CN108243947A - 一种利用黄绿苗标记选育玉米早期加倍单倍体的育种方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了利用黄绿苗标记选育玉米早期加倍单倍体的方法，属于育种方法领域。本发明还公开了利用黄绿苗标记对诱导单倍体的鉴定方法，以及培育带有黄绿苗标记的单倍体诱导系的方法。本发明利用单显性基因Yg3基因控制的黄绿苗性状实现在苗期对诱导单倍体进行准确鉴定和筛选，该性状标记填补了幼苗期筛选诱导单倍体标记的空白，该性状标记遗传简单，区别特征明显，对单倍体、早期加倍单倍体、伪单倍体都可在苗期做出准确可靠的鉴定，尤其是对于加倍单倍体的鉴定，避免其作为伪单倍体而剔除，可实现一步成系；利用黄绿苗标记鉴定效率高，大大节省人力物力，可以用于扩大诱导群体规模，并且可实现机械化识别间苗，育种效率大大提高。

Description

一种利用黄绿苗标记选育玉米早期加倍单倍体的育种方法

技术领域：

本发明属于玉米杂交诱导单倍体的选择标记领域，具体涉及黄绿苗性状作为标记在玉米杂交诱导单倍体育种上的用途；还涉及利用黄绿苗性状标记鉴定玉米杂交诱导单倍体的方法；还涉及一种利用黄绿苗标记选育玉米早期加倍单倍体的育种方法。

背景技术

应用传统的杂交育种方法培育一个玉米品种一般需要10～15年的时间，不仅周期长、规模大、费时费力，而且还可能因历时过长，育种开始时制定的育种目标，到品种育成时已不符合市场的要求。因此，缩短育种时间、加快育种速度一直是育种家们努力追求的目标。二十世纪七十年代，花药培养或花粉培养等单倍体育种方法曾被作为前景广阔的方法，但由于上述方法存在技术复杂、效率不高的等缺点，难以在实践中推广应用。

1959年美国明尼苏达大学Coe E H育成杂交诱导单倍生殖诱导系Stock6 (Coe EH.Amer Mat,1959,93:381－382)，奠定了杂交诱导单倍体育种技术的基础。到二十世纪九十年代，随着杂交诱导单倍生殖诱导方法的完善，产生了杂交诱导单倍体育种方法。该方法用单倍体诱导系给基础材料授粉，只需2个世代即可获得纯系，具有育种周期短、效率高、方法简单等优点，因而迅速获得育种家们青睐，目前该方法已得到广泛应用。

单倍体诱导系是进行单倍体育种必备的遗传工具材料，高的诱导率和明显的标记性状是其先决条件。目前，通过杂交改良方法已选育出一批新的单倍体诱导系，如法国的SW14(Lashermes等.Theor Appl Genet,1988,76:405 －410)、前苏联的Krasnodar(Shatskaya O A等.Maize Genet Coop News Lett,1994,68:51)、摩尔多瓦的ZMS(ChalykS T等.Euphytica,1994,79:13～ 18)、德国的RWS(F.K.Rober,Maydica，2005，50,275-283)等；以及中国农业大学的农大高诱1号、农大高诱5号(刘志增等，作物学报，2000， 26(5):570-574；陈绍江等，作物学报，2003,29(4):587-590)、吉林省农科院的吉高诱系3号、吉高诱系31号(才卓等2007、2013)等。这些诱导系的诱导率超过了Stock6的几倍甚至十倍，有的高达10％以上。但这些诱导系的标记性状仍局限在Stock6的籽粒紫色冠顶(Navajo紫斑)、籽粒紫色胚尖、紫色茎秆、紫色叶片范围以内；由于紫色冠顶、紫色胚尖标记仅在籽粒上表现，其表达受母本影响很大，尤其是在母本基础群体带有抑制基因(C1-I)的情况下，籽粒斑纹标记模糊加大了单倍体籽粒的鉴别难度，使挑选单倍体籽粒变得非常困难，甚至是不可能；此时，单倍体的鉴别就只能依靠紫色叶片、紫色茎秆及经验判别，但紫色植株标记最早也在拔节后期显现，因此，在苗期只能根据幼苗的杂种优势强度凭经验进行模糊判断，由于幼苗没有明显的标记性状，导致在间苗过程中对自然加倍或人工加倍，特别是加倍药剂处理后的单倍体确认模糊，造成大量人力、物力、财力与时间浪费。

