CN109371055A - 一种选育广谱抗马铃薯y病毒属病毒的烟草植物的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种选育广谱抗马铃薯Y病毒属病毒(Potyviruses)的烟草植物的方法，在烟草植物中聚合eIFiso4E‑S基因突变体、eIFiso4E‑T基因突变体和eIF14E1基因突变体，可获得烟草对至少4种Potyviruses的抗性，包括马铃薯Y病毒(PVY)、辣椒脉斑驳病毒(ChiVMV)和烟草脉带花叶病毒(TVBMV)。本发明所述方法对于培育抗Potyviruses烟草具有重大应用前景。

Description

一种选育广谱抗马铃薯Y病毒属病毒的烟草植物的方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，进一步属于烟草生物技术育种领域，具体涉及一种聚合eIFiso4E-S基因突变体、eIFiso4E-T基因突变体和 eIF4E1基因突变体，获得广谱抗马铃薯Y病毒属病毒的烟草植物的方法。
背景技术
马铃薯Y病毒属(Potyvirus)病毒包括10个以上成员，主要危害茄科(Solanaceae)作物。Potyviruses主要危害烟草、番茄和辣椒等茄科作物，近年来于马铃薯Y病毒(PVY)、辣椒脉斑驳病毒(ChiVMV) 和烟草脉带花叶病毒(TVBMV)已经上升为烟草上的常见病害。在同科作物相邻种植的农田生态下，控制一种作物上Potyviruses的发生不仅有利于该作物的病害防治，也有利于其他作物的病害治理。 Potyviruses在田间由蚜虫非持久性传播。由于蚜虫发育周期短、繁殖力强和易产生抗药性，利用化学药剂防治媒介昆虫来治理该病害效果有限，因此，选育Potyviruses抗病品种依然是防控Potyviruses最根本、最经济有效的手段。
烟草作为重要的经济作物和植物研究重要的模式作物，有关抗马铃薯Y病毒(Potato virus Y，PVY)资源鉴定、抗病育种和病原调查鉴定研究较多。其中通过X-射线诱变获得的va基因抗病资源，已广泛应用于选育烟草抗PVY品种。烟草eIF4E1基因(有的文献缩写为 eIF4E-1，GenBank序列登录号KF155696)缺失或突变导致烟草产生针对PVY的抗性(刘勇等，2013；Julio等，2014)，eIF4E1多肽能和PVY的VPg蛋白互作从而起始病毒功能蛋白的翻译，是PVY侵染植物必需的植物寄主因子。烟草上未见兼抗马铃薯Y病毒(PVY)、辣椒脉斑驳病毒(ChiVMV)和烟草脉带花叶病毒(TVBMV)的报道。
本发明申请人提出如下假说：在缺失eIF4E1基因的普通烟草(va) 中，Potyviruses与烟草eIF4E家族某些成员互作，完成侵染循环，同时敲除eIF4E1和两个成员有望获得Potyviruses抗性的育种材料。本发明通过聚合eifiso4e-sKO突变体、eifiso4e-tKO突变体和eif4e1突变体，获得兼抗PVYWT、PVYvaB、ChiVMV和TVBMV基因资源和抗病材料。对茄科作物烟草、马铃薯、辣椒、番茄抗Potyviruses育种具有重要的借鉴作用。
发明内容
本发明目的在于提供一种获得对马铃薯Y病毒属病毒抗性的烟草植物的方法。
本发明目的通过以下四个步骤实现：A步骤：通过基因编辑、物理诱变、化学诱变、种质资源筛选、基因人工合成、基因表达干涉等方法，获得eIFiso4E-S敲除(eifiso4e-sKO)的材料。B步骤：通过基因编辑、物理诱变、化学诱变、种质资源筛选、基因人工合成、基因表达干涉等方法，获得eIFiso4E-T敲除(eifiso4e-tKO)的材料。C步骤：通过基因编辑、物理诱变、化学诱变、种质资源筛选、基因人工合成、基因表达干涉等方法，获得eIF4E1敲除(eif14e1KO)的材料。 D步骤：将上述A、B和C步骤获得的材料聚合，获得eIFiso4E-S 敲除(eifiso4e-sKO)、eIFiso4E-T敲除(eifiso4e-tKO)与eIF4E1敲除 (eif14e1KO)的聚合的各种组合。
优选的应用途径为：(1)在上述A步骤获得的材料的基础上，获得上述B步骤的目标材料；或者在上述B步骤获得的材料的基础上，获得上述A步骤的目标材料。(2)分别获得上述A步骤的目标材料、B步骤的目标材料，然后利用杂交育种、体细胞杂交等方式聚合，获得eIFiso4E-S敲除(eifiso4e-sKO)与eIF4E1敲除(eif14e1KO) 的聚合的各种组合。
