CN109354597A - 新型糖基化合物及其构建的生物抗菌材料 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种能够特异性识别绿脓杆菌的式I所示糖基叠氮配体化合物、包含所述糖基叠氮配体化合物的IIa或式IIb所示的糖基化合物以及包含所述糖基化合物的生物抗菌材料，式中R为糖基。本发明的生物抗菌材料能够达到更彻底的抑菌效果，并且将绿脓杆菌的诊疗范围从体外游离态扩展至活体表皮感染组织且延伸至体内骨修复材料。

Description

新型糖基化合物及其构建的生物抗菌材料
技术领域
本发明涉及药学领域；具体地说，本发明涉及具有抗菌活性，特别是抗耐药菌活性的新型糖基化合物以及包含这种糖基化合物的生物抗菌材料，例如生物医用材料。
背景技术
纳米材料是指其结构单元的尺寸介于1纳米～100纳米范围之间的材料。由于尺寸已经接近电子的相干长度，它的性质因为强相干所带来的自组织使得性质发生很大变化。并且，其尺度已接近光的波长，加上其具有大表面的特殊效应，因此所表现出的特性，例如熔点、磁性、光学、导热、导电特性等往往不同于该物质在整体状态时所表现的性质。
抗菌材料是国际上新兴的生态环境材料，而将纳米抗菌剂添加到纳米材料中，制成的纳米抗菌材料不仅具有优异的纳米材料特性，还具有抗菌功能，从而扩大了纳米材料的应用范围。
近年来，耐药菌已经成为临床医生难以攻克的对象，有些耐药菌甚至被称为“超级细菌”。临床实验研究发现，有些多重耐药MRSA所引发的感染造成任何药物治疗的效果均不理想。据统计学显示，在欧美等发达国家，喹诺酮类的药物对于大肠埃希氏菌来说都很敏感，耐药率一般都比较低，维持在5％左右。然而，在我国，抗生素的滥用导致了目前临床上出现很多的耐药菌。例如，由于喹诺酮类抗生素大量低成本生产，导致市场上无约束地过量使用，目前我国已经成为大肠埃希氏菌对喹诺酮类药物耐药率最高的国家。
绿脓杆菌广泛存在于自然界中，其感染可发生在人体内任何组织部位，已是医院患者皮肤伤口感染的常见细菌之一，成为引发许多病人严重感染的主要原因。常见的绿脓杆菌抗生素有氨基糖苷类、头胞类等。然而，临床上发现绿脓杆菌已经对众多抗生素产生了不同程度的耐药性，大多数来自临床分离的绿脓杆菌对所有的氨基糖苷类抗生素产生明显的耐药性。在临床上已出现很多耐药型绿脓杆菌，对抵抗力低下的住院病患造成了极大的危害。于是控制抗生素的使用量及寻找有效的非抗生素类抗菌药物，成为科研人员急需解决的重要科学问题。
研究发现，细菌越来越难以根除，貌似对外界攻击自身产生了保护屏障，除了长期抗生素使用引发的耐药基因突变以外，大多数细菌是由于其菌体表面形成了顽固的生物被膜，阻止外界药物的入侵，甚至有研究发现，有些抗生素或抗菌药物的用量不当反而会促进细菌的生物被膜形成。以生物被膜作为保护屏障的耐药菌也越来越多，临床研究发现医院的各种环境表面均携带以生物被膜形式存在的病原菌，而常规的双氧水和表面活性剂消毒处理难以去除，单纯的药物往往不能有效地降解生物被膜，于是也就不能完全作用于菌体，从而彻底消灭细菌。
因此，本领域急需检测和治疗耐药菌，特别是绿脓杆菌的新型技术手段。
发明内容
本发明的目的在于提供一种新型的糖基化合物以及利用该糖基化合物构建的生物抗菌材料；所述糖基化合物以及生物抗菌材料的制备简便、环境友好，并且所述生物抗菌材料的载药量显著提高。
在第一方面，本发明提供一种式I所示糖基叠氮配体化合物：
