CN109394771A - （5r）-5-羟基雷公藤内酯醇在制备药物中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了（5R）‑5‑羟基雷公藤内酯醇在制备药物中的应用，特别是在制备治疗和/或预防艾滋病异常免疫激活、或者艾滋病异常免疫激活相关的免疫重建不全的药物中的应用。本发明使用(5R)‑5‑羟基雷公藤内酯醇(T8)进行实验后发现，其在艾滋病异常免疫激活、或者艾滋病异常免疫激活相关的免疫重建不全中具有免疫抑制活性，且表现为效率高、毒性低，具有很好的安全治疗指数。

Description

(5R)-5-羟基雷公藤内酯醇在制备药物中的应用
技术领域
本发明属于化学制药领域，涉及(5R)-5-羟基雷公藤内酯醇在制备药物中的应用，具体涉及(5R)-5-羟基雷公藤内酯醇在制备治疗和/或预防艾滋病异常免疫激活或者艾滋病免疫重建不全药物中的应用。
背景技术
雷公藤系卫矛科雷公藤属木质藤本植物，生于山地林缘阴湿处，分布于长江流域以南各地及西南地区，其化学成分主要是二萜、三萜、倍半萜、生物碱等。近二十年来的研究表明雷公藤具有抗炎、免疫抑制、抗生育、抗肿瘤、抗菌等活性，特别是在免疫抑制作用方面，雷公藤中的雷公藤内酯醇(triptolide)具有很强的药理活性。但是雷公藤内酯醇(triptolide)的毒副作用，限制了其在临床上的应用。专利CN1223595C发明人通过对雷公藤内酯醇构效关系的潜心研究，对雷公藤内酯醇(triptolide)结构进行改造和修饰，公开了一批新型的低毒雷公藤内酯醇衍生物，可作为抗炎免疫抑制剂，用于预防和治疗自身免疫性疾病、感染性疾病等，特别是(5R)-5-羟基雷公藤内酯醇(LLDT-8，简称为T8；其结构式如下)，在多种体外试验系统和体内实验动物模型的研究中证实具有广泛的抗炎免疫抑制活性，表现为高效低毒，具有很好的安全治疗指数。
艾滋病(AIDS，获得性免疫缺陷综合症)是因人类免疫缺陷病毒(HIV)感染引起的一种传染病，其特征为HIV病毒特异性攻击辅助T淋巴细胞(CD4+)，造成人体免疫系统的进行性破坏，最终引起各种机会性感染和相应肿瘤的发生。上世纪90年代以来，使用的高效抗逆转录病毒治疗(HAART)，能显著降低血浆HIV载量，并能有效的增加CD4+T细胞计数，使患者能够进行免疫重建，从而降低AIDS相关疾病的发生率和病死率。但最新的研究认为，HIV病毒感染是一种慢性炎症性疾病，免疫系统持续激活是艾滋病最主要的免疫病理改变，伴随HIV感染的整个过程，包括HIV感染引起CD4+T细胞的减少、病毒储存库的形成和长期维持、重建障碍，尤其是长期抗病毒成功治疗患者的并发症和较高病死率也被认为和异常免疫激活有直接或间接的关系。免疫重建指艾滋病患者、骨髓移植或其它存在严重免疫抑制的患者免疫系统功能恢复的过程。而当免疫重建过程产生障碍时称之为免疫重建不全。免疫重建不全主要发生于艾滋病患者，这些患者又被称为免疫无应答(Immunenon-responders，INRs)。对于艾滋病患者而言，免疫无应答是指经过正规抗病毒治疗2年后，病毒载量在检测下限以下，但CD4细胞不增长的情况(小于250/μL)。此类患者因易并发各种机会性感染、肿瘤等，病死率很高；异常免疫激活指的是免疫系统长期处于异常增高的激活状态。基于异常免疫激活在艾滋病的发病、抗病毒治疗效果、并发症的发生中均发挥重要作用，近年来人们已将免疫激活作为艾滋病的潜在治疗靶点进行研究，目前国内外尚未有药物可有效用于治疗或预防异常免疫激活或免疫重建不全。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是为克服现有技术中缺乏针对艾滋病异常免疫激活以及艾滋病免疫重建不全的药物的缺陷，提供一种(5R)-5-羟基雷公藤内酯醇在制备药物中的应用，特别是治疗和/或预防艾滋病异常免疫激活或者艾滋病免疫重建不全的药物中的应用。
HIV导致的免疫激活与传统意义上的病毒感染后机体产生的免疫应答和免疫激活是有差别的，目前研究表明主要的机制有：
1.直接途径：HIV基因产物(如gp120)直接激活淋巴细胞和巨噬细胞；
2.间接途径：HIV感染期间，HIV感染所致的机体免疫缺陷状态，体内某些持久感染的病原体如巨细胞病毒(CMV)、EB病毒会进行再活化与复制，从而引起免疫激活；