进一步优选的应用途径为：(1)在eIF4E1敲除(eif4e1KO)的基础上，通过基因编辑、化学诱变、物理诱变得到含eifiso4e-sKO/eif4e1KO基因的烟草植株，在eifiso4e-sKO/eif4e1KO基础上进一步获得 eifiso4e-sKO/eifiso4e-tKO/eif4e1KO基因的烟草植株。(2)从烟草属植物中分别筛选获得包含eifiso4e-sKO、eifiso4e-tKO和eif4E1KO基因的种质资源；所述的种质资源包含烟草野生种、栽培种、以及野生种与栽培种的杂交种。然后，通过杂交、回交等育种手段，获得含 eifiso4e-sKO/eifiso4e-tKO/eif4e1KO基因的烟草植株。
更进一步优选的应用途径为：(1)在eIF4E1敲除(eif4e1KO)的基础上，通过设计同时靶向eIFiso4E-S和eIFiso4E-TKO的基因编辑载体，通过筛选双基因突变体，获得eifiso4e-sKO/eifiso4e-tKO/eif4e1KO基因的烟草植株。
根据所述获得对马铃薯Y病毒属病毒抗性的烟草植株的方法，可以得到新的抗Potyviruses烟草品种、及其种子和无性繁殖体。另外，还可以开发一些基因工程产品，包括A:所述eIFiso4E-S基因 Knockout的表达盒，转基因细胞系和重组菌等。B:所述eIFiso4E-S基因Knockout的表达盒，转基因细胞系和重组菌等。C:包括所述 eIF4E1基因Knockout的表达盒，转基因细胞系和重组菌等。D:所述eIFiso4E-S基因、eIFiso4E-T基因和eIFiso4E1基因两两或三个同时Knockout的表达盒，转基因细胞系和重组菌等。利用上述基因工程产品使烟草获得对Potyviruses的抗性。
定义：基因敲除：gene knockout(简写:KO)，指利用遗传操作技术使生物体的一个或多个基因失去功能。基因敲除的方法有同源重组(homologous recombination)和位点特异性核酸酶技术(site-specific nucleases)。位点特异性核酸酶技术包括锌指核酸酶(Zinc-finger nucleases，ZFN)、类转录激活因子效应物核酸酶(Transcriptionactivator-like effector nucleases，TALENs))。规律成簇的间隔短回文重复核酸酶技术(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats， CRISPR)。基因敲除可产生基因失去功能突变体(Loss-of-function, LOS)。
染色体片段导入：通常通过系统回交和自交，并借助于分子标记辅助选择使供体亲本的片段导入到轮回亲本中。
基因导入是将外源基因导入目的烟草中，包括将外源基因转入后导入(即转基因)和直接导入，转基因最常用的方法为农杆菌转化法；直接导入的方法包括显微注射、花粉管通道法、电导、基因枪等常规生物学方法转化烟草细胞或组织，并将转化的组织培育成植株。
基因编辑是近年来发展起来的可以对基因组完成精确修饰的一种技术，可完成基因定点InDel突变、敲入、多位点同时突变和小片段的删除等，可在基因组水平上进行精确的基因编辑。基因编辑最常用的方法括锌指核酸酶、类转录激活因子效应物核酸酶、规律成簇的间隔短回文重复核酸酶技术。
基因沉默(gene silencing)：外源基因存在于生物体内，并未丢失或损伤，但该基因不表达或表达量极低的现象。基因沉默分为转录水平的沉默(TGS)和转录后水平的沉默(PTGS)。TGS是指基因在细胞核内RNA合成受到了阻止导致基因沉默，PTGS是指基因在细胞核中能够稳定的转录，但在细胞质中无对应的mRNA存在。基因沉默所述方法包括但不限于有义抑制/共抑制、反义抑制、双链 RNA(dsRNA)干扰、发夹RNA干扰和含内含子的发夹RNA干扰、扩增子介导的干扰、核酶和小干扰RNA或微小RNA。
物理化学诱变：指利用物理因素或化学因素使植物基因产生变异。物理诱变剂主要有紫外线，X-射线，γ-射线，快中子，激光，微波，离子束等。化学诱变剂主要有已知的有烷化剂、碱基类似物(base analog)、羟胺(hydroxylamine)、吖啶色素、亚硝酸、叠氮化钠等。烷化剂包括但不限于：烷基磺酸盐和烷基硫酸盐，代表药剂为甲基磺酸乙酯(EMS)、硫酸二乙酯(DES)；2.亚硝基烷基化合物，代表药剂为亚硝基乙基脲(NEH)、N-亚硝基-N-乙基脲烷(NEU)；3.次乙胺和环氧乙烷类，代表药剂为乙烯亚胺(EI)；4.芥子气类，氮芥类、硫芥类。
具体实施方式
下面对本发明作进一步说明，但不以任何方式对本发明加以限制，基于本发明教导所作的任何变换，均落入本发明保护范围。
下面结合实施例进行进一步的说明和验证。
