CN109395094A

CN109395094A - Pc2基因或表达pc2基因的重组病毒在制备骨关节炎治疗药物中的应用

Info

Publication number: CN109395094A
Application number: CN201811255911.3A
Authority: CN
Inventors: 曲静; 刘光慧; 任晓庆; 任若通
Original assignee: Institute of Zoology of CAS
Current assignee: Institute of Zoology of CAS
Priority date: 2018-10-26
Filing date: 2018-10-26
Publication date: 2019-03-01
Anticipated expiration: 2038-10-26
Also published as: CN109395094B

Abstract

本发明公开了PC2基因或表达PC2基因的重组病毒在制备骨关节炎治疗药物中的应用。本发明提供了PC2基因在制备用于治疗骨关节炎的药物中的应用。PC2基因为编码PC2蛋白的基因。PC2蛋白为由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质。本发明的发明人证实PC2基因在骨关节炎疾病中具有明确的治疗效果，为开发用于骨关节炎的基因治疗提供了新的思路，扩大了临床基因治疗的可选择范围，具有重大的应用推广价值。

Description

PC2基因或表达PC2基因的重组病毒在制备骨关节炎治疗药物中的应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及PC2基因或表达PC2基因的重组病毒在制备骨关节炎治疗药物中的应用。

背景技术

骨关节炎(osteoarthritis，OA)是一种常见的退行性骨关节病，是由于关节部位软骨完整性遭到破坏及软骨下骨板病变导致关节症状和体症的疾病。骨关节炎临床表现为关节疼痛、僵硬、运动功能障碍等，严重时可影响患者的生活质量。其发病机制目前尚不明确，一般认为生物力学因素、遗传学因素、环境因素等参与导致滑膜、软骨和骨的代谢改变，软骨基质中的粘多糖减少，软骨降解，进而产生炎症。

目前对于骨关节炎的治疗方法有药物治疗、非药物治病、手术治疗、基因治疗等。药物疗法常用的临床用药分为镇痛药、软骨保护剂、基质金属蛋白酶抑制剂及玻璃酸钠等关节注射药物。通过向关节腔骨直接注射药物可快速消除炎症刺激、阻断病理反射的发生和发展，缓解疼痛，促进软骨的愈合和再生，但注射本身可能会损伤软骨，不宜反复使用。非药物治疗包括健康教育以保持良好的生活习惯及积极的功能锻炼、针灸、针刀、推拿及电疗等理疗方式。非药物治疗具有损伤简单、疗效确切、副作用小、易被患者接受等特点。对于药物疗法及非药物疗法均无效的患者，必要时采取手术疗法。手术疗法包括关节冲洗及关节镜术、截骨矫形术、关节置换术、关节软骨修复术、组织工程技术、骨髓间充质干细胞移植术等。间充质干细胞(Mesenchymal stem cells，MSC)具有向软骨细胞分化的潜能，同时具有免疫调节、减轻炎症反应的活性，因此也广泛应用于骨关节炎的治疗。基因治疗是将外源正常基因导入靶细胞以补偿或纠正因基因缺陷或基因表达异常引起的疾病，具有操作简单、特异性高，治疗有效期长等优点。目前用于骨关节炎治疗的基因包括促进软骨分化和再生的Sox9、COMP，抑制炎症的IL1-Ra、IL4，抑制细胞凋亡的Bcl-2，生长因子IGF1、TGF等。

发明内容

本发明的目的是提供PC2基因或表达PC2基因的重组病毒在制备骨关节炎治疗药物中的应用。

本发明提供了PC2基因在制备用于治疗骨关节炎的药物中的应用。

本发明还保护表达PC2基因的重组病毒在制备用于治疗骨关节炎的药物中的应用。

本发明还保护慢病毒质粒pLE4-PC2、质粒psPAX2和质粒pMD2G在制备用于治疗骨关节炎的药物中的应用。

本发明还保护PC2蛋白在制备用于治疗骨关节炎的药物中的应用。

以上任一所述PC2蛋白为如下(a)或(b)或(c)：

(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(b)来源于人且与(a)具有98％以上同一性且具有相同功能的蛋白质；