另外，目前单倍体育种已不再仅限于过去DH育种,概念也在扩大，而是以DH为核心,集成AH、BH、CH和EH等并与传统育种方法融合的TH育种即全单倍体育种(Total HaploidBreeding)新体系。从一定程度上可以将单倍体育种与常规育种方法实现较好的融合与利用。其中,单倍体群体中还存在一类特殊的籽粒形成期产生的早期加倍单倍体EDH或EH(Early doubled Haploid), 这类材料可一步自交成系，直接进入组合测配环节利用。EDH株在DH₀代在株型和叶绿素含量要显著区别于加倍单倍体当代和诱导产生的杂株,并且在散粉特性和结实特性上要显著优于常规加倍单倍株,花粉全部为可育花粉,授粉结实率正常，与加倍后获得的DH₁具有相同的纯合性和整齐度。由于EDH都具有很多优良的遗传基因高度聚合的结果，组合测配过程中获得广适性优异组合的几率也高，故被育种家认为利用前景非常广阔。但因EDH系在苗期长势与诱导产生的二倍杂株形态上区别非常困难，故很容易造成类似EDH系那样因早期加倍而生长势较强的优良单株被当做伪单倍体株剔除，或模糊留苗去自交授粉，待次年再鉴定，而浪费一代育种时间。

1994年美国密苏里大学张铭堂博士利用EMS化学诱变剂诱变A632/MO20 的杂交后代，获得一个黄绿苗基因突变体Yg*-1582，，纯合固定后该遗传材料定名为523D Yg3-N1582(该材料亦被称为523D、Yg3-N1582、4308A Yg*-N1582等，其中523D Yg3-N1582是该材料在美国玉米遗传资源保存中心的代号或名称。该材料在美国农业部的保存号为MGS 9012023，均可索取并免费使用)，由于黄绿苗性状对光合能力有一定的影响，故大多数人将其列为劣性农艺性状，目前尚无应用报道。

发明内容

针对目前玉米杂交诱导单倍体育种中所用的Navajo紫斑标记存在的受母本影响大，尤其在有抑制基因存在的情况下对单倍体籽粒鉴别准确度差、难度大，受其影响较大的基础材料拟单倍体籽粒鉴别准确率不足50％，而苗期凭经验鉴别可能使因早期加倍而生长势强的优良单株(EDH系)被作为伪单倍体剔除的危险，以及成株期依靠紫色叶片和紫色茎秆鉴别时间晚，造成大量人力、物力、财力与时间浪费的问题，本发明目的在于提供黄绿苗性状作为标记在玉米杂交诱导单倍体育种上的用途。

本发明另一目的在于提供利用黄绿苗标记鉴定玉米杂交诱导单倍体的方法。

本发明第三目的在于提供黄绿苗性状作为标记在选育玉米早期加倍单倍体上的用途。

本发明第四目的在于提供一种利用黄绿苗标记选育玉米早期加倍单倍体的育种方法。

为实现上述目的，本发明的技术方案如下：

本发明提供了黄绿苗性状作为标记在玉米杂交诱导单倍体育种上的应用。

所述的黄绿苗是指苗期叶片颜色为黄绿色。

所述的黄绿苗性状由单显性基因Yg3控制；Yg3位于玉米第五条染色体长臂上。所述黄绿苗基因Yg3没有和不良性状连锁。

所述的苗期是指3～10叶期，优选为3～5叶期。

本发明还提供了利用黄绿苗标记鉴别玉米杂交诱导单倍体的方法，用带有黄绿苗标记的单倍体诱导系给玉米基础群体或杂交种授粉，收获母本植株上的果穗，筛选果穗上顶端糊粉层为紫色、胚芽尖无色的籽粒，或直接播种所收获果穗上的所有籽粒，在苗期对幼苗叶片颜色进行肉眼直观鉴定，其中叶片颜色为黄绿色的幼苗为杂合二倍体植株，予以淘汰；叶片颜色为绿色的幼苗为单倍体植株或已加倍单倍体植株(EDH系)，予以保留，在开花期对有花丝和花粉的植株进行自交，自交后代性状一致不分离的，即为育成新的DH 系。