如无特殊说明，下述各实施例使用的均为常规方法；如无特殊说明，所用的试验材料均为自常规生化试剂公司购买得到的。烟草材料为Nicotiana tabacum cv Yunyan87(基因型eIFiso4E-S/ eIFiso4E-T/eIF4E1，感PVYWT，感PVYvaB，感ChiVMV，感TVBMV)，红花大金元(基因型eIFiso4E-S/eIFiso4E-T/eIF4E1，感PVYWT，感 PVYvaB，感ChiVMV，感TVBMV)，2-1398(基因型eIFiso4E-S/ eIFiso4E-T/va，包含va位点，抗PVYWT，感PVYvaB，感ChiVMV，感TVBMV)均来自云南省烟草农业科学研究院。Potyviruses病毒，包括PVYWT、PVYvaB、TVBMV、ChiVMV来自云南省烟草农业科学研究院。使用TRIzol试剂(Invitrogen；Carlsbad，CA)按照厂商的方案从烟草叶片中提取总RNA。
Gateway LR clonase Enzyme Mix kit、pENTR 2B载体购自 Invitrogen公司，农杆菌GV3101购自Invitrogen公司。pHellsgate 8载体购自thermofisher公司。质粒DNA提取试剂盒、琼脂糖凝胶DNA 回收试剂盒、DNA片段纯化试剂盒购自QIAGEN公司。大肠杆菌(Escherichia coli)DH 5α；限制性内切酶、反转录试剂盒、DNA Marker、 PrimeSTAR GXLDNA Polymerase、T4 DNA聚合酶及T4 DNA连接酶、壮观霉素均购自大连宝生物公司和Roche公司。RNA提取试剂盒Trizol购自Invitrogen公司，检测PVY的ELISA试剂盒购自上海羽朵生物科技有限公司。检测ChiVMV的ELISA试剂盒购自上海羽朵生物科技有限公司。
大肠杆菌(Escherichia coli)DH5α菌株、农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)EHA105、C58C1菌株由本实验室保存。克隆载体pLB 购自TIANGEN公司。
实施例1：同时编辑烟草eIFiso4E-S基因和eIFiso4E-T基因敲除载体的构建
用于本发明基因敲除表达载体构建的质粒pRGEB31在文献“Xie, K.and Y.Yang(2013)."RNA-guided genome editing in plants using a CRISPR-Cas system."MolPlant 6(6):1975-1983.”中公开过；
1.根据CRISPR/Cas9技术设计靶位点的原则，本发明靶位点设计在 eIFiso4E-S基因和eIFiso4E-T基因第一个外显子上。寻找靶位点时，首先从第一个外显子序列上找到PAM(NGG或CCN，在基因序列上的形式为5’-NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGG-3’或 5’-CCNNNNNNNNNNNNNNNNNNN NN-3’)位点，
2.gRNA的oligo合成与退火
2.1以gRNA靶位点为模板，按照如下格式设计引物oligo，为确保基因敲除事件效率，本发明针对eIFiso4E-S基因和eIFiso4E-T基因第一个外显子选择了两个靶位点，设计引物序列如下，其中F和R分别代表正、反向引物：
gRNA1F 5’-GGCAcgcctctatcggtgcttcag-3’
gRNA1R 5’-AAACctgaagcaccgatagaggcg-3’
gRNA2F 5’-GGCActagagaggagatggacattc-3’
gRNA2R 5’-AAACgaatgtccatctcctctctag-3’
2.2引物退火
合成的一对互补DNA oligo退火形成dsDNA，退火体系如下：
退火程序为:95℃5mim，90℃1mim，80℃1mim，70℃1mim， 60℃1mim，50℃1mim，40℃1mim，30℃1mim，20℃1mim， 10℃1mim。
2.3.酶切pRGEB31质粒
酶切后回收大片段的酶切产物。
2.4.pRGEB31质粒回收的片段与退火后形成的dsDNA的连接体系：
2.5连接产物转化大肠杆菌并进行菌落PCR鉴定阳性克隆，菌落PCR 的检测正向引物为：OsU3 5'F 5’-aaggaatctttaaacatacgaacag-3’反向引物为退火合成sgRNA的反向序列eIFiso4E-S_gRNA1R或 eIFiso4E-S_gRNA2R)
2.6将扩增得到的阳性克隆摇菌并进行测序，分析gRNA是否正确。测序引物为OsU35'F
实施例2：基因敲除载体的植物转化和基因敲除植株检测
将连接正确的质粒，电击转化农杆菌GV3101。农杆菌介导转化烟草愈伤组织获得转基因植株。分别以含有纯合va基因位点的烟草 2-1398为材料诱导愈伤组织，进行农杆菌介导的烟草转化实验。以 GV3101农杆菌进行侵染转化，经过潮霉素抗性筛选，抗性愈伤组织分化再生获得转基因阳性株系。
