CN109392700A - 一种玉米×水稻远缘杂交育成双单倍体的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种植物育种技术，特别涉及一种玉米×水稻远缘杂交育成双单倍体的方法，本申请的步骤如下：以玉米杂交种为母本，以水稻品种为父本，通过远缘杂交获得玉米单倍体，并经染色体加倍液处理，获得双单倍体玉米植株。采用该方法能有效提高双单倍体诱导效率，应用价值大。本发明还提供了一种刷子装置，以注射器为原装置，经过简单改良，使刷子具有量取液体、注射和涂刷的功能。

Description

一种玉米×水稻远缘杂交育成双单倍体的方法

【技术领域】

本发明属于植物育种技术领域，特别涉及一种玉米×水稻远缘杂交育成双单倍体的方法。

【背景技术】

玉米是禾本科玉蜀黍属一年生草本植物，是世界上重要的粮、饲、经作物，在我国的广泛种植，是我国三大粮食作物之一。它不仅是重要的粮食作物，也是重要的饲料来源和工业原料，是畜牧业赖以发展的重要基础，利用它进一步加工利用，在食品、化工、医药、纺织、造纸等工业生产中制造种类繁多的产品，如玉米淀粉、玉米制糖、玉米油等。

玉米生产和科研的可持续发展，对保障世界和中国的粮食安全具有重大战略意义。以杂交育种为主要手段的常规技术为农业生产培育了大批优良的玉米品种，极大地提高了玉米产量和品质，为人民生活的改善和国民经济的发展作出了重大的贡献。然而，常规育种方法周期长，工作量大，育成一个品种往往需要6-8年甚至更长的时间。而由于市场需求、病害以及生产环境等的不断变化，通过较长时间选育出的品种，已经不能够满足现实消费和生产的需要。因此，加快新品种的选育进程、缩短育种时间是玉米育种技术、方法上要突破的重点之一。

作物双单倍体(Doubled Haploid，DH)技术属于细胞和染色体工程技术，是一种快速、高效、安全的育种新技术，主要有4大突出优点：快速稳定，可使任意育种后代材料1年纯合稳定；应用范围广，DH育种技术可与所有育种方法任意结合；大幅减少对育种经验的依赖；加速突破性优异种质创新。

双单倍体植株是由单倍体植株通过染色体加倍而来，因此要获得双单倍体，首先必须获得单倍体植株。在玉米育种领域中，单倍体育种方法有：花药培养、花粉培养、ig、Stock单倍体技术和化学物质诱导孤雌生殖。其中，通过花药或花粉培养，获得单倍体植株的方法，由于只在某些基因型个体中成功培育，因此具有局限性。目前，育种上生产双单倍体常用的方法是：采用高频诱导系玉米品种为父本，以杂交组合为母本，通过杂交技术获得单倍体，再经自然加倍或秋水仙素溶液处理，获得玉米双单倍体。比如，专利20130497188.0《一种玉米单倍体植株染色体组加倍的方法》，通过用秋水仙素溶液注射处理单倍体玉米植株茎尖生长点，获得染色体加倍的玉米种子；再如专利20150503664.4《一种玉米单倍体染色体体组加倍的方法》，通过以农大高诱1号为父本，以CML496×PLS杂交组合为母本，杂交获得玉米单倍体种子，再将单倍体植株幼苗放于秋水仙素溶液中培养，获得双单倍体植株。然而，从一个杂交组合诱导成双单倍体的效率很低，只有不到10％，且常用加倍剂秋水仙素对植物毒害大、容易使染色变异。

【发明内容】

本发明针对上述的问题，本发明提供了一种玉米×水稻远缘杂交育成双单倍体的方法，以玉米品种为母本，水稻品种为父本，通过远缘杂交获得玉米单倍体，并经染色体加倍液进行加倍，获得双单倍体玉米植株。采用本发明方法获得的双单倍体诱导率较高，为实际应用提供较大价值。

为达到上述目的，本发明所采用的技术方案是：

(1)玉米雌穗套袋：选健康无病害的玉米植株，在花丝抽出前，将羊皮袋套在雌穗上，待花丝抽出；

(2)稻穗花粉收集：水稻抽穗后开花前，每穗剪去基部幼嫩小穗，保留中上部小穗，用牛皮袋套住小穗，扎紧袋口，0.5～2h后，将套袋的稻穗轻轻弯下，轻拍纸袋，使花粉落入袋内，再次轻拍纸袋，使袋内花粉集中于口袋中间，取下牛皮袋，得水稻花粉，备用；