上述方法中所述的带有黄绿苗标记的单倍体诱导系，按照以下方法培育：以带有黄绿苗标记的玉米材料为亲本之一，采用回交或杂交育种方法将黄绿苗基因Yg3转育到单倍体诱导系中。

上述方法中所述的带有黄绿苗标记的单倍体诱导系，其所述的回交方法包括：以带黄绿苗性状的材料为非轮回亲本，以玉米单倍体诱导系为轮回亲本进行回交转育；在回交后代中选择具有Navajo紫斑标记、幼苗叶片颜色黄绿色、且诱导率高的材料，经过4～6代回交，然后自交一代，选择自交后代中黄绿苗性状不分离的材料，即为带有黄绿苗标记的单倍体诱导系。

上述方法中所述的带有黄绿苗标记的单倍体诱导系，其所述的杂交方法包括以带黄绿苗标记的材料为亲本之一，以单倍体诱导系为父本杂交，在杂交后代中选择Navajo紫斑标记、幼苗叶片颜色黄绿色、且诱导率高的材料自交，连续自交4-6代，最后自交一代，选择性状稳定一致、且黄绿苗性状不分离的穗行，即为带黄绿苗标记的单倍体诱导系。

上述方法中所述的带黄绿苗标记的材料为523DYg3-N1582(或称作523D、 Yg3-N1582或Yg*-N1582等，该材料保存于美国玉米遗传资源保存中心，该材料在美国农业部的保存号为：MGS 9012023，均可免费索取和使用)或其他带有该黄绿苗标记的材料。

所述的黄绿苗性状由单显性基因Yg3控制。Yg3位于玉米第五条染色体长臂上。

上述方法中所述的单倍体诱导系是指农大高诱1号、农大高诱5号、吉高诱系3号或吉高诱系31号等单倍体诱导系。

上述方法中所述的玉米基础群体是指农家种，或者由多个自交系或杂交种经混合授粉后形成的玉米群体。

上述方法中所述的杂交种指单交种、三交种、双交种或其后代群体等。

上述方法中所述的苗期是指3～10叶期；优选为3～5叶期。

本发明还提供了利用黄绿苗标记鉴别诱导伪单倍体幼苗的方法，用带有黄绿苗标记的单倍体诱导系给玉米基础群体或杂交种授粉，收获果穗后，根据籽粒顶部和胚芽在种皮外部的颜色挑选单倍体籽粒，原则上，选留籽粒顶端带有Navajo紫斑标记，而胚部或胚芽尖无紫色、且胚面较小、凹陷较深是育种所需的单倍体籽粒)；但实践上，由于着色程度受多个修饰基因所控制 (C1-I、Idf等)，加之发育环境等多因素的影响，硬粒型品种、热带材料等等多种遗传材料因Navajo标记表现弱、着色模糊不能鉴别。所以，以往模糊的籽粒必须依靠田间种植再鉴别，而且不管所用诱导系是紫色植株标记(叶鞘叶色不呈现紫色ABPl标记的绿色小株为单倍体)或没有植株标记都只能在抽穗前完成确认，因而单倍体长势弱，抽穗前被二倍体杂种株遮蔽状态下难以正常生长而加倍，达不到育种目的。而使用带有黄绿苗标记诱导系时，在 3-5叶龄幼苗期结合间苗就可根据叶片颜色准确剔除伪单倍体幼苗，提早5-7 个叶龄约30天左右。既叶片颜色为黄绿色的幼苗为杂交诱导产生的二倍体株，予以剔除；正常绿色叶片的弱小幼苗即为尚未加倍或正在加倍过程中单倍体株，予以保留，开花期挑选散粉株精细自交授粉，所结籽粒即为双单倍体系籽粒(即DH系)；叶片颜色表现为正常绿色、生长势较强的幼苗是已早期加倍，能够正常散粉的DH株(EDH)，予以保留，开花期进行自交授粉，所结籽粒即为早期加倍了的EDH自交系，这是本发明的最大可商业化应用特点。