A.转基因烟草中eIFiso4E-S基因突变体的检测
设计目的基因检测引物。根据目的基因在靶位点序列上游和下游分别设计引物，引物序列分别为：
eIFiso4E-SEditestF 5’-gattaccggcccagtctgtcatcat-3’
eIFiso4E-SEditestR 5’-ggaacaaaatccgaatttatcaataact-3’
将获得的转基因阳性植株提取基因组DNA进行PCR反应。利用 PCR产物进行测序，测序公司为天津宝生物公司，测序引物序为 eIFiso4E-SeditestF。
B.转基因烟草中eIFiso4E-T基因突变体的检测：设计目的基因检测引物。根据目的基因在靶位点序列上游和下游分别设计引物，引物序列分别为：
eIFiso4E-TEditestF：5’-gattaccggcccagtctgtcatcat-3’
eIFiso4E-TEditestR：5’-ggaacaaaatccgaatttatcaataact-3’
将获得的转基因阳性植株提取基因组DNA进行PCR反应。利用 PCR产物进行测序，测序公司为赛默飞世尔科技公司(广州)，测序引物序为eIFiso4E-TEditestF。
实施例3：聚合eifiso4e-tKO、eifiso4e-tKO和va的三突材料获得
采用实施例1构建的CRISPR-Cas9基因编辑载体，转化va烟草 2-1398(基因型eIFiso4E-S/eIFiso4E-T/va)(方法见实施例2)。对T0 代苗通过PCR扩增测序，筛选出eIFiso4E-S杂合突变的单株 2-1398g1-2B，2-1298g1-2B的eIFiso4E-S双等位突变的序列如SEQ ID No.1所示，位点1缺失第11位至第18位核苷酸、位点2缺失第11 位至第17位核苷酸。导致eIFiso4E-S多肽翻译移码，产生功能失活的多肽。
表2利用基因编辑获得的eIFiso4E-S基因exon1的突变位点
序列 核苷酸突变
eIFiso4E-S ATGGCCACTGAAGCACCGATAGAGGC 野生型
2-1398g1-2B位点1 ATGGCCACTG-------ATAGAGGC -AAGCACCG
2-1398g1-2B位点2 ATGGCCACTG-------GATAGAGGC -AAGCACC
筛选出eIFiso4E-T纯合突变的单株2-1398g1-2B，2-1298g1-2B 的eIFiso4E-T纯合突变的序列如SEQ ID No.3所示第11-12位核苷酸缺失(-AA)见表3。导致eIFiso4E-T多肽翻译移码，产生功能失活的多肽。
表3利用基因编辑获得的eIFiso4E-T基因exon1的突变位点
序列 核苷酸突变
eIFiso4E-T ATGGCCACTGAAGCACCGATAGAGGC 野生型
2-1398g1-2B位点2 ATGGCCACTG--GCACCGATAGAGGC -AA
2-1298g1-2B的T0单株为eifiso4e-sKO、eifiso4e-tKO和va的三突材料，基因型为eifiso4e-sKO/eifiso4e-tKO/va。2-1298g1-2B的T0自交收种获得T1代种子，用于对Potyviruses病毒的抗性鉴定，包括ChiVMV TVBMV、PVYvaB和PVYWT病毒。
实施例4：聚合eifiso4e-sKO、eifiso4e-tKO和va烟草具有ChiVMV 抗性
2-1298g1-2B的T1代种子常规方法育苗盆栽T1植株。以2-1398 为对照。4-5片叶时，接种ChiVMV病叶汁液40倍。接种后13d、 21d、28d调查ChiVMV发病情况。
接种ChiVMV结果表明(表4)，对照2-1398(基因型va)接种后14天和接种后21dpi的发病率分别为87.5％和96.88％，表明对照 2-1398(基因型va)表现为感ChiVMV。2-1398g1-2B(基因型 eifiso4e-sKO/eifiso4e-tKO/va)接种后14天、接种后21天的发病率分别为14.1％、18.75％。接种后21天，随机对12株苗的系统叶取样，统一从上往下数第3片叶，采用2ml离心管管盖压取2个叶圆片，采用ELISA检测试剂盒检测ChiVMV病毒。对照2-1398的2个样本的 OD450平均值为0.254，2-1398g1-2B的12个样本的OD405平均值为0.144，ELISA检测结果与发病率数据相吻合。表明 eifiso4e-sKO/eifiso4e-tKO/va具有抗ChiVMV的功能。
表4聚合eifiso4e-sKO/eifiso4e-tKO/va烟草对ChiVMV的抗性