(c)将(a)经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质。

以上任一所述PC2基因为编码PC2蛋白的基因。

以上任一所述PC2基因为如下1)或2)或3)的DNA分子：

1)编码区如序列表中序列2所示的DNA分子；

2)来源于人的与1)限定的DNA分子具有98％以上同一性且编码所述PC2蛋白的DNA分子；

3)在严格条件下与1)限定的DNA分子杂交且编码所述PC2蛋白的DNA分子。

以上任一所述表达PC2基因的重组病毒为表达PC2基因的重组慢病毒。所述重组慢病毒的制备方法包括如下步骤：将慢病毒质粒pLE4-PC2、质粒psPAX2和质粒pMD2G共转染哺乳动物细胞(例如293T细胞)，进行培养，然后收集病毒颗粒，即为重组慢病毒。

以上任一所述慢病毒质粒pLE4-PC2为以pLE4载体为骨架载体构建的表达PC2基因的重组质粒。以上任一所述慢病毒质粒pLE4-PC2具体为将PC2基因插入Ple4-GFP质粒得到的可以表达PC2基因的重组质粒。以上任一所述慢病毒质粒pLE4-PC2更具体为用序列表的序列2所示的DNA分子取代Ple4-GFP质粒的XhoⅠ和MluⅠ酶切位点之间的小片段，得到的表达PC2基因的重组质粒。Ple4-GFP质粒为序列表的序列3所示的环形质粒。

本发明还保护一种用于治疗骨关节炎的药物，其活性成分为以上任一所述PC2基因、以上任一所述表达PC2基因的重组病毒或以上任一所述PC2蛋白。

本发明还保护一种用于治疗骨关节炎的药物，其活性成分为以上任一所述慢病毒质粒pLE4-PC2、质粒psPAX2和质粒pMD2G。

本发明还保护以上任一所述表达PC2基因的重组病毒。

本发明还保护以上任一所述慢病毒质粒pLE4-PC2。

本发明的发明人证实PC2基因在骨关节炎疾病中具有明确的治疗效果，为开发用于骨关节炎的基因治疗提供了新的思路，扩大了临床基因治疗的可选择范围，具有重大的应用推广价值。

附图说明

图1为micro-CT检测小鼠关节微结构的示例性照片。

图2为小鼠关节处的相对骨密度结果。

图3为小鼠关节的软骨组织染色的示例性照片。

图4为各组小鼠评级打分的结果。

图5为RNA-seq测序分析的结果。

图6为qPCR验证的结果。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。所有的动物实验均获得中国科学院生物物理研究所动物福利委员会的批准。实验数据以平均值±标准差表示，用GraghPad Prism5统计软件分析，*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001。

间充质干细胞培养基：88体积份α-MEM+GlutaMAX(Invitrogen，12571071),10体积份胎牛血清(Gibco,10100-147),1体积份非必需氨基酸(Invitrogen，11140-050)，1体积份青霉素/链霉素(Invitrogen，15070-063),加入重组人成纤维细胞生长因子(JPC)并使其在体系中的浓度为1ng/ml。

293T细胞培养基：89体积份DMEM高糖培养基(Hyclone)，10体积份胎牛血清(Gibco,10100-147)，1体积份青霉素/链霉素(Invitrogen，15070-063)。

293T细胞(人胚胎肾细胞)：ATCC，CRL-3216。慢病毒包装载体psPAX2，简称质粒psPAX2，Addgene产品，#12260。慢病毒包装载体pMD2G，简称质粒pMD2G，Addgene产品，#12259。

表达萤火虫荧光素酶(luciferase，Luc)基因的过表达载体记载于文献：SIRT6safeguards human mesenchymal stem cells fromoxidative stress bycoactivating NRF2.Pan et.al,.Cell research.(2016)26:190-205.。该过表达载体是在pLE4-GFP质粒中插入Flag-luciferase基因得到的。

实施例1、重组慢病毒的制备

PC2蛋白如序列表的序列1所示。PC2基因如序列表的序列2所示。

pLE4-GFP质粒为序列表的序列3所示的环形质粒。

1、构建重组质粒

通过同源重组的方式用序列表的序列2所示的DNA分子取代pLE4-GFP质粒的XhoⅠ和MluⅠ酶切位点之间的小片段，即得到表达PC2基因的重组慢病毒质粒，又称慢病毒质粒pLE4-PC2。

2、制备PC2病毒液

(1)采用Lipo3000转染试剂盒(ThermoFisher)，将慢病毒质粒pLE4-PC2、质粒psPAX2和质粒pMD2G共转染293T细胞(配比为：每个直径为10cm的细胞培养皿转染15μg慢病毒质粒pLE4-PC2、10μg质粒pSPAX2和5μg质粒pMD2G)，采用293T细胞培养基培养8小时。