本发明还提供了黄绿苗性状作为标记在选育玉米早期加倍单倍体上的应用。

上述应用中所述的黄绿苗性状由单显性基因Yg3控制，Yg3位于第五条染色体长臂上。

上述应用中所述的早期加倍单倍体是指在籽粒生成时或幼苗阶段染色体已经加倍(雄花能够正常开花散粉)的双单倍体。

本发明还提供了一种利用黄绿苗标记选育玉米早期加倍单倍体的育种方法，包括如下步骤：

(1)以带有黄绿苗标记的单倍体诱导系给玉米基础群体或杂交种授粉，收获母本植株上的果穗；选择糊粉层顶端紫色、胚尖无色的籽粒；

(2)播种步骤(1)所得籽粒，在苗期剔除叶片颜色为黄绿色的植株，选择叶片颜色为绿色、生长势较强，具有二倍体表型、但不具有单倍体表型、且能正常散粉的植株，即为已经加倍的双单倍体，在开花期自交，所得即为玉米自交系。

上述育种方法步骤(1)中所述的带有黄绿苗标记的单倍体诱导系可以是吉黄诱7号或其他通过回交或杂交方法育成的带黄绿苗标记的单倍体诱导系。吉黄诱7号是吉林省农业科学院以523DYg3-N1582为非轮回亲本、以单倍体诱导系吉高诱系号为轮回亲本，经过5代以上回交育成的。吉黄诱7号已于2017年12月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为：CGMCC No.14893。

上述育种方法步骤(2)中所述的单倍体表型是指其生长势比正常的二倍体弱。

与现有技术相比，本发明具有的优点和有益效果：

(1)本发明黄绿苗性状由单显性基因Yg3控制，遗传简单，单倍体和杂交诱导产生二倍体的幼苗叶片颜色具区别明显，易于辨别，且性状稳定、可靠性强，不需要有特别的经验和技术；(2)本发明填补了幼苗期单倍体、非单倍体苗筛选标记的空白，本发明所得黄绿苗标记诱导系具备籽粒标记、幼苗标记和成株标记(叶鞘、茎秆、叶片呈现紫色)，整个生育期都可以高效地区别单倍体的工具材料；(3)本发明黄绿苗标记早在3-4叶龄期就可实现单倍体、非单倍体幼苗的精准鉴别，相对于成株期的紫色叶片标记提早25-30 天，可节省大量人力、物力，使单倍体幼苗免受光线遮蔽及养分欺夺；(4) 对于籽粒标记弱，难以通过籽粒进行单倍体籽粒筛选的硬粒型、热带种质及小粒种子等很多材料，其杂交诱导获得的籽粒可直接播种，在间苗期通过黄绿苗标记剔除非单倍体苗；(5)对于自然加倍的诱导单倍体育种，在苗期作为识别伪单倍体幼苗的标记性状；(6)用于单倍体育种人工加倍方法(幼胚、浸种、切芽鞘、浸根、幼苗注射等)前后环节淘汰伪单倍体幼苗的确认标记，可因减少对大量伪单倍体苗的无效劳动；(7)在幼苗期以黄绿苗作为伪单倍体的剔除标记，能确保早期加倍的生长势较强的EDH系(一步成系)不被剔除，从而实现一步成系；(8)本发明方法不受环境条件影响，可在田间、温室、人工加倍前后、结合间苗、移栽程序完成非单倍体准确剔除，降低育种圃占地面积，降低DH系生产成本；(9)本发明黄绿苗性状区别明显，易于实现现机械化识别，可通过机械剔除非单倍体幼苗，实现机械化间苗，提高作业效率、节省人力，扩大诱导群体规模；(10)本发明黄绿苗性状由单显性基因Yg3控制，通过回交转育或杂交育种方法培育带黄绿苗标记的单倍体诱导系都比较简单、方便。