实施例5：聚合eifiso4e-sKO、eifiso4e-tKO和va烟草具有TVBMV 抗性
2-1398g1-2B T1代种子，常规方法育苗盆栽T1植株96株。以 2-1398为对照。4-5片叶时，接种TVBMV病叶汁液40倍。接种后 14d、21d调查TVBMV发病情况。结果表明(表4)，接种后14天对照2-1398(基因型va)的发病率为100％，接种后14天和接种后 21天2-1398g1-2B(基因型eifiso4e-sKO/eifiso4e-tKO/va)的发病率为0，表明eifiso4e-sKO/eifiso4e-tKO/va具有抗TVBMV的功能。
表5聚合eifiso4e-sKO/eifiso4e-tKO/va烟草对TVBMV的抗性
接种后第32天，采集单株叶片，提取总RNA，采用OligoT引物反转录获得cDNA。根据TVBMV的VPg序列设计PCR引物，扩增产物大小为765bp，退火温度60℃。
TVBMVVPg_F：5’-AACTCAAGAGTCGTTGGAACA-3’
TVBMVVPgR：5’-CAAGCAAGCATATACACTTAGC-3’
通过PCR扩增检测。结果表明，2-1398g1-2B接种TVBMV后的 12个样品无目标扩增条带，而2-1398接种TVBMV后有目标扩增条带。表明2-1398g1-2B抗TVBMV，而对照2-1398感TVBMV。
实施例6：聚合eifiso4e-sKO、eifiso4e-tKO和va烟草具有具有持久抗PVY的生物学功能
2-1298g1-2B T1代种子，常规方法育苗盆栽T1植株。以2-1398 为对照。4-5片叶时，分别接种PVYWT、PVYvaB病叶汁液40倍。接种后13d、21d、28d、35d调查PVY发病情况。
接种PVYvaB结果表明(表6)，对照2-1398(基因型va)接种后 13天和接种后28dpi的发病率分别为87.5％和100％，表明对照2-1398 (基因型va)表现为感PVYvaB。2-1398g1-2B(基因型 eifiso4e-sKO/eifiso4e-tKO/va)接种后13天至接种后35天的发病率为0。接种后14天，随机对16株苗的系统叶取样，统一从上往下数第3片叶，采用2ml离心管管盖压取2个叶圆片，采用ELISA检测试剂盒检测PVY病毒。对照2-1398的12个样本的OD405平均值为2.45， 2-1398g1-2B的12个样本的OD405平均值为0.092，ELISA检测结果与发病率数据相吻合。表明eifiso4e-sKO/eifiso4e-tKO/va具有抗PVYvaB的功能。
表6聚合eifiso4e-sKO/eifiso4e-tKO/va烟草对PVYvaB的抗性
接种PVYWT结果表明(表7)，对照2-1398(基因型va)接种后 13天、21天、28天的发病率分别为12.5％、43.8％、100％，表明对照2-1398(基因型va)对PVYWT表现非持久抗性，接种后第28天， va抗性被克服。2-1398g1-2B(基因型eifiso4e-sKO/eifiso4e-tKO/va)接种后13天至接种后35天的发病率为0。
表7聚合eifiso4e-sKO/eifiso4e-tKO/va烟草对PVYWT的抗性
综合接种PVYWT、PVYvaB的结果，表明eifiso4e-sKO/eifiso4e-tKO/va 对PVY具有持久抗性，其抗性明显高于单独的va烟草。聚合 eifiso4e-sKO、eifiso4e-tKO和va具有显著的对PVY野生型病毒(PVYWT) 和可克服va抗性的突变病毒(PVYvaB)的持久抗性，其抗性可持续至接种高浓度病毒后35天以上。而常规的va烟草，在相同的接种条件下，其抗性在接种后第28天被100％克服。
综合实施例4-6，2-1398g1-2B(基因型为 eifiso4e-sKO/eifiso4e-tKO/va)接种ChiVMV、TVBMV、PVYvaB和PVYWT的结果，表明eifiso4e-sKO/eifiso4e-tKO/va对上述四种Potyviruese病毒具有抗性，而单独的va烟草、单独的eifiso4e-sKO、单独的eifiso4e-sKO烟草不能同时抗上述四种Potyviruese病毒。因此，利用本发明的方法，选育出对Potyviruses具有广谱抗性的烟草，在生产上具有重大的应用前景。
SEQUENCE LISTING
<110> 云南省烟草农业科学研究院
<120> 一种选育广谱抗马铃薯Y病毒属病毒的烟草植物的方法
<130> 20180715
<160> 6
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 603
<212> DNA
<213> Nicotiana tabacum L.