(3)玉米与水稻杂交：步骤(1)花丝抽出第2～4天时开始进行授粉，具体的授粉方法为：先取掉套在雌穗上的羊皮袋，将玉米雌穗上长出的花丝剪短，再用装有营养液的刷子将营养液边注射边涂抹到剪短的花丝上，接着将步骤(2)收集的水稻花粉均匀撒到花丝上，最后用羊皮袋套住雌穗，并用大头针将羊皮袋固定在玉米雌穗上，授粉完成；

(4)染色体加倍：授粉1～3d后，拿掉玉米雌穗上的羊皮袋，剥开雌穗苞叶，用解剖刀将雌穗上的种皮刮破，在子房上部1/3～1/2处，找到胚珠，用无菌针刺穿胚珠壁后，将吸取了染色体加倍液的无菌棉花塞入胚珠中，重新套上羊皮袋，继续管理至种子成熟，收获种子。

进一步地，所述步骤(3)雌穗上长出的花丝用剪刀剪短至长度为0.5～2cm。

进一步地，所述步骤(3)刷子包括软毛、针头、固定连管、空管、刻度线和活塞，空管4一端为活塞6，空管4外表面标有刻度线5，空管4的另一端为固定连管3，固定连管3的另一端连接针头2，所述软毛1黏连在空管4外周，所述软毛1黏连在固定连管3与空管4连接的弧线外周，所述软毛1的长度大于连管3与针头2的总长度，所述软毛1的材料为人体毛发，所述刷子的功能有量取液体、注射和涂刷功能，其制作方法为：选取2～3ml标有刻度的注射器，用强力胶将长为4～5cm的软毛固定在针筒口周围。

进一步地，所述步骤(3)营养液主要包括如下成分：松针粉2～6g/L、魔芋粉5～8g/L、红糖20～30g/L、6-苄氨基腺嘌呤12～15mg/L和赤霉素5～10mg/L。

进一步地，所述步骤(3)刷子内装的营养液体积为1～2ml。

进一步地，所述步骤(4)染色体加倍液主要包括如下成分：甲基胺草磷1.5～3mg/L、氨磺灵69～104mg/L和2,4-二氯苯氧乙酸25～35mg/L。

进一步地，所述步骤(4)无菌棉花吸取染色体加倍液的体积为10～20μl。

本发明所用的强力胶均为市售获得；本发明所用的软毛是指人体毛发，均为市售获得。

本发明具有以下有益效果：

1、本方法通过采用水稻与玉米远缘杂交，经营养液与染色体加倍剂的处理，有效提高了玉米双单倍体的诱导率。该方法简单易学，所用试剂低浓度、低毒性、低成本，获得的玉米双单倍体诱导效率为12.3％以上，优于传统方法。

2、本发明玉米与水稻杂交所用的营养液，组分简单，容易获得，内含丰富营养物质。其中，松针粉中含有丰富的蛋白质、微量元素和维生素；魔芋粉中含有大量的碳水化合物以及丰富的钾、钙、镁、磷、铁、铜、锰、锌、硒元素；红糖中总糖分≧85％外，还含有丰富的维生素和微量元素，如铁、锌、锰、铬等；这些物质为水稻花粉管萌发和伸长提供了充足的营养；此外，组分中的6-苄氨基腺嘌呤和赤霉素均为植物细胞分裂素，可促进细胞分裂，促进花粉管的伸长，这些组分的协同作用，有利于玉米与水稻远缘杂交，促进玉米单倍体的生成。本发明的刷子，通过简单改良注射器，制作成集定量、注射和涂刷功能为一体的工具，有利于简化流程，实用性较好。

3、本发明玉米染色体加倍所使用的加倍液组分中，甲基胺草磷、氨磺灵和2,4-二氯苯氧乙酸共同作用能提高染色体加倍效率，且组分浓度低、毒性低、成本低。甲基胺草磷能直接作用于植物细胞的微管运动，导致有丝分裂终止，并且它在一定浓度下对植物微管蛋白具有较强的亲和性；氨璜灵为细胞有丝分裂抑制剂，在细胞有丝分裂过程中可以与微管蛋白二聚体结合，从而阻止微管进而纺锤丝的形成；2,4-二氯苯氧乙酸可促进植物细胞分裂。