生物保藏

本发明玉米(zea mays)吉黄诱7号，是本发明人自行培育而成，于 2017年12月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为：CGMCC No.14893。

具体实施方式

以下通过实施例对本发明做进一步的解释和说明，但是不对本发明的保护范围构成限制。

实施例1本发明黄绿苗基因Yg3的遗传分析与定位

(1)2012年夏季，在吉林公主岭种植代号为523DYg3-N1528的材料(或称为，2011年引自美国玉米遗传资源保存中心，以下同)；开花期分别用吉高诱系3号、吉高诱系31号(均为吉林省农业科学院培育)花粉给 523DYg3-N1528授粉，获得F₁代组合(523DYg3-N1528╳吉高诱系3号为编号为组合1、523DYg3-N1528╳吉高诱系31号编号为组合2)各2穗。

(2)2012年冬季，在海南育种圃种植F₁代各1行，F₁代幼苗3-5叶龄期就开始呈现非常明显的叶片黄绿化(淡绿色幼苗，淡绿色植株，黄绿色叶片，以黄为主，以绿为辅)，与吉高诱系3号和吉高诱系31号的叶片色差极大，拔节后期(10-12叶龄)恢复正常绿色，对正常生长发育未有影响。开花期分别进行自交，各获得3穗，得F₂代。

(3)2013年夏季，在吉林公主岭种植F₂代，5叶期对2个组合的黄绿苗和绿苗数量进行调查。

结果(见表1)F₁代幼苗叶片颜色皆为黄绿色，说明黄绿色性状由显性基因控制；F₂代经适合性测验，结果黄绿苗与绿苗之间符合3:1的分离比例，说明黄绿苗性状由单显性基因控制。

在幼苗期分别剪取获得的黄绿幼苗及正常绿色幼苗叶片,送北京诺禾致源生物信息科技有限公司,用玉米简化基因组测序方法(GBS)进行变异检测个性化分析，将该性状定位于第5号染色体长臂上,由单显性基因Yg3控制。

表1黄绿苗基因Yg3遗传分析试验结果

实施例2利用回交方法培育带黄绿苗标记的单倍体诱导系试验

按照如下方法进行：

(1)、2012年夏季，在吉林省公主岭市同时种植带黄绿色幼苗标记的 523DYg3-N1528(非轮回亲本)和单倍体诱导系吉高诱系3号(轮回亲本)。幼苗期523DYg3-N1528黃绿色，生长正常，抽穗后黃绿色与正常绿色植株差异逐渐变小；在开花期用吉高诱系3号给523DYg3-N1528授粉，获得杂交F₁代种子。

(2)、2012年冬季，在海南种植F₁代，同时，种植吉高诱系3号；在开花期以吉高诱系3号为父本，给F₁代健壮植株授粉；收获时混合脱粒后挑选Navajo紫斑标记明显的籽粒，得BC₁代。

(3)、2013年夏季，在吉林公主岭种植上季挑选的Navajo紫斑标记明显的BC₁代籽粒和吉高诱系3号；在5叶期砍除叶片颜色为绿色的植株，保留叶片颜色为黃绿色的植株；在开花期，再次用吉高诱系3号给外观倾向吉高诱系3号的黄绿苗植株授粉进行“一对一”回交，收获时单穗脱粒，淘汰紫色斑纹与胚尖标记性状不明显籽粒，得BC₂代；同年冬季在海南乐东，重复上述回交过程，得BC₃代。

(4)、2014年夏季、冬季再次重复上年程序，在苗期砍除叶片颜色为绿色的幼苗，保留叶片颜色为黃绿色的幼苗；开花期按单系、单株用吉高诱系3号花粉对所选黄绿苗标记植株的雌穗回交，得BC₅代；同时，对性状与吉高诱系3号近似的稳定穗行进行自交纯化。收获时单穗脱粒，淘汰紫色斑纹与胚尖紫色标记性状不明显籽粒。