<400> 1
atggccactg aagcaccgat agaggcgacg gaggttccgc cggcgtcagc gacggagacg 60
gtggcgaagc agccacataa gctagagagg agatggacat tctggttcga taatcaatct 120
aagccgaaac aaggagccgc ttggggaagt tctcttcgaa aagcttatac tttcgaaact 180
gttgaggaat tctggagttt atatgatcag atattcaagc ccagcaagtt gactgctaat 240
gcggactttc atttgttcaa agctgggatt gagcccaaat gggaagatcc tgagtgtgct 300
agtggtggca agtggactgt tacgagcagc agaaaggcta atcttgagac tatgtggctt 360
gaaactctga tggcattggt cggtgagcag tttgatgagt cagaggagat atgtggagtg 420
gttgccagtg tacgtcggag tcaggataaa ctttccttat ggactaagac tgcctccaat 480
gaagcaattc aggtgagcat tggtaggaag tggaaggaga tcattgatgc tgaaaaaata 540
tcctatagtt tccatgatga ctctaaaagg gaaaggtcag ctaagagtcg atatactgtg 600
tga 603
<210> 2
<211> 200
<212> PRT
<213> Nicotiana tabacum L.烟草
<400> 2
Met Ala Thr Glu Ala Pro Ile Glu Ala Thr Glu Val Pro Pro Ala Ser
1 5 10 15
Ala Thr Glu Thr Val Ala Lys Gln Pro His Lys Leu Glu Arg Arg Trp
20 25 30
Thr Phe Trp Phe Asp Asn Gln Ser Lys Pro Lys Gln Gly Ala Ala Trp
35 40 45
Gly Ser Ser Leu Arg Lys Ala Tyr Thr Phe Glu Thr Val Glu Glu Phe
50 55 60
Trp Ser Leu Tyr Asp Gln Ile Phe Lys Pro Ser Lys Leu Thr Ala Asn
65 70 75 80
Ala Asp Phe His Leu Phe Lys Ala Gly Ile Glu Pro Lys Trp Glu Asp
85 90 95
Pro Glu Cys Ala Ser Gly Gly Lys Trp Thr Val Thr Ser Ser Arg Lys
100 105 110
Ala Asn Leu Glu Thr Met Trp Leu Glu Thr Leu Met Ala Leu Val Gly
115 120 125
Glu Gln Phe Asp Glu Ser Glu Glu Ile Cys Gly Val Val Ala Ser Val
130 135 140
Arg Arg Ser Gln Asp Lys Leu Ser Leu Trp Thr Lys Thr Ala Ser Asn
145 150 155 160
Glu Ala Ile Gln Val Ser Ile Gly Arg Lys Trp Lys Glu Ile Ile Asp
165 170 175
Ala Glu Lys Ile Ser Tyr Ser Phe His Asp Asp Ser Lys Arg Glu Arg
180 185 190
Ser Ala Lys Ser Arg Tyr Thr Val
195 200
<210> 3
<211> 588
<212> DNA
<213> Nicotiana tabacum L.烟草
<400> 3
atggccactg aagcaccgat agaggcgacg gaggttctgc cggcgccgga tacggtggag 60
aagcagccgc ataagctaga gaggagatgg acattctggt tcgataagcc gaagcaaggc 120
gctgtttggg caagtgctct tcgaaaagcc tatactttcg aaactgttga ggaattctgg 180
agtttatatg atcagatatt caagcccagc aagttgactg ctaatgcgga ctttcatttg 240
ttcaaagctg ggattgagcc caaatgggaa gatcctgagt gtgccaatgg tggcaagtgg 300
actgtcacga gcagcagaaa ggctaatctt gagactatgt ggcttgaaac tctgatggca 360
ttggtgggtg agcaatttga tgaatcagaa gagatatgtg gagtggttgc cagtgttcgt 420
cggagtcagg ataaactttc cttgtggact aggactgcct ccaatgaagc agctcagatg 480
agcattggta ggaagtggaa ggagatcatc gatgctgaaa aaatatccta tagtttccat 540
gatgactcta aaaaggaaag gtcagttaag agtcgatata ctgtgtga 588