【附图说明】

图1是本发明一实施例刷子结构示意图；

主要元件符号说明：

图中，1软毛，2针头，3固定连管，4空管，5刻度线，6活塞。

如下具体实施方式将结合上述附图进一步说明本发明。

【具体实施方式】

实施例所用的刷子如图1所示，包括软毛、针头、固定连管、空管、刻度线和活塞，空管4一端为活塞6，空管4外表面标有刻度线5，空管4的另一端为固定连管3，固定连管3的另一端连接针头2，所述软毛1黏连在空管4外周，所述软毛1黏连在固定连管3与空管4连接的弧线外周，所述软毛1的长度大于连管3与针头2的总长度，所述软毛1的材料为人体毛发，所述刷子的功能有量取液体、注射和涂刷功能。

实施例1：

一种玉米×水稻远缘杂交育成双单倍体的方法，所述方法包括以下步骤：

(1)玉米雌穗套袋：选健康无病害的玉米植株，在花丝抽出前，将羊皮袋套在雌穗上，待花丝抽出；

(2)稻穗花粉收集：水稻抽穗后开花前，每穗剪去基部幼嫩小穗，保留中上部小穗，用牛皮袋套住小穗，扎紧袋口，0.5h后，将套袋的稻穗轻轻弯下，轻拍纸袋，使花粉落入袋内，再次轻拍纸袋，使袋内花粉集中于口袋中间，取下牛皮袋，得水稻花粉，备用；

(3)玉米与水稻杂交：步骤(1)花丝抽出第2天时开始进行授粉，具体的授粉方法为：先取掉套在雌穗上的羊皮袋，将玉米雌穗上长出的花丝用剪刀剪短至长度为0.5cm，再用装有1ml营养液的刷子将营养液边注射边涂抹到剪短的花丝上，接着将步骤(2)收集的水稻花粉均匀撒到花丝上，最后用羊皮袋套住雌穗，并用大头针将羊皮袋固定在玉米雌穗上，授粉完成；

上述刷子的制作方法为：选取2ml标有刻度的注射器，用强力胶将长为4cm的软毛固定在针筒口周围。

上述营养液主要包括如下成分：松针粉2g/L、魔芋粉5g/L、红糖20g/L、6-苄氨基腺嘌呤12mg/L和赤霉素5mg/L。

(4)染色体加倍：授粉1d后，拿掉玉米雌穗上的羊皮袋，剥开雌穗苞叶，用解剖刀将雌穗上的种子皮刮破，在子房上部1/3处，找到胚珠，用无菌针刺穿胚珠壁后，将吸取10μl染色体加倍液的无菌棉花塞入胚珠中，重新套上羊皮袋，继续管理至种子成熟，收获种子。

上述染色体加倍液主要包括如下成分：甲基胺草磷1.5mg/L、氨磺灵69mg/L和2,4-二氯苯氧乙酸25mg/L。

实施例2：

一种玉米×水稻远缘杂交育成双单倍体的方法，所述方法包括以下步骤：

(1)玉米雌穗套袋：选健康无病害的玉米植株，在花丝抽出前，将羊皮袋套在雌穗上，待花丝抽出；

(2)稻穗花粉收集：水稻抽穗后开花前，每穗剪去基部幼嫩小穗，保留中上部小穗，用牛皮袋套住小穗，扎紧袋口，1.25h后，将套袋的稻穗轻轻弯下，轻拍纸袋，使花粉落入袋内，再次轻拍纸袋，使袋内花粉集中于口袋中间，取下牛皮袋，得水稻花粉，备用；

(3)玉米与水稻杂交：步骤(1)花丝抽出第3天时开始进行授粉，具体的授粉方法为：先取掉套在雌穗上的羊皮袋，将玉米雌穗上长出的花丝用剪刀剪短至长度为1.25cm，再用装有1.5ml营养液的刷子将营养液边注射边涂抹到剪短的花丝上，接着将步骤(2)收集的水稻花粉均匀撒到花丝上，最后用羊皮袋套住雌穗，并用大头针将羊皮袋固定在玉米雌穗上，授粉完成；