(5)、2015年夏季，同期种植上季挑选出的Navajo紫斑标记明显籽粒、和吉高诱系3号，及3个进行诱导率测定的杂交种F₁代，在苗期砍除叶片颜色为绿色的幼苗，保留叶片颜色为黃绿色的幼苗；在开花期在行内选优良单株继续回交或自交；同时，在性状趋稳定、且与吉高诱系3号相似的穗行内挑选优异单株采集花粉，一对一方式给预先种植3个杂交种F₁代(用于测试诱导率的材料)雌穗授粉，进行诱导率测定，秋季分别收获回交、自交及测交种子。

(6)2015年冬季，精细挑选测交种子，挑选出子粒顶端为紫色、而胚部或胚芽尖无紫色、且胚面较小、凹陷较深是单倍体子粒妥善保管，待下季播种。并计算单倍体粒所占比例。

(7)2016年夏季，根据黄绿苗标记诱导系的诱导验证结果，优选外观性状似回交父本株自交株系，及诱导率测定挑选结果，获得吉黄诱系7号等一批优异穗行，即育成一批带黄绿苗标记的诱导系，其中代号为吉黄诱系7-31 的材料具有Navajo标记明显(即紫色糊粉层和紫色胚芽标记)，花药紫色，花粉量大，开花时间长，诱导率高达10％以上，籽粒标记鉴定准确率为 82.61％，综合性状好等优点，命名为吉黄诱系7号。吉黄诱系7号已于2017 年12月6日保藏与中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.14893。

同时，还利用吉林省农业科学院培育的诱导系吉高诱系31号、以及引自美国的诱导系H08、S05：12、S05：26、S05：34、S05：40、S05：54和S05： 60等8个单倍体诱导系按照与上述同样方法进行回交转育，育成一系列带黄绿苗标记的单倍体诱导系。

将上述9个诱导系按照上述方法所育成的带黄绿苗标记的单倍体诱导系，除了表2所示的诱导系外，还有吉黄诱7-4、吉黄诱7-11、吉黄诱7-13、吉黄诱7-15、吉黄诱7-17、吉黄诱7-23、吉黄诱7-24、吉黄诱7-28、吉黄诱7-29、吉黄诱7-34、吉黄诱7-35、吉黄诱7-36、吉黄诱7-40、吉黄诱7-42、吉黄诱7-47、吉黄诱7-53、吉黄诱7-55、吉黄诱7-56、吉黄诱7-62、吉黄诱7-65、吉黄诱7-70、吉黄诱7-77、吉黄诱7-79、吉黄诱7-81、吉黄诱7-85、吉黄诱7-87、吉黄诱7-90、吉黄诱7-94和吉黄诱7-95等一系列单倍体诱导系。

表2本试验利用回交方法转育的部分带黄绿苗标记的单倍体诱导系

实施例3：利用吉黄诱系7号及其姊妹系选育玉米早期加倍单倍体试验

按照如下方法进行：

(1)、2016年在吉林省公主岭吉林省农业科学院单倍体育种圃,以京科糯928(北京市农林科学院赠予)、一口三香(山东登海种业赠予)两个商业化鲜食玉米杂交种为基础群体，以实施例2培育的带有黄绿苗标记的单倍体诱导系吉黄诱系7号及其姊妹系(见表3和表4)作父本，分别给京科糯928、一口三香进行“一对一”单穗授粉，收获母本植株上果穗，根据顶端糊粉层为紫色，胚芽尖无色的籽粒Navajo标记性状筛选“准单倍体”籽粒。

