CN109394742A - 二甲双胍作为AChE激活剂的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及AChE激活剂技术领域，具体涉及二甲双胍作为AChE激活剂的应用。二甲双胍是糖尿病人常用降血糖药，但关于二甲双胍对AChE的作用在现有的研究中并不确定，有研究者认为二甲双胍在不同研究中对AChE活性的不同作用是由于作用浓度的不同。本发明通过体外实验证明二甲双胍在0.003～0.122μmol/mL浓度范围内对AChE具有较好的线性激动作用，故其可作为AChE的激活剂。

Description

二甲双胍作为AChE激活剂的应用

技术领域

本发明涉及AChE激活剂技术领域，具体涉及二甲双胍作为AChE激活剂的应用。

背景技术

乙酰胆碱酯酶(Acetylcholinesterase，AChE)是生物神经传导的重要酶，也是生物体内神经信号正常传递不可缺少的酶。它是一种分泌型羧酸酯酶，能够水解神经递质乙酰胆碱(Acetylcholine，ACh)，将ACh水解成胆碱(Choline，Ch)和乙酸。AChE也是动物中枢神经系统的一种催化酶，其作用底物乙酰胆碱能维持意识的清醒，在学习记忆中起重要作用，AChE的含量过高或过低均会引起人体一系列的异常反应。

二甲双胍为双胍类口服降血糖药。具有多种作用机制，包括延缓葡萄糖由胃肠道的摄取，通过提高胰岛素的敏感性而增加外周葡萄糖的利用，以及抑制肝、肾过度的糖原异生，不降低非糖尿病患者的血糖水平。本品与胰岛素合用，可减少胰岛素用量，防止低血糖发生。可与磺酰脲类降血糖药合用，具协同作用。

流行病学和病理生理学研究结果表明，Ⅱ型糖尿病患者相比而言更容易患阿尔茨海默病(AD)。在这两种病症中，病人的血糖水平、胰岛素抵抗以及炎症和氧化应激等都很相似。AChE活性的增强是导致AD神经变性的原因之一。目前关于糖尿病常用药二甲双胍对AChE的活性影响是未知的。

发明内容

针对上述关于二甲双胍对AChE活性影响的未知性，本发明提供二甲双胍作为AChE激活剂的应用，本发明通过体外实验证明了在一定剂量浓度下，二甲双胍可以作为AChE的激活剂，增强AChE的酶活性。

本发明的技术方案是：

本发明提供二甲双胍作为AChE激活剂的应用。

优选的，所述二甲双胍作为AChE激活剂的应用浓度为0.003～0.122μmol/mL。

进一步，所述二甲双胍激活AChE的反应的米氏常数K_m为0.506μmol/mL。

进一步，上述二甲双胍作为AChE激活剂的应用包括将二甲双胍加入到具有激活AChE作用的药物中。

一种激活AChE的药物组合物，包括二甲双胍，所述二甲双胍以治疗有效量存在于一种药物载体、赋形剂或稀释剂中。

进一步，上述的激活AChE的药物组合物的剂量形式可以是片剂、胶囊剂、溶液或者吸入剂。

有益效果：

本发明提供了二甲双胍作为AChE激活剂的应用。二甲双胍是糖尿病人常用降血糖药，也有报导表明它对某些肿瘤细胞的生长有抑制作用，具有抗癌前景。关于二甲双胍对AChE的作用在现有的研究中并不确定。

本发明通过体外实验证明二甲双胍在一定浓度范围内是AChE的激活剂。盐酸二甲双胍在0.003～0.122μmol/mL浓度范围内对AChE具有较好的线性激活作用，故其可作为AChE的激活剂。随盐酸二甲双胍溶液浓度的增大，激活作用逐渐增强，超出线性浓度后激活作用逐渐减弱。