3.肠道菌群移位：黏膜淋巴组织中大量的CD4+T细胞丢失，会引起肠道黏膜屏障中免疫成分的破坏，从而导致肠道菌群移位，进而引起免疫激活。
4.调节性T细胞(Treg)减少：Treg对维持机体免疫系统的稳态具有重要意义，他的作用是下调免疫激活状态。其激活和转化与免疫激活和免疫重建均有密切关系。有研究表明，在长期不进展的HIV感染者中，CD4+CD25+Treg显著多于典型进展者，且Treg比例与CD8+T细胞激活亚群呈负相关。
5.CD4+T细胞焦亡：2014年Gilad Doitsh等人在Nature杂志上发表的研究表明，绝大多数(95％)HIV病毒所致的CD4+T细胞死亡，伴随着IL-1β等炎症因子和细胞内容物的释放，而这种由caspase-1介导的细胞焦亡，在进一步诱导体内未感染CD4+T细胞的聚集、感染和焦亡中，又起到促进作用，从而在体内形成了一个“焦亡--诱导未感染CD4+T细胞聚集--感染新的CD4+T细胞--新的焦亡”的恶性循环。2015年，Galloway等人的研究发表在CellReports上，他们通过一系列的实验证明：感染HIV病毒的CD4+T细胞与未感染病毒的CD4+T细胞的直接接触(形成突触连接)，是引发病毒传播和细胞焦亡的必需条件，游离的HIV病毒，即使载量很高，也不能直接引起细胞焦亡。
持续的免疫激活可产生一系列严重后果，包括HIV的持续复制和免疫重建障碍，尤其是增加AIDS患者的病死率，即使长期有效的抗病毒治疗也不能完全清除这种影响，其影响主要包括以下几个方面：
1.病毒复制：T细胞激活的直接结果是产生细胞内NF-κB，使整合入宿主基因的病毒基因转录增加，产生新的病毒颗粒，从而陷入一种恶性循环。
2.细胞凋亡：对于被活化的T细胞而言，免疫激活意味着它们将进行分化、转换甚至凋亡。免疫激活相关的细胞凋亡也被认为是外周CD4+T细胞减少的一个重要原因。
3.免疫衰老与耗竭：在获得性免疫反应中，纯真T细胞与抗原呈递细胞接触后被活化，增殖分化形成效应T细胞和记忆T细胞。但是持续的抗原刺激或其他机制导致的持续免疫激活会使效应T细胞失去功能，这个现象称为“免疫耗竭”。此外，感染者的胸腺也发生了与年龄不相称的萎缩，这意味着在胸腺中发育的T细胞无法及时补充外周消耗的T细胞。免疫激活同时也会导致骨髓造血功能下降、淋巴组织纤维化等。
4.免疫重建障碍：免疫无应答者中，尽管抗病毒治疗有效、血浆病毒复制被基本抑制，但仍存在残余病毒，可能来自病毒储存库(主要是记忆T细胞)及持续低水平的病毒复制。而这些残余病毒及其低水平复制则与持续免疫激活、免疫重建不全相关。
5.炎症相关其他异常：如骨质疏松、动脉粥样硬化、神经认知退化、衰老等，现在也被认为与免疫激活有关，导致患者病死率明显增加。
HIV感染引起的异常免疫激活及炎症是非AIDS相关疾病与免疫重建不全的重要发病机制，抑制过度的免疫激活与炎症，可能起到促进AIDS患者CD4+T淋巴细胞恢复，降低非AIDS相关疾病的发生；然而抑制过度则可能导致免疫重建不全的加重，因而寻求一种能够既能够抑制异常免疫激活、又不会加重免疫重建不全的药物至关重要；且作为药物，除治疗效果外，还需要考虑其用药安全性问题，本发明人创造性地研究并发现了(5R)-5-羟基雷公藤内酯醇(T8)对于AIDS患者过度免疫激活与炎症的抑制作用，为AIDS患者异常免疫激活或免疫重建不全及非AIDS相关疾病的治疗开创了新的治疗药物。
另外NF-κB通路的激活对HIV的复制以及潜伏再激活至关重要，并且NF-κB通路控制细胞内多种炎症因子的表达。
本发明从机制上阐明了(5R)-5-羟基雷公藤内酯醇(T8)可通过抑制NF-κB活性抑制细胞免疫激活，并且发现(5R)-5-羟基雷公藤内酯醇(T8)抑制CD4+T细胞亚群活化和增殖。
本发明主要通过以下技术手段解决上述技术问题：
本发明提供(5R)-5-羟基雷公藤内酯醇在制备治疗和/或预防艾滋病异常免疫激活、或者艾滋病异常免疫激活相关的免疫重建不全的药物中的应用。其中，艾滋病异常免疫激活与艾滋病免疫重建不全相关(刘宇超，李太生.慢性人免疫缺陷病毒感染者的免疫激活与免疫重建不全,协和医学杂志,Vol.8,No.4-5,p100-104,2017.)。
本发明中所述的艾滋病异常免疫激活优选为NF-κB相关的艾滋病异常免疫激活。
本发明中所述的艾滋病异常免疫激活优选为艾滋病慢性异常免疫激活。