(2)完成步骤(1)后，更换为新鲜的293T细胞培养基，继续培养48-72小时。

(3)完成步骤(2)后，收集上清，采用0.22μm滤膜过滤，收集滤液。

(4)取步骤(3)得到的滤液，4℃、19400rpm离心2.5小时，弃上清，用间充质干细胞培养基重悬沉淀，即为含有表达PC2基因的重组慢病毒的病毒液，简称PC2病毒液。

3、制备Luc病毒液

用表达萤火虫荧光素酶基因的过表达载体代替慢病毒质粒pLE4-PC2，按照步骤2操作，得到Luc病毒液。Luc病毒即表达萤火虫荧光素酶基因的慢病毒。

实施例2、PC2基因对于骨关节炎的治疗作用

SPF级C57BL/6N小鼠，雄性，10周龄，体重20±2g，购买于华阜康公司。小鼠饲养条件：23℃，12小时光照/12小时黑暗，自由摄食和饮水。

步骤一、步骤二和步骤三是连续记天数的。

一、建立前交叉韧带切断诱导的骨关节炎小鼠模型

试验第1天进行手术(每只小鼠对两条后腿的关节部位均进行手术)。手术方法：小鼠麻醉，用脱毛器将小鼠腿部进行脱毛；在小鼠腿部膝盖处剪皮，露出关节部位；将小鼠转移到体式镜下，经膝关节内侧髌旁切口，逐层分离打开关节腔，将髌骨向外侧脱位后屈膝下完全暴露前交叉韧带(较细的一条白带)，用维纳斯剪在韧带中段予以切断，并剪除2mm韧带组织防止粘连愈合；生理盐水冲洗关节腔.将髌骨复位，严密缝合关节腔及皮肤；在手术部位施加青霉素，防感染。进行手术后的小鼠命名为模型鼠。

