测操作过程中，所列接种于含铜抗菌不锈钢表面的细菌体积和培养时间，针对于常见的革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌(E.coli和S.aureus)作用后的杀菌率。其中杀菌率的计算公式为：杀菌率(％)＝[(对照样品活菌数-抗菌不锈钢活菌数)/对照样品活菌数]×100％，对照样品活菌数是普通420不锈钢样品上进行细菌培养后的活菌数。
表1实施例、对比例抗菌不锈钢抗菌效果的检测参数设定和抗菌性能测试实验结果
Figure BDA0001877556990000061
Figure BDA0001877556990000071
从表1的结果可以看出，本发明实施例1-9，1.0×107CFU/mL浓度的细菌悬液，接种于10×10mm材料表面的体积控制在3-7μL范围内，含铜抗菌不锈钢均能在1-4h范围内体现出优异的抗菌率。而当细菌悬液体积较小，例如对比例1-3，在较短时间内可体现出一定的抗菌效果，但是由于菌液体积小，一方面不足以使细菌铺满整个样品表面，无法全面反映样品整体的抗菌特征。另一方面液体量太少，无法避免干燥对于细菌活性的影响，随着培养时间的延长，过于干燥的环境使得细菌无论是在抗菌表面还是无抗菌功能的表面都会失活，对材料抗菌性能的判定产生干扰。“-”表示较小体积菌液与材料在较长时间的培养条件下，干燥使得细菌在420-Cu不锈钢和普通420不锈钢表面均无法正常生长。
此外，接种于材料表面的细菌悬液体积过大，使得与抗菌材料表面直接接触的细菌仅仅是悬液底层的一部分，大量细菌悬浮于液体介质中。根据接触杀菌的杀菌机制得知，只有与表面直接的细菌可以被快速杀死。且由图1得知，较大的菌液体积，使得菌液在材料表层形成较厚的液膜，在特定材料与特定细菌之间电势差保持恒定的条件下，介质膜的形成无疑增加了材料与细菌之间的额外电阻，从而减小了二者之间的电流，进一步减缓了材料的抗菌行为，降低了材料的真实抗菌水平。
通过以上实施例和对比例结果可知，只有材料表面积、接种于材料的细菌悬液浓度、体积与培养时间在一定的合适范围内，它们之间相互补充、相互配合，才能准确而高效地检测出材料的抗菌性能。
上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (3)

1.一种用于抗菌不锈钢抗菌效果的快速检测方法，由菌液配制、细菌接种、抗菌率计算三部分组成；其特征在于，用于非液态介质存在条件下的抗菌性能检测，操作步骤如下：
（1）细菌悬液制备：用接种环从新鲜培养物上刮1-2环新鲜细菌，并依次做10倍递增稀释液，选择菌液浓度为1.0×107～2.0×107CFU/mL的稀释液作为试验用菌液；
（2）细菌接种于样品表面：采用表面积为10×10 mm或表面直径为Φ10 mm的试样，开始前试样表面做灭菌处理，将样品放入24孔板中，用无菌枪头吸取3-7μL菌液滴加到每个孔中的样品表面上，铺展菌液确保细菌与样品表面的充分接触，由于表面张力的作用，使菌液完全铺平以至于表面液膜厚度几乎为0；在37±1℃、相对湿度RH＞90％条件下培养1-4 h；
（3）到达相应时间点后将样品连同其上菌液一同取出，放入离心管中，加入2-5ml的缓冲液稀释细菌悬液，充分涡旋振荡；最后吸取0.1mL的细菌悬液均匀涂布在琼脂培养基平板上，37℃恒温培养24 h，到达时间点后，取出平板进行菌落计数；
试验同时设对照样品和空白样品组；对照样品组除了以不具备抗菌功能的不锈钢样品代替实验组样品外，其它操作程序均与实验组相同；空白样品，即是稀释菌液在37±1℃、相对湿度RH＞90％条件下培养与实验组对照组相同时间，细菌自然的生长状态；
抗菌率计算公式为：R＝（A－B）/A×100
式中：
R—抗菌率；
A—对照样品表面平均回收菌数，单位CFU/片；
B—实验样品表面平均回收菌数，单位CFU/片。
2.按照权利要求1所述快速检测方法，其特征在于：所述抗菌不锈钢材料为含铜、银、稀土之一种或多种的不锈钢材料。
3.按照权利要求1所述快速检测方法，其特征在于：所用试验菌为革兰氏阳性菌和/或革兰氏阴性菌。
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