本发明中，所述的药物的形式无特殊限制，可以为固体片剂、液体、凝胶、半流质或者气雾等各种物质形式，较佳地为固体片剂。
本发明中，所述的雷公藤内酯醇衍生物优选为所述药物的有效成分之一或者唯一有效成分。
本发明还提供(5R)-5-羟基雷公藤内酯醇在制备NF-κB信号通路抑制剂中的应用。所述的(5R)-5-羟基雷公藤内酯醇优选为所述药物的有效成分之一或者唯一有效成分。
本发明还提供(5R)-5-羟基雷公藤内酯醇在制备T淋巴细胞活性抑制剂中的应用。所述的(5R)-5-羟基雷公藤内酯醇优选为所述药物的有效成分之一或者唯一有效成分。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明的积极进步效果在于：
本发明使用(5R)-5-羟基雷公藤内酯醇(T8)进行实验后发现，其在艾滋病异常免疫激活、或者艾滋病异常免疫激活相关的免疫重建不全中具有免疫抑制活性，且表现为效率高、毒性低，具有很好的安全治疗指数。
附图说明
图1为(5R)-5-羟基雷公藤内酯醇抑制NF-κB活性检测结果图。
图2为(5R)-5-羟基雷公藤内酯醇对CD4+T细胞增殖抑制作用结果图。
图3为(5R)-5-羟基雷公藤内酯醇对CD4+T细胞亚群活化的抑制作用。
图4为(5R)-5-羟基雷公藤内酯醇(T8)及其对照品(甲素)细胞毒性检测。
图5为(5R)-5-羟基雷公藤内酯醇(T8)及其对照品(甲素)抑制NF-κB信号通路活性检测。
图6为(5R)-5-羟基雷公藤内酯醇(T8)及其对照品(甲素)抑制CD4+T细胞亚群免疫活化检测。新鲜分离的健康人外周血细胞PBMCs或进一步抗CD4抗体包被的磁珠通过阳性筛选分离CD4+T细胞，利用PMA(100nM)及Ionomycin(1μM)刺激或包被抗CD3/CD28抗体的磁珠刺激细胞活化72小时，同时加入T8或甲素(100ng/mL)；收集细胞，抗CD4-PE抗体染色选定CD4+T细胞，流式细胞术检测细胞表面CD38和HLA-DR表达。图6A为多次完全独立重复流式细胞术检测结果；图6B为流式细胞术检测统计结果，分别统计阳性细胞率和计算平均荧光强度(MFI)。利用成对student t-test分析显著性差异。
图7为T8或甲素抑制CD4+T细胞增殖检测。PBMCs利用CFSE染色；加入PHA-P(5μg/mL)刺激细胞增殖，同时加入待检测化合物T8或甲素(100ng/mL)；72小时后，收集细胞，抗CD4-PE抗体染色选定CD4+T细胞，流式细胞术检测CFSE分析细胞增殖。(A)三次完全独立重复流式细胞术检测结果；(B)流式细胞术检测统计结果。利用成对student t-test分析显著性差异。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
实施例1T8抑制NF-κB活性检测
在HEK293T细胞(购自ATCC)中转染含有NF-κB驱动的荧光酶素表达质粒(p3κB-luc，100ng)以及内参质粒pBgal(购自生物在线www.bioon.com.cn)(pSV-β-GalactosidaseControl Vector,β半乳糖苷酶表达质粒，5ng)；24小时后细胞利用TNF-alpha(20ng/ml)处理或未处理，并同时加入或不加T8化合物(100nM)；再过24小时后收集细胞，利用reporterlysis buffer(购自Promega)裂解；Luciferase assay system(Promega)检测荧光素酶活性，Beta-Glo Asaay system(Promega)检测β-Galactosidase活性，分析T8对NF-κB活性的抑制作用。
检测结果如图1所示，该试验结果表明(5R)-5-羟基雷公藤内酯醇抑制NF-κB活性，不仅可有效抑制本底NF-κB活性(未用TNF-alpha处理)，也可以有效抑制TNF-alpha激活的NF-κB活性。
实施例2T8对CD4+T细胞增殖抑制作用
健康人外周血单个核细胞(PBMC)(购自ATCC)利用含有IL-2(20IU)的RPMI-1640/10％FBS血清的培养基培养，利用CFSE(羟基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂)(10nM)37℃染色10分钟，使用上述培养基洗涤2次后加入PHA-P(植物血凝素P)(5μg/ml)刺激细胞增殖，同时加入或不加T8化合物(100nM)，48小时培养后收集细胞，利用抗人CD4流式抗体(购自Invitrogen)染色(4℃、30min)，流式细胞术选出CD4+T细胞检测CFSE染色强度分析细胞增殖。