未进行手术的小鼠命名为正常鼠。

二、分组处理

PC2组(10只模型鼠)：试验第8天，小鼠左右膝关节腔中分别注射10μL PC2病毒液(含约10⁹个病毒颗粒)。

Luc组(6只模型鼠)：试验第8天，小鼠左右膝关节腔中分别注射10μL Luc病毒液(含约10⁹个病毒颗粒)。

正常组(10只正常鼠)：试验第8天，小鼠左右膝关节腔中分别注射10μL间充质干细胞培养基。

三、效果评价

试验第57天，对治疗骨关节炎的效果进行评价。

1、micro-CT检测小鼠关节微结构

试验第57天，利用micro-CT(PE公司)检测观察小鼠关节的微结构，检测小鼠关节处的骨密度。

示例性照片见图1。Luc组小鼠关节处出现了明显的损伤性空洞，骨密度降低，PC2组小鼠关节处表型与正常组小鼠一致、均未见明显损伤。

以正常组小鼠的平均骨密度作为1，计算Luc组和PC2组各个小鼠的相对骨密度，结果见图2。与正常组小鼠相比，Luc组小鼠骨密度降低，PC2组小鼠骨密度无显著差异。

2、小鼠关节的软骨组织染色

小鼠骨关节炎的表型之一是关节处软骨细胞的减少。试验第57天，处死小鼠，取左腿膝关节进行软骨的石蜡切片染色。

(1)取左腿膝关节，将肌肉和脂肪剥离干净。

(2)用4％多聚甲醛固定72小时。

(3)用甲酸脱钙液(5％甲酸，5％甲醛，90％水)进行脱钙处理，时间为7天。

(4)脱钙完全后，进行脱水，石蜡包埋，切片(切片厚度为5μm)。

(5)对切片进行脱蜡，复水。

(6)用铁苏木素(中杉金桥，ZLI-9610)染色8分钟，流水冲洗2分钟。

(7)用0.02％快绿(Sigma，S2255)染色8分钟，1％醋酸快速漂洗15秒。

(8)用0.1％番红O(Sigma，F7252)染色5分钟。

(9)脱水，封片，镜下观察。

示例性照片见图3。与正常组相比，Luc组小鼠软骨细胞明显减少。与Luc组相比，PC2组小鼠软骨细胞明显增加。

对于染色的切片，根据国际骨关节炎研究学会的标准进行评级打分，结果见图4。与Luc组相比，PC2组小鼠的关节炎程度有明显下降。

3、小鼠关节组织RNA-seq分析

试验第57天，处死小鼠，取右腿膝关节，提取RNA，进行RNA-seq测序分析。

结果见图5。

4、qPCR验证

对步骤3中各个相关基因的表达进行qPCR验证。

结果见图6。结果表明，与正常组相比Luc组大鼠中上调的基因和与Luc组相比PC2组大鼠中下调的基因的交集主要富集于炎症反应及细胞衰老相关通路；与正常组相比Luc大鼠中下调的基因和与Luc组相比PC2大鼠中上调的基因的交集主要富集于细胞增殖、骨的生长与分化相关通路。这些结果强烈支持了PC2蛋白可以通过刺激关节组织原位再生(通过调控与衰老、炎症反应、细胞增殖、骨形成相关的基因的表达)，从而改善关节炎小鼠的骨密度缺失、软骨损伤、炎症反应等症状，为基于PC2基因的关节炎治疗奠定了基础。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国科学院动物研究所