本发明所进行的体外实验补充了现有的研究的不足，并且提供了在0.003～0.122μmol/mL浓度范围内二甲双胍可以作为AChE的激活剂的应用。

附图说明

图1是盐酸二甲双胍红外光谱图：

图中，横坐标是波数，纵坐标是透射率；

图2是盐酸二甲双胍的紫外吸收光谱图：

图中，横坐标是波长(nm)，纵坐标是吸光度(A)；

图3是盐酸二甲双胍对AChE酶活的影响结果图：

图中，横坐标是盐酸二甲双胍的浓度(μmol/mL)，纵坐标是AChE相对活性(％)；

图4是Lineweaver-Burk(L-B)双倒数图：

图中，直线1和2的盐酸二甲双胍浓度分别为0.000和0.105μmol/mL，横坐标表示[S]^-1，纵坐标表示ν^-1。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明的实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例一：二甲双胍对AChE活性影响的确定

本发明选用试剂盒法进行AChE活性的测定，试剂盒法其实就是改良后的Ellman法，AChE水解乙酰胆碱生成胆碱及乙酸，水解产物胆碱的数量可反应AChE的活力，而胆碱可以与巯基发生显色剂反应，生成TNB(对称三硝基苯，Sym-Trinitrobenzene)黄色化合物，根据反应液颜色深浅进行比色定量。该法灵敏度高，简便快速，准确稳定，无需气相色谱等高级仪器，只需一般分光光度计即可。试剂盒检测的结果需要测定波长为412nm条件下的吸光度。本实验以人的血清为AChE的酶原，氯化乙酰硫代胆碱(ATCl)为底物，探索二甲双胍对AChE活性的影响。

实验试剂：AChE测试盒(南京建成生物研究所)，盐酸二甲双胍(Aladdin)，血清(云南省玉溪市中心血站)，氯化乙酰硫代胆碱(Sigma)，磷酸氢二钠、磷酸二氢钾和氢氧化钠等试剂均为分析纯(汕头市西陇化工厂公司)。

1实验条件及参数探索

1.1二甲双胍纯度鉴定

取盐酸二甲双胍粉剂适量，研细，取细粉适量，用溴化钾压片，录制其红外光谱图，结果如图1所示。实验所测得样品的红外光谱图与国家药典委员会颁布的《药品红外光谱集》中的盐酸二甲双胍的对照谱(光谱号631)一致，说明本实施例使用的盐酸二甲双胍的纯度是符合实验要求的。

1.2对二甲双胍进行光谱扫描

准确称取盐酸二甲双胍0.0015g，溶解并定容至25mL容量瓶中。以蒸馏水为参比，在200nm～800nm波长范围内进行光谱扫描，绘制紫外吸收光谱，结果如图2所示。由结果图可知，波长233nm处为盐酸二甲双胍的最大吸收峰，且在412nm处基本无吸收，可忽略其影响。因此，盐酸二甲双胍本身的吸收峰不会影响后续实验结果的检测。

1.3血清最适取样量的探索

测定不同取样量(设定为a*)下的人的血清中AChE的活力，按试剂盒测试说明方法测定，测定方法如表1所示：

表1酶活力测定步骤

混匀，静置15分钟，波长412nm，光径1cm，双蒸水调零，测各管吸光度OD值，721型可见分光光度计测定各管吸光度OD值。

试剂盒法中定义每亳升血清样本在37℃保温6分钟，水解反应体系中lμmol基质为1个活力单位。测定管(test tube)、对照管(control tube)、空白管(black tube)、标准管(standard tube)中数据分别标记为：ODt、ODc、ODs、ODb，每组进行3个重复，酶活力按下述公式进行计算：

实验结果如表2所示：

表2最适血清用量的筛选

相对标准偏差(RSD，relative standard deviation)：标准偏差与测量结果算术平均值的比值，即：相对标准偏差(RSD)＝标准偏差(SD)/计算结果的算术平均值(X)×100％，可在检验检测工作中分析结果的精密度。当RSD≤2％时，实验所得结果精密度较高，故35μL为最适取样量。

1.4PBS的最适酸碱度探索

使用试剂盒检测AChE的酶活力时，需要在反应体系中加入用PBS稀释的底物和标准品，也会使用PBS来定量反应总体积。PBS的pH值会影响体系中的酶动力催化反应，所以使用AChE检测试剂盒前有必要对体系PBS最适的pH值进行探索。