检测结果如图2所示，检测结果表明(5R)-5-羟基雷公藤内酯醇抑制PHA刺激的CD4+T细胞增殖(细胞增殖由16.6％降为本底增殖1.9％)。
实施例3T8对CD4+T细胞亚群活化的抑制作用
健康人外周血单个核细胞(PBMC)1×107利用PMA(丙二醇甲醚醋酸酯)(20nM)及Ionomycin(伊屋诺霉素)(1μM)在37℃下刺激，同时加入或不加T8化合物(100nM)；48小时后，加入抗人CD4、CD38、HLA-DR细胞流式抗体染色(购自Invitrogen)，流式细胞术选出CD4+T细胞检测细胞表面分子CD38、HLA-DR的表达。
检测结果如图3所示，检测结果表明(5R)-5-羟基雷公藤内酯醇抑制PMA+Ionomycin诱导的细胞活化(CD38由41.6％降为31％；HLA-DR由36.3％降为3.5％)。
对比例1(5R)-5-羟基雷公藤内酯醇(T8)及其对照品(甲素，即雷公藤内酯醇)细胞毒性检测
1、实验材料
1)待检测化合物
(5R)-5-羟基雷公藤内酯醇(T8)及其对照品(甲素)，由上海医药集团提供；白色粉末，纯度>99％，4℃保存备用；
配制方法：利用DMSO配制母液，使用培养基(RPMI1640，Gibco)配制工作液。细胞培养时DMSO终浓度<0.02％，该DMSO浓度对细胞生长无影响。
2)细胞及试剂
HEK293T培养在完全DMEM培养基中，其含10％胎牛血清，100U/mL盘尼西林和100μg/mL链霉素；
DMEM培养基和胎牛血清购自Gibco公司；盘尼西林和链霉素购自Invitrogen公司；
MTT[3-(4,5)-dimethylthiahiazo(-z-y1)-3,5-di-phenytetrazoliumromide]、SDS(Sodium dodecyl sulfate，十二烷基磺酸钠)、DMF(N，N-Dimethyl formamine，N，N-二甲基甲酰胺)均购自sigma公司；
MTT(Formazan)溶解液(100mL)：SDS(Sodium dodecyl sulfate，十二烷基磺酸钠)10g；DMF(N，N`-Dimethyl formamine，N，N-二甲基甲酰胺)50mL；H2O 50mL，加热搅拌均匀，4℃保存。
2、实验方法
利用MTT比色法检测细胞毒性：将HEK293T细胞铺至96孔板(1×104/100μL/well)中，加入100μL不同浓度的化合物(化合物浓度见图例)，每个稀释度三个重复孔，同时设置不含化合物的对照孔。在37℃，5％CO2细胞培养箱内孵育72小时；每孔吸弃100μL上清，加入20μL的MTT溶液(5mg/mL)，在37℃，5％CO2细胞培养箱内孵育4小时，然后每孔加入100μL的Formazan溶解液在培养箱中孵育过夜，直至普通光学显微镜下观察发现Formazan全部溶解，595nm处测定吸光度。计算得到CC50值(50％Cytotoxic Concentration)，即对50％的HEK293T细胞产生毒性时的实验药物浓度。
3、实验结果
利用HEK293T细胞检测两种化合物的细胞毒性，发现：5R)-5-羟基雷公藤内酯醇(T8)对HEK293T细胞的CC50(50％Cytotoxic Concentration)值约为435ng/ml，而对照品(甲素)对HEK293T细胞CC50值约为17ng/ml。可见，与甲素相比，T8显示出更低的细胞毒性(详见图4)。
对比例2(5R)-5-羟基雷公藤内酯醇(T8)及其对照品(甲素)抑制NF-κB信号通路活性检测
1、实验材料
1)待检测化合物同上
2)细胞及试剂
HEK293T培养在完全DMEM培养基中，其含10％胎牛血清，100U/mL盘尼西林和100μg/mL链霉素；
DMEM培养基、胎牛血清及OPTI-MEM购自Gibco公司；盘尼西林和链霉素购自Invitrogen公司；TNF-α购自R&D公司；lipofectamine 2000 Transfection Reagent购自Life Technologies公司；Luciferase assay system及Glo Asaay system购自Promega公司；