<120> PC2基因或表达PC2基因的重组病毒在制备骨关节炎治疗药物中的应用

<130> GNCYX181813

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 560

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 1

Met Glu Leu Pro Ala Val Gly Glu His Val Phe Ala Val Glu Ser Ile

1 5 10 15

Glu Lys Lys Arg Ile Arg Lys Gly Arg Val Glu Tyr Leu Val Lys Trp

20 25 30

Arg Gly Trp Ser Pro Lys Tyr Asn Thr Trp Glu Pro Glu Glu Asn Ile

35 40 45

Leu Asp Pro Arg Leu Leu Ile Ala Phe Gln Asn Arg Glu Arg Gln Glu

50 55 60

Gln Leu Met Gly Tyr Arg Lys Arg Gly Pro Lys Pro Lys Pro Leu Val

65 70 75 80

Val Gln Val Pro Thr Phe Ala Arg Arg Ser Asn Val Leu Thr Gly Leu

85 90 95

Gln Asp Ser Ser Thr Asp Asn Arg Ala Lys Leu Asp Leu Gly Ala Gln

100 105 110

Gly Lys Gly Gln Gly His Gln Tyr Glu Leu Asn Ser Lys Lys His His

115 120 125

Gln Tyr Gln Pro His Ser Lys Glu Arg Ala Gly Lys Pro Pro Pro Pro

130 135 140

Gly Lys Ser Gly Lys Tyr Tyr Tyr Gln Leu Asn Ser Lys Lys His His

145 150 155 160

Pro Tyr Gln Pro Asp Pro Lys Met Tyr Asp Leu Gln Tyr Gln Gly Gly

165 170 175

His Lys Glu Ala Pro Ser Pro Thr Cys Pro Asp Leu Gly Ala Lys Ser

180 185 190

His Pro Pro Asp Lys Trp Ala Gln Gly Ala Gly Ala Lys Gly Tyr Leu

195 200 205

Gly Ala Val Lys Pro Leu Ala Gly Ala Ala Gly Ala Pro Gly Lys Gly

210 215 220

Ser Glu Lys Gly Pro Pro Asn Gly Met Met Pro Ala Pro Lys Glu Ala

225 230 235 240

Val Thr Gly Asn Gly Ile Gly Gly Lys Met Lys Ile Val Lys Asn Lys

245 250 255

Asn Lys Asn Gly Arg Ile Val Ile Val Met Ser Lys Tyr Met Glu Asn

260 265 270

Gly Met Gln Ala Val Lys Ile Lys Ser Gly Glu Val Ala Glu Gly Glu

275 280 285

Ala Arg Ser Pro Ser His Lys Lys Arg Ala Ala Asp Glu Arg His Pro

290 295 300

Pro Ala Asp Arg Thr Phe Lys Lys Ala Ala Gly Ala Glu Glu Lys Lys

305 310 315 320

Val Glu Ala Pro Pro Lys Arg Arg Glu Glu Glu Val Ser Gly Val Ser

325 330 335

Asp Pro Gln Pro Gln Asp Ala Gly Ser Arg Lys Leu Ser Pro Thr Lys

340 345 350

Glu Ala Phe Gly Glu Gln Pro Leu Gln Leu Thr Thr Lys Pro Asp Leu

355 360 365

Leu Ala Trp Asp Pro Ala Arg Asn Thr His Pro Pro Ser His His Pro

370 375 380

His Pro His Pro His His His His His His His His His His His His

385 390 395 400

Ala Val Gly Leu Asn Leu Ser His Val Arg Lys Arg Cys Leu Ser Glu

405 410 415

Thr His Gly Glu Arg Glu Pro Cys Lys Lys Arg Leu Thr Ala Arg Ser

420 425 430

Ile Ser Thr Pro Thr Cys Leu Gly Gly Ser Pro Ala Ala Glu Arg Pro

435 440 445

Ala Asp Leu Pro Pro Ala Ala Ala Leu Pro Gln Pro Glu Val Ile Leu

450 455 460

Leu Asp Ser Asp Leu Asp Glu Pro Ile Asp Leu Arg Cys Val Lys Thr

465 470 475 480

Arg Ser Glu Ala Gly Glu Pro Pro Ser Ser Leu Gln Val Lys Pro Glu

485 490 495

Thr Pro Ala Ser Ala Ala Val Ala Val Ala Ala Ala Ala Ala Pro Thr

500 505 510

Thr Thr Ala Glu Lys Pro Pro Ala Glu Ala Gln Asp Glu Pro Ala Glu

515 520 525

Ser Leu Ser Glu Phe Lys Pro Phe Phe Gly Asn Ile Ile Ile Thr Asp

530 535 540

Val Thr Ala Asn Cys Leu Thr Val Thr Phe Lys Glu Tyr Val Thr Val

545 550 555 560

<210> 2

<211> 1683

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 2

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atccgcaagg gcagagtgga gtatctggtg aaatggagag gctggtcgcc caaatataac 120

acgtgggaac cggaggagaa catcctggac cccaggctgc tgatcgcctt ccagaacagg 180

gaacggcagg agcagctgat gggatatcgg aagagagggc cgaagcccaa accgctagtg 240

gtgcaggtgc ctacctttgc ccgtcgttcc aatgtcctga ccggcctcca ggactcctcc 300

actgacaacc gtgccaagct ggatttgggc gcgcagggga agggccaggg gcatcagtac 360

gagctcaaca gcaagaagca ccaccagtac cagccgcaca gcaaggagcg ggcgggcaag 420

cccccgccgc cgggcaagag cggcaagtac tactaccagc tcaacagcaa gaagcaccac 480

ccctaccagc ccgaccccaa aatgtacgac ctgcagtacc agggcggcca caaggaggcg 540

cccagcccca cctgcccgga cctgggggcc aagagccacc cgcccgacaa gtgggcgcaa 600

ggtgcggggg ccaaaggcta cctgggggcg gtgaagcccc tggccggtgc ggcgggtgct 660

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gtgacgggca acgggattgg gggcaagatg aagatagtca agaacaagaa caagaacgga 780

cgcatcgtga tcgtgatgag caaatacatg gagaacggca tgcaggcggt gaagatcaag 840

tccggcgagg tggcagaggg ggaggctcgc tcccccagcc acaagaagcg ggcagccgac 900

gagcgccacc ctcctgccga caggactttt aaaaaggcgg cgggcgcaga ggagaagaag 960

gtggaggcgc cgcccaagag gagggaggag gaggtgtccg gggttagcga tccgcagccc 1020

caggatgccg gctcccgcaa gctgtccccg accaaggagg cctttggaga gcagcccctg 1080

cagctcacca ccaagcccga cctgcttgcc tgggacccgg cccggaacac gcacccgccc 1140

tcacaccacc cgcacccgca cccccatcac caccaccacc accaccacca ccaccaccac 1200

gccgtcggcc tgaatctctc ccacgtgcgc aagcgctgcc tctccgagac ccacggcgag 1260

cgcgagccct gcaagaagcg gctgactgcg cgcagcatca gcacccccac ctgcctgggg 1320

ggcagcccag ccgctgagcg cccggccgac ctgccaccag ccgccgccct cccgcagccc 1380

gaggtcatcc tgctagactc agacctggat gaacccatag acttgcgctg cgtcaagacg 1440

cgcagcgagg ccggggagcc gcccagctcc ctccaggtga agcccgagac accggcgtcg 1500

gcggcggtgg cggtggcggc ggcagcggca cccaccacga cggcggagaa gcctccagcc 1560

gaggcccagg acgaacctgc agagtcgctg agcgagttca agcccttctt tgggaatata 1620

attatcaccg acgtcaccgc gaactgcctc accgttactt tcaaggagta cgtgacggtg 1680

tag 1683

<210> 3

<211> 7359

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 3

caggtggcac ttttcgggga aatgtgcgcg gaacccctat ttgtttattt ttctaaatac 60

attcaaatat gtatccgctc atgagacaat aaccctgata aatgcttcaa taatattgaa 120

aaaggaagag tatgagtatt caacatttcc gtgtcgccct tattcccttt tttgcggcat 180

tttgccttcc tgtttttgct cacccagaaa cgctggtgaa agtaaaagat gctgaagatc 240

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gttttcgccc cgaagaacgt tttccaatga tgagcacttt taaagttctg ctatgtggcg 360