称取3.4002g KH₂PO₄加入少许双重蒸馏水溶解，定容至250mL容量瓶中，配制成0.10mol/LKH₂PO₄溶液(A液)待用。称取8.9535g Na₂HPO₄·12H₂O，加入少许双重蒸馏水溶解，定容至250mL，配制成0.10mol/LNa₂HPO₄溶液(B液)，待用。量取1.5mL H₃PO₄(AR)，稀释至100mL，配制成0.10mol/L磷酸溶液。称取0.4g氢氧化钠固体溶至100mL配置成0.10mol/L氢氧化钠溶液。用上述已配制好的溶液分别配制pH值为7.40、7.50、7.60、7.70、7.80、7.90、8.00、8.10、8.20的0.10mol/LPBS溶液，高压下蒸气灭菌(至少60分钟)，待冷却至室温，保存于4℃冰箱中。在AChE测试盒的测活体系中，分别加入不同pH值的PBS溶液，其他相同，进行酶与底物的反应。重复3次实验。筛选结果如表3所示：

表3 pH值的筛选

通过对在不同pH值的PBS溶液下的AChE的活性体系进行筛选，确定选用pH＝7.90的0.10mol/L PBS溶液。

2二甲双胍对AChE活性影响的确定

2.1在不同浓度的二甲双胍下AChE相对活性的测定

精密称取盐酸二甲双胍0.0300g，溶于50mL的蒸馏水中，配制成每1mL中含盐酸二甲双胍600μg的标准储备液(3.623μmol/mL)。精密量取储备液345、621、897、1173、1449、1725μL分别加入50mL的容量瓶中(浓度分别为0.025、0.045、0.065、0.085、0.105、0.125μmol/mL)定容后摇匀，备用。

二甲双胍为效应物，在AChE测试盒的测活体系中，分别加入不同浓度的二甲双胍，测定二甲双胍对AChE酶活力的影响，测定方法如表4所示：

表4二甲双胍对AChE活性影响测定方法

混匀，静置15min，设置参数：波长412nm，光径1cm，超纯水调零，测各管吸光度OD值。

2.2不同浓度二甲双胍激活率的测定

2.2.1对照试验

ATCl不稳定，容易在水浴过程中发生非酶催化水解，产生的硫代胆碱与DTNB结合，干扰正常实验结果，并且显色剂自身也会进行光吸收。因此，有必要进行对照试验以排除上述干扰因素。

取35μL的生理盐水于试管中，加入35μL双重蒸馏水，加入500μL的PBS(代替底物缓冲液)，加入500μL的显色剂，混匀后，在37℃下准确反应6分钟。反应之后加入30μL抑制剂和100μL透明剂，混匀后静置15分钟，在波长412nm下测定其吸光度值，作为对照管记为OD_空白。

取35μL的血清样品于试管中，加入35μL双重蒸馏水，加入500μL浓度为1μmol/mL的ATCl溶液作为底物，按照上述方法操作，作为对照管记为OD_对照。

2.2.2不同浓度的二甲双胍激活率的计算

取35μL的血清于试管中作为AChE的酶原，加入35μL的不同浓度的盐酸二甲双胍溶液，加入500μL1μmol/mL的ATCl溶液，最后加入500μL的显色剂，重复上述操作，测定其吸光度值，作为不同浓度下的二甲双胍的测定管，记为OD_测定。

通过紫外谱图分析知，由于盐酸二甲双胍在412nm处基本无吸收，可忽略其吸光度值的影响。故每个样品仅需做一个本底扣除，即用上述的空白管调零。每个浓度做3组平行测试，取平均值。激活率计算公式如下：

2.3Lineweaver-Burk(L-B)双倒数图的绘制

按照表1实验方法测定，用pH＝7.90的0.10mol/L PBS溶液配置浓度为分别为0.25、0.50、0.75、1.00、1.25μmol/mL的氯化乙酰硫代胆碱溶液代替底物缓冲液，并加入35μL浓度为0.105μmol/mL的盐酸二甲双胍溶液，在412nm处测定其吸光度，同时按照相同方法测定空白组吸光度。在准确反应6min的条件下，测定此反应的OD值在单位时间内的变化，从而确定反应速率。以底物浓度的倒数(1/[s])为横坐标，速度倒数(1/ν)为纵坐标作图，即Lineweaver-Burk(L-B)双倒数作图法，以确定二甲双胍对AChE活性的影响。