(2)、2016年冬，在海南乐东吉林省农业科学院基地，将步骤(1)中筛选出的“准单倍体”籽粒按穗行精细单粒播种，在4叶期根据叶片颜色去除叶片为黄绿色的伪单倍体植株，保留叶片颜色为正常绿色的幼苗，其中单倍体幼苗，植株瘦弱，株型收敛、叶片窄小，生长缓慢；经自然加倍，有22 株个别分枝有花药散粉并有正常花丝，自交授粉后获得果穗12个，每穗结实为1～7粒；另外，分别在京科糯928、一口三香单倍幼苗中分别发现1株绿色幼苗生长势虽不及伪单倍体株强势；但又与单倍体苗有显著区别，表现出 EDH幼苗特征，生长健壮，较为敦实，叶片较平展，如果没有黄绿色幼苗标记，即使不具备单倍体苗特征，也不能断定是早期加倍了的EDH系，在散粉期该2株株高高于单倍体株40cm，花期观察抽丝正常，整个花序如同自交系一样正常散粉，经自交授粉，分别结实185粒、223粒。

(3)、2017年夏，在吉林省公主岭吉林省农业科学院单倍体育种圃，将步骤(2)获得的12个自交结实籽粒按穗种植，开花期进行自交授粉，收获期选育出整齐一致、综合性状表现好的8个DH自交系穗行(穗)，分别命名为吉DH928-1、吉DH928-2、吉DH928-5及吉DH103-3、吉DH103-6、吉DH103-3。其中，2株正常散粉的绿苗为早期加倍单倍体(即EDH系)，分别种植20粒，植株整齐度高度一致，确认为早期加倍单倍体(即EDH系)，分别命名为吉 EDHT36-7、吉EDHT85-9。

从表3、表四和上述结果可以看出，利用黄绿苗标记的单倍体诱导系不仅可以根据黄绿苗标记在苗期准确鉴定出单倍体植株，而且能确保生长势较强的早期已加倍单倍体籽粒，不会因为生长势、散粉及结实能力与普通自交系相同而被看作伪单倍体植株淘汰，完全可以省去加倍环节，实现一步成系。

表3吉黄诱7号及其姊妹系诱导一口三香早期加倍单倍体的试验结果

表4吉黄诱7号及其姊妹系诱导京科糯928早期加倍单倍体的试验结果

实施例4：利用吉黄诱系7号及其姊妹系选育普通玉米早期加倍单倍体试验

按照如下方法进行：

(1)2014年分别以自交系C7、良S127、PH25、四287、LH82、D22为亲本组配成C7×良S127、PH25×四287、LH82×D22，共3个单交种F₁代；将C7×良S127组合的F₁代编号为I、将PH25×四287组合的F₁代编号为II，将LH82×D22组合的F₁代编号为III。

(2)、2015年夏，在吉林省农业科学院公主岭，分别以实施例1中培育的带有黄绿苗标记的单倍体诱导系吉黄诱7号及其姊妹系吉黄诱7-68和吉黄诱7-90为父本，分别以“一对一方式”给步骤(1)中组配的单交组合I、 II和III授粉，按照组合收获母本上果穗；根据顶端糊粉层为紫色，胚芽尖无色的籽粒标记性状筛选获得“准单倍体”籽粒。

(3)2015年冬，在海南乐东吉林省农科院南繁基地，将步骤(2)中筛选出的“准单倍体”籽粒精细单粒播种，因单倍体仅1套染色体组，基因以单一形式存在，自然选择压力下，芽势太弱，不能发芽及发育不良株死亡多。 4叶期根据幼苗叶片颜色进行确认间苗，拔除叶片颜色为黄绿色的二倍体幼苗(伪单倍体杂株)；留选叶片颜色为绿色的单倍体幼苗。去除黄绿苗后的单倍幼苗植株性状表现各异，其中在I*吉黄诱7-68、II*吉黄诱7号、III*吉黄诱7-90的组合中各有1株与一般自交系相彷生长势较强壮单株，株高高于其他弱廋单倍株30-50cm，叶色深于其他弱廋单倍体株，初步明确是EDH株，散粉期观察雄穗，全花序花药饱满，散出花粉正常可育,自交授粉全部结实饱满(分别结实283粒、235粒、194粒)。由于早期加倍后的EDH系都是具很多优良遗传基因高度聚合的结果，一经发现可省略DH系鉴定环节直接进入组合测配阶段，实现一步成系，同时，组合测配过程中获得广适性优异组合的几率也高。