cggtattatc ccgtattgac gccgggcaag agcaactcgg tcgccgcata cactattctc 420

agaatgactt ggttgagtac tcaccagtca cagaaaagca tcttacggat ggcatgacag 480

taagagaatt atgcagtgct gccataacca tgagtgataa cactgcggcc aacttacttc 540

tgacaacgat cggaggaccg aaggagctaa ccgctttttt gcacaacatg ggggatcatg 600

taactcgcct tgatcgttgg gaaccggagc tgaatgaagc cataccaaac gacgagcgtg 660

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cacttctgcg ctcggccctt ccggctggct ggtttattgc tgataaatct ggagccggtg 840

agcgtgggtc tcgcggtatc attgcagcac tggggccaga tggtaagccc tcccgtatcg 900

tagttatcta cacgacgggg agtcaggcaa ctatggatga acgaaataga cagatcgctg 960

agataggtgc ctcactgatt aagcattggt aactgtcaga ccaagtttac tcatatatac 1020

tttagattga tttaaaactt catttttaat ttaaaaggat ctaggtgaag atcctttttg 1080

ataatctcat gaccaaaatc ccttaacgtg agttttcgtt ccactgagcg tcagaccccg 1140

tagaaaagat caaaggatct tcttgagatc ctttttttct gcgcgtaatc tgctgcttgc 1200

aaacaaaaaa accaccgcta ccagcggtgg tttgtttgcc ggatcaagag ctaccaactc 1260

tttttccgaa ggtaactggc ttcagcagag cgcagatacc aaatactgtc cttctagtgt 1320

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agcccagctt ggagcgaacg acctacaccg aactgagata cctacagcgt gagctatgag 1560

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aggaagcgga agagcgccca atacgcaaac cgcctctccc cgcgcgttgg ccgattcatt 1980

aatgcagctg gcacgacagg tttcccgact ggaaagcggg cagtgagcgc aacgcaatta 2040

atgtgagtta gctcactcat taggcacccc aggctttaca ctttatgctt ccggctcgta 2100

tgttgtgtgg aattgtgagc ggataacaat ttcacacagg aaacagctat gaccatgatt 2160

acgccaagcg cgcaattaac cctcactaaa gggaacaaaa gctggagctg caagcttaat 2220

gtagtcttat gcaatactct tgtagtcttg caacatggta acgatgagtt agcaacatgc 2280

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aataaagctt gccttgagtg cttcaagtag tgtgtgcccg tctgttgtgt gactctggta 2580

actagagatc cctcagaccc ttttagtcag tgtggaaaat ctctagcagt ggcgcccgaa 2640

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atcagaaggc tgtagacaaa tactgggaca gctacaacca tcccttcaga caggatcaga 3000