pSV-β-Galactosidase Control Vector质粒来自Promega公司(CATALOG#E1081)。
2、实验方法
将NF-κB报告基因质粒p3κB-luc转染至HEK293T细胞中表达，同时共转染pSV-β-Galactosidase Control Vector作为转染内参，通过TNF-α处理诱导NF-κB的活化，加入T8及甲素，通过检测荧光素酶活性来指示NF-κB报告基因表达，评价T8及甲素对TNF-α诱导的NF-κB活化作用影响；
细胞转染：利用lipofectamine 2000Transfection Reagent按试剂说明书转染HEK293T细胞。24孔细胞培养板每孔使用1μL转染试剂转染100ng质粒；分别用50μL OPTI-MEM培养基对质粒和转染试剂进行稀释并混合；混合液室温静置5分钟后，将混合液加入到每孔细胞中，轻轻混匀后放回37℃培养箱继续培养至指定时间；
荧光素酶活性检测：HEK293T细胞转染NF-κB报告基因质粒p3κB-luc质粒(100ng)、内参质粒pSV-β-Galactosidase Control Vector(5ng)，24小时后，加入(或不加入)TNF-α(20ng/mL)刺激24小时，收集细胞利用reporter lysis buffer裂解，随后利用Luciferaseassay system检测luciferase活性，并利用Beta-Glo Asaay system检测β-Galactosidase活性。
3、实验结果
根据图5可以看出，(5R)-5-羟基雷公藤内酯醇(T8)及其对照品(甲素)都能够有效抑制本底NF-κB信号通路活性，两者活性相当，抑制本底NF-kB活性显著性差异分析P＝0.1，没有显著性差异；(5R)-5-羟基雷公藤内酯醇(T8)及其对照品(甲素)能够有效抑制TNF-α激活的NF-κB信号通路活性，两者活性相当，抑制TNF-α激活的NF-kB活性显著性差异分析P＝0.056，没有显著性差异。
对比例3(5R)-5-羟基雷公藤内酯醇(T8)及其对照品(甲素)抑制免疫细胞活化检测
1、实验材料
1)待检测化合物同上
2)细胞及试剂：
外周血单核细胞(Peripheral blood mononuclear cells,PBMCs)从上海市长海医院购买，细胞培养在含有10％胎牛血清、100U/mL盘尼西林、100μg/mL链霉素，20IU/mLIL-2(R&D)的完全RPMI-1640培养基中。
RPMI-1640培养基、胎牛血清购自Gibco公司；盘尼西林和链霉素购自Invitrogen公司；IL-2购自R&D公司；佛波酯(Phorbol 12-Myristate 13-Acetate,PMA)和离子霉素(Ionomycin)购自Sigma公司，anti-CD3/CD28抗体和CD4 antibody-coated microbeads购自MACS公司，流式抗体CD3、CD4、CD38、HLA-DR购自eBioscience公司。
2、实验方法：
新鲜分离的健康人外周血细胞PBMC(3×107)培养于含有IL-2(20IU/mL)的细胞培养基；利用PMA(100nM)及Ionomycin(1μM)刺激72小时，同时加入待检测化合物(100ng/mL)；FACS buffer清洗两次，加入抗CD3-PerCP、CD4-PE、CD38-PE-Cy7、HLA-DR-APC抗体，4℃染色30分钟；FACS buffer清洗两次，FACS检测上述分子的表达。
新鲜分离的健康人外周血细胞PBMCs，利用抗CD4抗体包被的磁珠通过阳性筛选分离CD4+T细胞，培养于含有IL-2(20IU/mL)的培养基；利用包被抗CD3/CD28抗体的磁珠刺激细胞活化72小时，同时加入待检测化合物；收集细胞，FACS buffer清洗两次，加入抗CD3-PerCP、CD4-PE、CD38-PE-Cy7、HLA-DR-APC抗体，4℃染色30分钟；FACS buffer清洗两次，收集细胞flow cytometry分析上述分子的表达。
3、实验结果