(4)、2016年春在吉林省农业科学院院区，将步骤(3)获得的3个EDH 自交果穗种植成穗行，并进行自交授粉，后代表现整齐一致、综合性状表现好，确认为新的EDH系，分别定名吉DHCS7127-6^ED、吉DHPS25287-2^ED、吉 DHLD8222-4^ED。

从表5和上述结果可以看出，利用黄绿苗标记可在苗期对早期加倍单倍体单倍体直接进行准确鉴定，省略DH系鉴定环节直接进入组合测配阶段，实现一步成系，避免了以前根据籽粒标记、成株标记或单纯根据生长势标准判断有可能作为伪单倍体植株剔除的情况，最大限度地使得早期加倍的单倍体优秀单株能得以确认与保留，提高了鉴别的准确性与可靠性，提高了诱导单倍体育种的效率。同时，也为将来进一步扩大与发展的EDH系规模化育种奠定了坚实基础。

表5吉黄诱7号及其姊妹系诱导普通玉米选育早期加倍单倍体的试验结果

Claims (10)

1.黄绿苗性状作为标记在玉米杂交诱导单倍体育种上的应用。

2.根据权利要求1所用的应用其特征在于所述的黄绿苗性状由单显性基因Yg3控制；Yg3位于玉米第五条染色体长臂上。

3.利用黄绿苗标记鉴别玉米杂交诱导单倍体的方法，其特征在于用带有黄绿苗标记的单倍体诱导系给玉米基础群体或杂交种授粉，收获母本植株上的果穗，筛选果穗上顶端糊粉层为紫色、胚芽尖无色的籽粒，或直接播种所收获果穗上的所有籽粒，在苗期对幼苗叶片颜色进行肉眼直观鉴定，其中叶片颜色为黄绿色的幼苗为杂合二倍体植株，予以淘汰；叶片颜色为绿色的幼苗为单倍体植株或已加倍单倍体植株(EDH系)，予以保留，在开花期对有花丝和花粉的植株进行自交，自交后代性状一致不分离的，即育成新的DH系。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于所述的带有黄绿苗标记的单倍体诱导系，按照以下方法培育：以带有黄绿苗标记的玉米材料为亲本之一，采用回交或杂交育种方法将黄绿苗基因Yg3转育到单倍体诱导系中。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于所述的带黄绿苗标记的玉米材料为523DYg3-N1582或其他带有该黄绿苗标记的材料。

6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于所述的单倍体诱导系是指农大高诱1号、农大高诱5号、吉高诱系3号或吉高诱系31号等单倍体诱导系。

7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于所述的玉米基础群体是指农家种，或者由多个自交系或杂交种经混合授粉后形成的玉米群体；所述的杂交种指单交种、三交种、双交种或其后代群体。

8.黄绿苗性状作为标记在选育玉米早期加倍单倍体上的应用；其中所述的黄绿苗性状由单显性基因Yg3控制，Yg3位于第五条染色体长臂上。

9.一种利用黄绿苗标记选育玉米早期加倍单倍体的育种方法，包括如下步骤：

(1)以带有黄绿苗标记的单倍体诱导系给玉米基础群体或杂交种授粉，收获母本植株上的果穗；选择糊粉层顶端紫色、胚尖无色的籽粒；

(2)播种步骤(1)所得籽粒，在苗期剔除叶片颜色为黄绿色的植株，选择叶片颜色为绿色、生长势较强，具有二倍体表型、但不具有单倍体表型、且能正常散粉的植株，即为已经加倍的双单倍体，在开花期自交，所得即为玉米自交系。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于其步骤(1)中所述的带有黄绿苗标记的单倍体诱导系是吉黄诱7号或其他通过回交或杂交方法育成的带黄绿苗标记的单倍体诱导系；吉黄诱7号已于2017年12月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为：CGMCCNo.14893。