agaacttaga tcattatata atacagtagc aaccctctat tgtgtgcatc aaaggataga 3060

gataaaagac accaaggaag ctttagacaa gatagaggaa gagcaaaaca aaagtaagac 3120

caccgcacag caagcggccg ctgatcttca gacctggagg aggagatatg agggacaatt 3180

ggagaagtga attatataaa tataaagtag taaaaattga accattagga gtagcaccca 3240

ccaaggcaaa gagaagagtg gtgcagagag aaaaaagagc agtgggaata ggagctttgt 3300

tccttgggtt cttgggagca gcaggaagca ctatgggcgc agcctcaatg acgctgacgg 3360

tacaggccag acaattattg tctggtatag tgcagcagca gaacaatttg ctgagggcta 3420

ttgaggcgca acagcatctg ttgcaactca cagtctgggg catcaagcag ctccaggcaa 3480

gaatcctggc tgtggaaaga tacctaaagg atcaacagct cctggggatt tggggttgct 3540

ctggaaaact catttgcacc actgctgtgc cttggaatgc tagttggagt aataaatctc 3600

tggaacagat tggaatcaca cgacctggat ggagtgggac agagaaatta acaattacac 3660

aagcttaata cactccttaa ttgaagaatc gcaaaaccag caagaaaaga atgaacaaga 3720

attattggaa ttagataaat gggcaagttt gtggaattgg tttaacataa caaattggct 3780

gtggtatata aaattattca taatgatagt aggaggcttg gtaggtttaa gaatagtttt 3840

tgctgtactt tctatagtga atagagttag gcagggatat tcaccattat cgtttcagac 3900

ccacctccca accccgaggg gacccgacag gcccgaagga atagaagaag aaggtggaga 3960

gagagacaga gacagatcca ttcgattagt gaacggatct cgacggttaa cttttaaaag 4020

aaaagggggg attggggggt acagtgcagg ggaaagaata gtagacataa tagcaacaga 4080

catacaaact aaagaattac aaaaacaaat tacaaaaatt caaaatttta tcgatggtac 4140

ctaccgggta ggggaggcgc ttttcccaag gcagtctgga gcatgcgctt tagcagcccc 4200

gctgggcact tggcgctaca caagtggcct ctggctcgca cacattccac atccaccggt 4260

aggcgccaac cggctccgtt ctttggtggc cccttcgcgc caccttctac tcctccccta 4320

gtcaggaagt tcccccccgc cccgcagctc gcgtcgtgca ggacgtgaca aatggaagta 4380

gcacgtctca ctagtctcgt gcagatggac agcaccgctg agcaatggaa gcdggtaggc 4440

ctttggggca gcggccaata gcagctttgc tccttcgctt tctgggctca gaggctggga 4500

aggggtgggt ccgggggcgg gctcaggggc gggctcaggg gcggggcggg cgcccgaagt 4560

cctccggagg cccggcattc tgcacgcttc aaaagcgcac gtctgccgcg ctgttctcct 4620

cttcctcatc tccgggcctt tcgacctgca ctctagagga tccctcgaga ccggtcgcca 4680

ccatggtgag caagggcgag gagctgttca ccggggtggt gcccatcctg gtcgagctgg 4740

acggcgacgt aaacggccac aagttcagcg tgtccggcga gggcgagggc gatgccacct 4800

acggcaagct gaccctgaag ttcatctgca ccaccggcaa gctgcccgtg ccctggccca 4860

ccctcgtgac caccctgacc tacggcgtgc agtgcttcag ccgctacccc gaccacatga 4920

agcagcacga cttcttcaag tccgccatgc ccgaaggcta cgtccaggag cgcaccatct 4980

tcttcaagga cgacggcaac tacaagaccc gcgccgaggt gaagttcgag ggcgacaccc 5040

tggtgaaccg catcgagctg aagggcatcg acttcaagga ggacggcaac atcctggggc 5100

acaagctgga gtacaactac aacagccaca acgtctatat catggccgac aagcagaaga 5160

acggcatcaa ggtgaacttc aagatccgcc acaacatcga ggacggcagc gtgcagctcg 5220

ccgaccacta ccagcagaac acccccatcg gcgacggccc cgtgctgctg cccgacaacc 5280

actacctgag cacccagtcc gccctgagca aagaccccaa cgagaagcgc gatcacatgg 5340

tcctgctgga gttcgtgacc gccgccggga tcactctcgg catggacgag ctgtacaagt 5400

aaagcggccg cgacgcgtgt cgacaatcaa cctctggatt acaaaatttg tgaaagattg 5460