3实验结果

如表5和图3所示，盐酸二甲双胍在0.003～0.122μmol/mL浓度范围内，B/B0％(相对活性)均在100％以上。结果表明随着二甲双胍浓度的增大，酶活力均逐渐增加，浓度为0.085和0.105μmol/mL的盐酸二甲双胍可以将AChE激活约35％以上。盐酸二甲双胍在浓度较低的情况下激活程度较小，0.025μmol/mL时才激活约10％，在盐酸二甲双胍的浓度超过0.003～0.122μmol/mL后，激活能力下降。

表5在不同浓度的二甲双胍下AChE的相对活性

注：B为添加了二甲双胍的管的OD值，B0为不添加二甲双胍的管的OD值，B/B0(％)为相对活性。

如表6所示，盐酸二甲双胍在0.003～0.122μmol/mL浓度范围内，激活率均为正值，表明盐酸二甲双胍对人血清中的AChE活性呈现激活作用。

表6不同浓度二甲双胍的平均激活率

由Lineweaver-Burk(L-B)双倒数曲线法测定的实验结果如表7、表8和表9所示。

表7不同底物浓度下(二甲双胍浓度为0μmol/mL)的吸光度

表8不同底物浓度下(二甲双胍浓度为0.105μmol/mL)的吸光度

表9不同底物浓度下的反应速率

如图4所示，在一定范围内ν^-1与[S]^-1成正比，即ν^-1与[S]^-1间存在良好的线性关系，说明AChE为米氏酶，满足米氏方程：V＝V_max/(K_m+[s])，并由公式求得米氏常数K_m为0.506μmol/mL。图4的结果为相交于一点在第二象限的一组直线，横轴截距和纵轴截距都因二甲双胍浓度的变化而改变，随着二甲双胍浓度增大，K_m值减小而V_max值增大，其激活机理表现为混合性效应。

本实施例以血清为AChE的酶源，通过试剂盒法探究了不同浓度的盐酸二甲双胍对AChE活性的影响。通过实验证明：盐酸二甲双胍在0.003～0.122μmol/mL浓度范围内有较好的线性，且不同浓度的盐酸二甲双胍(0.025、0.045、0.065、0.085、0.105μmol/mL)对AChE活性呈不同程度的激活作用，故其可作为AChE的激活剂。随盐酸二甲双胍溶液浓度的增大，激活作用逐渐增强，超出线性浓度后激活作用逐渐减弱。目前AChE抑制剂的研究已成为治疗早老性痴呆药物开发中的热点，二甲双胍在抗癌效益上也备受关注。本实验的研究结果可以为二甲双胍用于临床治疗的剂量提供一定的实验依据。

本发明未详述之处，均为本技术领域技术人员的公知技术。最后说明的是，以上实施例仅用于说明解释本发明的技术方案而非限制，对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (6)

1.二甲双胍作为AChE激活剂的应用。

2.根据权利要求1所述的二甲双胍作为AChE激活剂的应用，其特征在于：所述二甲双胍作为AChE激动剂的应用浓度为0.003～0.122μmol/mL。

3.根据权利要求1所述的二甲双胍作为AChE激活剂的应用，其特征在于：所述二甲双胍激活AChE的反应的米氏常数K_m值为0.506μmol/mL。

4.根据权利要求1-3任意一项所述的二甲双胍作为AChE激活剂的应用，其特征在于：所述应用包括将二甲双胍加入到具有激活AChE作用的药物中。

5.一种激活AChE的药物组合物，其特征在于：包括二甲双胍，所述二甲双胍以治疗有效量存在于一种药物载体、赋形剂或稀释剂中。

6.根据权利要求5所述的激活AChE的药物组合物，其特征在于：所述的药物组合物的剂量形式可以是片剂、胶囊剂、溶液或者吸入剂。