<210> 4
<211> 195
<212> PRT
<213> Nicotiana tabacum L.烟草
<400> 4
Met Ala Thr Glu Ala Pro Ile Glu Ala Thr Glu Val Leu Pro Ala Pro
1 5 10 15
Asp Thr Val Glu Lys Gln Pro His Lys Leu Glu Arg Arg Trp Thr Phe
20 25 30
Trp Phe Asp Lys Pro Lys Gln Gly Ala Val Trp Ala Ser Ala Leu Arg
35 40 45
Lys Ala Tyr Thr Phe Glu Thr Val Glu Glu Phe Trp Ser Leu Tyr Asp
50 55 60
Gln Ile Phe Lys Pro Ser Lys Leu Thr Ala Asn Ala Asp Phe His Leu
65 70 75 80
Phe Lys Ala Gly Ile Glu Pro Lys Trp Glu Asp Pro Glu Cys Ala Asn
85 90 95
Gly Gly Lys Trp Thr Val Thr Ser Ser Arg Lys Ala Asn Leu Glu Thr
100 105 110
Met Trp Leu Glu Thr Leu Met Ala Leu Val Gly Glu Gln Phe Asp Glu
115 120 125
Ser Glu Glu Ile Cys Gly Val Val Ala Ser Val Arg Arg Ser Gln Asp
130 135 140
Lys Leu Ser Leu Trp Thr Arg Thr Ala Ser Asn Glu Ala Ala Gln Met
145 150 155 160
Ser Ile Gly Arg Lys Trp Lys Glu Ile Ile Asp Ala Glu Lys Ile Ser
165 170 175
Tyr Ser Phe His Asp Asp Ser Lys Lys Glu Arg Ser Val Lys Ser Arg
180 185 190
Tyr Thr Val
195
<210> 5
<211> 660
<212> DNA
<213> Nicotiana tabacum L.烟草
<400> 5
atggcagagg aagctgagaa attgcgggta gatgaagtag aagtagtcga cgatggacct 60
gaagaaggag aaattgtgga tgaatctgat gatacggcgt cgtatttggg caaagaaatc 120
aaacctaagc atccattaga gaattcttgg actttttggt ttgataatcc tatggctaaa 180
tctagacaag ctgcttgggg cagttccctt cgcgaacttt acactttttc cactgtcgaa 240
gatttttggg gtgtttacaa taatatcaac cacccaagca agttagttgt gggagcagac 300
tttcattgtt ttaagcataa aattgagcca aagtgggaag atcctgtatg tgcgaatgga 360
gggaattgga caatgagctt tagtaagggt aaatctgata ccagctggct atacacgctg 420
ctggcaatga ttggacatca attcgatcat ggagaggaaa tttgtggagc agtagttagc 480
gtccgaaata agggggataa aatagcttta tggaccaaga atgctgcaaa tgaaacagct 540
caggttagca ttggtaagca atggaaggag tttctggatt acagcaactc gattggcttc 600
atatttcatg acgactcaat gaggctcggc agaggtgcca agaatcgtta tacagtatag 660
<210> 6
<211> 219
<212> PRT
<213> Nicotiana tabacum L.烟草
<400> 6
Met Ala Glu Glu Ala Glu Lys Leu Arg Val Asp Glu Val Glu Val Val
1 5 10 15
Asp Asp Gly Pro Glu Glu Gly Glu Ile Val Asp Glu Ser Asp Asp Thr
20 25 30
Ala Ser Tyr Leu Gly Lys Glu Ile Lys Pro Lys His Pro Leu Glu Asn
35 40 45
Ser Trp Thr Phe Trp Phe Asp Asn Pro Met Ala Lys Ser Arg Gln Ala
50 55 60
Ala Trp Gly Ser Ser Leu Arg Glu Leu Tyr Thr Phe Ser Thr Val Glu
65 70 75 80
Asp Phe Trp Gly Val Tyr Asn Asn Ile Asn His Pro Ser Lys Leu Val
85 90 95
Val Gly Ala Asp Phe His Cys Phe Lys His Lys Ile Glu Pro Lys Trp
100 105 110
Glu Asp Pro Val Cys Ala Asn Gly Gly Asn Trp Thr Met Ser Phe Ser
115 120 125