actggtattc ttaactatgt tgctcctttt acgctatgtg gatacgctgc tttaatgcct 5520

ttgtatcatg ctattgcttc ccgtatggct ttcattttct cctccttgta taaatcctgg 5580

ttgctgtctc tttatgagga gttgtggccc gttgtcaggc aacgtggcgt ggtgtgcact 5640

gtgtttgctg acgcaacccc cactggttgg ggcattgcca ccacctgtca gctcctttcc 5700

gggactttcg ctttccccct ccctattgcc acggcggaac tcatcgccgc ctgccttgcc 5760

cgctgctgga caggggctcg gctgttgggc actgacaatt ccgtggtgtt gtcggggaag 5820

ctgacgtcct ttccatggct gctcgcctgt gttgccacct ggattctgcg cgggacgtcc 5880

ttctgctacg tcccttcggc cctcaatcca gcggaccttc cttcccgcgg cctgctgccg 5940

gctctgcggc ctcttccgcg tcttcgcctt cgccctcaga cgagtcggat ctccctttgg 6000

gccgcctccc cgcctggaat tcgagctcgg tacctttaag accaatgact tacaaggcag 6060

ctgtagatct tagccacttt ttaaaagaaa aggggggact ggaagggcta attcactccc 6120

aacgaagaca agatctgctt tttgcttgta ctgggtctct ctggttagac cagatctgag 6180

cctgggagct ctctggctaa ctagggaacc cactgcttaa gcctcaataa agcttgcctt 6240

gagtgcttca agtagtgtgt gcccgtctgt tgtgtgactc tggtaactag agatccctca 6300

gaccctttta gtcagtgtgg aaaatctcta gcagtagtag ttcatgtcat cttattattc 6360

agtatttata acttgcaaag aaatgaatat cagagagtga gaggaacttg tttattgcag 6420

cttataatgg ttacaaataa agcaatagca tcacaaattt cacaaataaa gcattttttt 6480

cactgcattc tagttgtggt ttgtccaaac tcatcaatgt atcttatcat gtctggctct 6540

agctatcccg cccctaactc cgcccagttc cgcccattct ccgccccatg gctgactaat 6600

tttttttatt tatgcagagg ccgaggccgc ctcggcctct gagctattcc agaagtagtg 6660

aggaggcttt tttggaggcc taggcttttg cgtcgagacg tacccaattc gccctatagt 6720

gagtcgtatt acgcgcgctc actggccgtc gttttacaac gtcgtgactg ggaaaaccct 6780

ggcgttaccc aacttaatcg ccttgcagca catccccctt tcgccagctg gcgtaatagc 6840

gaagaggccc gcaccgatcg cccttcccaa cagttgcgca gcctgaatgg cgaatggcgc 6900

gacgcgccct gtagcggcgc attaagcgcg gcgggtgtgg tggttacgcg cagcgtgacc 6960

gctacacttg ccagcgccct agcgcccgct cctttcgctt tcttcccttc ctttctcgcc 7020

acgttcgccg gctttccccg tcaagctcta aatcgggggc tccctttagg gttccgattt 7080

agtgctttac ggcacctcga ccccaaaaaa cttgattagg gtgatggttc acgtagtggg 7140

ccatcgccct gatagacggt ttttcgccct ttgacgttgg agtccacgtt ctttaatagt 7200

ggactcttgt tccaaactgg aacaacactc aaccctatct cggtctattc ttttgattta 7260

taagggattt tgccgatttc ggcctattgg ttaaaaaatg agctgattta acaaaaattt 7320

aacgcgaatt ttaacaaaat attaacgttt acaatttcc 7359

Claims

1.PC2基因在制备用于治疗骨关节炎的药物中的应用；

所述PC2基因为编码PC2蛋白的基因；

PC2蛋白为如下(a)或(b)或(c)：

(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于：

所述PC2基因为如下1)或2)或3)的DNA分子：

1)编码区如序列表中序列2所示的DNA分子；

3.表达权利要求1或2中所述的PC2基因的重组病毒在制备用于治疗骨关节炎的药物中的应用。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于：所述表达PC2基因的重组病毒为表达PC2基因的重组慢病毒。

5.慢病毒质粒pLE4-PC2、质粒psPAX2和质粒pMD2G在制备用于治疗骨关节炎的药物中的应用；慢病毒质粒pLE4-PC2为以pLE4载体为骨架载体构建的表达权利要求1或2中所述的PC2基因的重组质粒。

6.权利要求1中所述的PC2蛋白在制备用于治疗骨关节炎的药物中的应用。

7.一种用于治疗骨关节炎的药物，其活性成分为PC2基因、表达PC2基因的重组病毒或PC2蛋白；PC2基因为权利要求1或2中所述的PC2基因；PC2蛋白为权利要求1中所述的PC2蛋白。

8.一种用于治疗骨关节炎的药物，其活性成分为慢病毒质粒pLE4-PC2、质粒psPAX2和质粒pMD2G；慢病毒质粒pLE4-PC2为以pLE4载体为骨架载体构建的表达权利要求1或2中所述的PC2基因的重组质粒。

9.表达权利要求1或2中所述的PC2基因的重组病毒。

10.以pLE4载体为骨架载体构建的表达权利要求1或2中所述的PC2基因的重组质粒。