上述刷子的制作方法为：选取2.5ml标有刻度的注射器，用强力胶将长为4.5cm的软毛固定在针筒口周围。

上述营养液主要包括如下成分：松针粉4g/L、魔芋粉6.5g/L、红糖25g/L、6-苄氨基腺嘌呤13.5mg/L和赤霉素7.5mg/L。

(4)染色体加倍：授粉2d后，拿掉玉米雌穗上的羊皮袋，剥开雌穗苞叶，用解剖刀将雌穗上的种子皮刮破，在子房上部5/12处，找到胚珠，用无菌针刺穿胚珠壁后，将吸取15μl染色体加倍液的无菌棉花塞入胚珠中，重新套上羊皮袋，继续管理至种子成熟，收获种子。

上述染色体加倍液主要包括如下成分：甲基胺草磷2.25mg/L、氨磺灵86.5mg/L和2,4-二氯苯氧乙酸30mg/L。

实施例3：

一种玉米×水稻远缘杂交育成双单倍体的方法，所述方法包括以下步骤：

(1)玉米雌穗套袋：选健康无病害的玉米植株，在花丝抽出前，将羊皮袋套在雌穗上，待花丝抽出；

(2)稻穗花粉收集：水稻抽穗后开花前，每穗剪去基部幼嫩小穗，保留中上部小穗，用牛皮袋套住小穗，扎紧袋口，2h后，将套袋的稻穗轻轻弯下，轻拍纸袋，使花粉落入袋内，再次轻拍纸袋，使袋内花粉集中于口袋中间，取下牛皮袋，得水稻花粉，备用；

(3)玉米与水稻杂交：步骤(1)花丝抽出第4天时开始进行授粉，具体的授粉方法为：先取掉套在雌穗上的羊皮袋，将玉米雌穗上长出的花丝用剪刀剪短至长度为2cm，再用装有2ml营养液的刷子将营养液边注射边涂抹到剪短的花丝上，接着将步骤(2)收集的水稻花粉均匀撒到花丝上，最后用羊皮袋套住雌穗，并用大头针将羊皮袋固定在玉米雌穗上，授粉完成；

上述刷子的制作方法为：选取3ml标有刻度的注射器，用强力胶将长为5cm的软毛固定在针筒口周围。

上述营养液主要包括如下成分：松针粉6g/L、魔芋粉8g/L、红糖30g/L、6-苄氨基腺嘌呤15mg/L和赤霉素10mg/L。

(4)染色体加倍：授粉3d后，拿掉玉米雌穗上的羊皮袋，剥开雌穗苞叶，用解剖刀将雌穗上的种子皮刮破，在子房上部1/2处，找到胚珠，用无菌针刺穿胚珠壁后，将吸取20μl染色体加倍液的无菌棉花塞入胚珠中，重新套上羊皮袋，继续管理至种子成熟，收获种子。