Lys Gly Lys Ser Asp Thr Ser Trp Leu Tyr Thr Leu Leu Ala Met Ile
130 135 140
Gly His Gln Phe Asp His Gly Glu Glu Ile Cys Gly Ala Val Val Ser
145 150 155 160
Val Arg Asn Lys Gly Asp Lys Ile Ala Leu Trp Thr Lys Asn Ala Ala
165 170 175
Asn Glu Thr Ala Gln Val Ser Ile Gly Lys Gln Trp Lys Glu Phe Leu
180 185 190
Asp Tyr Ser Asn Ser Ile Gly Phe Ile Phe His Asp Asp Ser Met Arg
195 200 205
Leu Gly Arg Gly Ala Lys Asn Arg Tyr Thr Val
210 215

Claims (10)

1.一种选育广谱抗马铃薯Y病毒属病毒的烟草植物的方法，其特征在于，所述方法向烟草基因组引入至少3种真核生物翻译起始因子(eIF4E)家族基因中各至少一种等位基因内的突变，所述突变降低真核生物翻译起始因子的表达或功能，且其中所述真核生物翻译起始因子家族基因的第一种基因编码eIFiso4E-S多肽，其中所述真核生物翻译起始因子家族基因的第二种基因编码eIFiso4E-T多肽，其中所述真核生物翻译起始因子家族基因的第三种基因编码eIF4E1多肽，其中：
a)所述eIFiso4E-S基因的所述突变导致所述eIFiso4E-S多肽翻译提前终止或阅读框移码或氨基酸转换，所述eIFiso4E-S基因突变发生于编码SEQ ID NO:2多肽的外显子区域；或者
b)所述eIFiso4E-T基因的所述突变导致所述eIFiso4E-T多肽翻译提前终止或阅读框移码或氨基酸转换，所述eIFiso4E-T基因突变发生于编码SEQ ID NO:4多肽的外显子区域；或者
c)所述eIF4E1基因的所述突变导致所述eIF4E1多肽缺失，所述突变导致包含SEQ IDNO:5核苷酸的序列缺失。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述eIFiso4E-S基因突变发生于SEQ ID NO:1所示区域，所述编号的依据是SEQ ID NO:1，选自以下组：a)第11至第18位核苷酸缺失；第11至第17位核苷酸缺失；(2-1398g1-2B,)；第11位增加一个A(2-1398g1-2G)
b)在靶位点增加1-n个碱基、删除1-n个碱基，n为2至10的整数；
c)碱基替换导致氨基酸转换；
d)其任意组合。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述eIFiso4E-T基因突变发生于SEQ ID NO:3所示区域，所述编号的依据是SEQ ID NO:3，选自以下组：
a)第11-12位核苷酸缺失；(2-1398g1-2B,)第11位核苷酸缺失；第11-15位核苷酸缺失(2-1398g1-2G,)
b)在靶位点增加1-n个碱基、删除1-n个碱基，n为2至10的整数；
c)碱基替换导致氨基酸转换；
d)其任意组合。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述eIF4E1基因突变对应SEQ ID NO:5核苷酸位置，选自以下组：
a)包含SEQ ID NO:5的核苷酸序列缺失
b)第105位核苷酸G突变为A(G105A)
c)碱基替换导致氨基酸转换；
d)其任意组合。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述植物的所述突变为纯合；所述引入包括基因组编辑或诱变处理；所述引入包括育种方案；所述烟草植物是烤烟、白肋烟、香料烟、晒晾烟或深色烟植物。
6.一种鉴定具有低水平去甲烟碱的烟草植物的方法，所述方法包括从感兴趣的烟草植物中筛选SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:5内存在突变的DNA样品，其中所述突变导致所述烟碱去甲基化酶的表达或功能降低，且其中所述筛选采用选自SEQ ID NO:1、3、5的序列进行。
7.一种获得对马铃薯Y病毒属病毒抗性的烟草植物的方法，其特征在于，所述方法根据是否存在S SEQ ID NO:1的编码基因中的突变和是否存在T SEQ ID NO:3的编码基因中的突变和否存在vaSEQ ID NO:5的编码基因中的突变来从感兴趣的烟草植物中筛选存在突变的DNA样品。
8.一种含选自以下组的核苷酸序列的分离多核苷酸:
(a)SEQ ID NO:1、3、或5所示的核苷酸序列；
b)编码选自SEQ ID NO:2、4或6所示多肽的核苷酸序列；和
c)与前述条目(a)或(b)所述的序列互补的核苷酸序列。
9.获得对马铃薯Y病毒属病毒抗性的烟草植物的方法，其特征在于，烟草植物包含eIFiso4E-S基因中降低真核生物翻译起始因子的表达或功能的突变、eIFiso4E-T基因中降低真核生物翻译起始因子的表达或功能的突变、eIF4E1基因中降低真核生物翻译起始因子的表达或功能的突变；
所述马铃薯Y病毒属病毒包括但不限于野生型马铃薯Y病毒(PVYWT)、va抗性突破性马铃薯Y病毒(PVYvaB)辣椒脉斑驳病毒(ChiVMV)和烟草脉带花叶病毒(TVBMV)。
10.一种根据权利要求1所述一种获得对马铃薯Y病毒持久抗性(durable resistance)烟草植物的方法在烟草抗病育种中的应用。
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