通过检测细胞活化指标CD38和HLA-DR表达，证明(5R)-5-羟基雷公藤内酯醇(T8)及其对照品(甲素)能够显著抑制PMA+Ionomycin或anti-CD3/CD28抗体激活CD4+T细胞亚群的免疫活化；
(5R)-5-羟基雷公藤内酯醇(T8)及其对照品(甲素)抑制CD4+T细胞亚群免疫活化效果相当(详见图6)。
对比例4
1、实验材料：
1)待检测化合物同上
2)细胞及试剂：
外周血单核细胞(Peripheral blood mononuclear cells,PBMCs)从上海市长海医院购买，细胞培养在含有10％胎牛血清、100U/mL盘尼西林、100μg/mL链霉素，20IU/mLIL-2(R&D)的完全RPMI-1640培养基中。细胞在含有5μg/mL植物凝集素(Phytohemagglutinin-P,PHA-P)的完全培养基中培养72小时，诱导CD4+T细胞增殖。
RPMI-1640培养基、胎牛血清购自Gibco公司；盘尼西林和链霉素购自Invitrogen公司；IL-2购自R&D公司；PHA-P购自Sigma公司；CFSE染料购自abcam公司；抗CD4-PE抗体购自eBioscience。
2、实验方法：
新鲜分离的健康人外周血细胞PBMC(1×107)培养于含有IL-2(20IU/mL)的细胞培养基；CFSE(10nM)，37℃染色10分钟；培养基洗涤两次后，加入PHA-P(5μg/mL)，同时加入待检测化合物T8或甲素(各100ng/mL)；37℃，72小时后，收集细胞，抗CD4-PE抗体4℃染色30分钟，FACS buffer清洗两次，流式细胞术分析细胞增殖。
3、实验结果
根据图7可以看出(5R)-5-羟基雷公藤内酯醇(T8)及其对照品(甲素)能够显著抑制健康人外周血CD4+T细胞的增殖，且对抑制健康人外周血CD4+T细胞增殖效果相当。

Claims (9)

1.(5R)-5-羟基雷公藤内酯醇在制备治疗和/或预防艾滋病异常免疫激活、或者艾滋病异常免疫激活相关的免疫重建不全的药物中的应用。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的艾滋病异常免疫激活为NF-κB相关的艾滋病异常免疫激活。
3.如权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述的艾滋病异常免疫激活为艾滋病慢性异常免疫激活。
4.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的药物的形式为片剂。
5.如权利要求1～4所述的应用，其特征在于，所述的(5R)-5-羟基雷公藤内酯醇为所述药物的有效成分之一或者唯一有效成分。
6.(5R)-5-羟基雷公藤内酯醇在制备NF-κB信号通路抑制剂中的应用。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的(5R)-5-羟基雷公藤内酯醇为所述药物的有效成分之一或者唯一有效成分。
8.(5R)-5-羟基雷公藤内酯醇在制备T淋巴细胞活性抑制剂中的应用。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述的(5R)-5-羟基雷公藤内酯醇为所述药物的有效成分之一或者唯一有效成分。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1223595C (zh) * 2002-12-27 2005-10-19 中国科学院上海药物研究所 雷公藤内酯醇衍生物及其应用
CN103083334B (zh) * 2012-12-20 2014-12-17 李太生 雷公藤多甙对治疗免疫重建不全的新用途

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111821295A (zh) * 2019-04-15 2020-10-27 中国科学院上海药物研究所 (5r)-5-羟基雷公藤内酯醇在制备治疗和/或预防皮肤炎症药物中的应用
CN111202738A (zh) * 2020-02-10 2020-05-29 复旦大学附属中山医院 (5r)-5-羟基雷公藤内酯醇在制备脓毒症治疗药物中的用途

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