上述染色体加倍液主要包括如下成分：甲基胺草磷3mg/L、氨磺灵104mg/L和2,4-二氯苯氧乙酸35mg/L。

对照组1：

实例1步骤(3)的营养液的主要成分用魔芋粉5g/L、红糖20g/L、6-苄氨基腺嘌呤12mg/L和赤霉素5mg/L代替。

对照组2：

实例1步骤(3)的营养液的主要成分用松针粉2g/L、红糖20g/L、6-苄氨基腺嘌呤12mg/L和赤霉素5mg/L代替。

对照组3：

实例1步骤(3)的营养液的主要成分用松针粉2g/L、魔芋粉5g/L、6-苄氨基腺嘌呤12mg/L和赤霉素5mg/L代替。

对照组4：

实例1步骤(3)的营养液的主要成分用松针粉2g/L、魔芋粉5g/L、红糖20g/L和赤霉素5mg/L代替。

对照组5：

实例1步骤(3)的营养液的主要成分用松针粉2g/L、魔芋粉5g/L、红糖20g/L和6-苄氨基腺嘌呤12mg/L代替。

对照组6：

实例1步骤(3)的染色体加倍液的主要成分用氨磺灵69mg/L和2,4-二氯苯氧乙酸25mg/L代替。

对照组7：

实例1步骤(3)的染色体加倍液的主要成分用甲基胺草磷1.5mg/L和2,4-二氯苯氧乙酸25mg/L代替。

对照组8：

实例1步骤(3)的染色体加倍液的主要成分用甲基胺草磷1.5mg/L和氨磺灵69mg/L代替。

对照组9：

按照专利20150503664.4《一种玉米单倍体染色体组加倍的方法》的方法，获得双单倍体。

上述实施例和对照组各处理100粒玉米种子，3个重复，成熟后收获种子。

上述各实施例和对照组收获得的种子，采用流式细胞仪检测细胞染色体数，统计籽粒染色体倍性，再以玉米母本和水稻父本为对照，进行DNA指纹检测。

测试试验：

统计植株染色体数为双倍体，且DNA指纹检测带型与玉米母本带型相近的籽粒，统计获得的双单倍体籽粒数量，计算出双单倍体诱导效率，具体见表1。

双单倍体诱导效率(％)＝双单倍体籽粒数量/总籽粒数量×100％

表1

由上表可知，本发明的营养液和染色体加倍液各成分相互协同，不可分割；采用本发明的方法，获得的双单倍体诱导效率为12.3％以上，优于传统方法。

上述说明是针对本发明较佳可行实施例的详细说明，但实施例并非用以限定本发明的专利申请范围，凡本发明所提示的技术精神下所完成的同等变化或修饰变更，均应属于本发明所涵盖专利范围。

Claims (7)

1.一种玉米×水稻远缘杂交育成双单倍体的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)玉米雌穗套袋：选健康无病害的玉米植株，在花丝抽出前，将羊皮袋套在雌穗上，待花丝抽出；

(2)稻穗花粉收集：水稻抽穗后开花前，每穗剪去基部幼嫩小穗，保留中上部小穗，用牛皮袋套住小穗，扎紧袋口，0.5～2h后，将套袋的稻穗轻轻弯下，轻拍纸袋，使花粉落入袋内，再次轻拍纸袋，使袋内花粉集中于口袋中间，取下牛皮袋，得水稻花粉，备用；

(3)玉米与水稻杂交：步骤(1)花丝抽出第2～4天时开始进行授粉，具体的授粉方法为：先取掉套在雌穗上的羊皮袋，将玉米雌穗上长出的花丝剪短，再用装有营养液的刷子将营养液边注射边涂抹到剪短的花丝上，接着将步骤(2)收集的水稻花粉均匀撒到花丝上，最后用羊皮袋套住雌穗，并用大头针将羊皮袋固定在玉米雌穗上，授粉完成；

(4)染色体加倍：授粉1～3d后，拿掉玉米雌穗上的羊皮袋，剥开雌穗苞叶，用解剖刀将雌穗上的种皮刮破，在子房上部1/3～1/2处，找到胚珠，用无菌针刺穿胚珠壁后，将吸取了染色体加倍液的无菌棉花塞入胚珠中，重新套上羊皮袋，继续管理至种子成熟，收获种子。

2.根据权利要求1所述的一种玉米×水稻远缘杂交育成双单倍体的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述雌穗上长出的花丝用剪刀剪短至长度为0.5～2cm。

3.根据权利要求1所述的一种玉米×水稻远缘杂交育成双单倍体的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述刷子的制作方法为：选取2～3ml标有刻度的注射器，用强力胶将长为4～5cm的软毛固定在针筒口周围。

4.根据权利要求1所述的一种玉米×水稻远缘杂交育成双单倍体的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述营养液主要包括如下成分：松针粉2～6g/L、魔芋粉5～8g/L、红糖20～30g/L、6-苄氨基腺嘌呤12～15mg/L和赤霉素5～10mg/L。

5.根据权利要求1所述的一种玉米×水稻远缘杂交育成双单倍体的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述刷子内装的营养液体积为1～2ml。

6.根据权利要求1所述的一种玉米×水稻远缘杂交育成双单倍体的方法，其特征在于，步骤(4)中，所述染色体加倍液主要包括如下成分：甲基胺草磷1.5～3mg/L、氨磺灵69～104mg/L和2,4-二氯苯氧乙酸25～35mg/L。

7.根据权利要求1所述的一种玉米×水稻远缘杂交育成双单倍体的方法，其特征在于，步骤(4)中，所述无菌棉花吸取染色体加倍液的体积为10～20μl。