R-L1-O-L2-N3 I
式中，R为糖基；
L1和L2各自独立为取代或未取代的1-6个碳原子的亚烷基接头；优选取代或未取代的1-3个碳原子的亚烷基接头；更优选取代或未取代的2个碳原子的亚烷基接头。
在具体的实施方式中，所述化合物如下式I’所示：
式中，R如上文所限定。
在具体的实施方式中，所述糖基可以是单糖基、双糖基、多糖基。
在优选的实施方式中，所述单糖包括但不限于：甘油醛、赤藓糖、苏力糖、阿拉伯糖、核糖、木糖、来苏糖、葡萄糖、甘露糖、果糖、半乳糖、岩藻糖；优选半乳糖、岩藻糖；
所述双糖包括但不限于：乳糖、蔗糖、海藻糖、麦芽糖；优选麦芽糖；和
所述多糖包括但不限于：纤维素、糖原和淀粉。
在具体的实施方式中，式I’所示糖基叠氮配体化合物为以下化合物：
优选
在第二方面，本发明提供一种式IIa或式IIb所示的糖基化合物：
式中，R为糖基；
L1和L2各自独立为取代或未取代的1-6个碳原子的亚烷基接头；优选取代或未取代的1-3个碳原子的亚烷基接头；更优选取代或未取代的2个碳原子的亚烷基接头。
在具体的实施方式中，所述化合物如下式IIa’或式IIb’所示：
式中，R如上文所限定。
在具体的实施方式中，所述糖基可以是单糖基、双糖基、多糖基。
在优选的实施方式中，所述单糖包括但不限于：甘油醛、赤藓糖、苏力糖、阿拉伯糖、核糖、木糖、来苏糖、葡萄糖、甘露糖、果糖、半乳糖、岩藻糖；优选半乳糖、岩藻糖；
所述双糖包括但不限于：乳糖、蔗糖、海藻糖、麦芽糖；优选麦芽糖；和
所述多糖包括但不限于：纤维素、糖原和淀粉。
在具体的实施方式中，式IIa’所示糖基化合物为以下化合物：
优选
式IIb’所示糖基化合物为以下化合物：
优选
在第三方面，本发明提供一种生物抗菌材料，所述生物抗菌材料包含第二方面所述的糖基化合物。
在优选的实施方式中，所述生物抗菌材料是生物医用材料；优选复合材料。
在优选的实施方式中，所述复合材料是纳米材料，包括但不限于：纳米金、纳米银、纳米锌、纳米铜等金属离子的纳米材料；或二维纳米材料。
在优选的实施方式中，所述二维纳米材料包括但不限于：以石墨烯和h-BN为代表的六元环蜂窝状的二维纳米单原子层晶体的纳米材料；以过渡金属硫属化合物 (MoS2、WS2)和金属卤化物(PbI、MoCl)为代表的三原子层晶体的纳米材料，例如二维过渡态金属硫氧化物纳米材料，优选二维硫化钼材料；金属氧化物(MnO2、 WoO3)以及双金属氢氧化物(Mg6Al2(OH)16)的纳米材料。
在第四方面，本发明提供一种生物抗菌材料，所述生物抗菌材料包含第二方面所述的糖基化合物并携带荧光基团或抗生素药物。
在优选的实施方式中，所述生物抗菌材料是生物医用材料；优选复合材料。
在优选的实施方式中，所述复合材料是纳米材料，包括但不限于：纳米金、纳米银、纳米锌、纳米铜等金属离子的纳米材料；或二维纳米材料。
在优选的实施方式中，所述二维纳米材料包括但不限于：以石墨烯和h-BN为代表的六元环蜂窝状的二维纳米单原子层晶体的纳米材料；以过渡金属硫属化合物 (MoS2、WS2)和金属卤化物(PbI、MoCl)为代表的三原子层晶体的纳米材料，例如二维过渡态金属硫氧化物纳米材料，优选二维硫化钼材料；金属氧化物(MnO2、 WoO3)以及双金属氢氧化物(Mg6Al2(OH)16)的纳米材料。
在第五方面，本发明提供第二方面所述的糖基化合物的制备方法，包括利用第一方面所述的糖基叠氮配体化合物与下式所示环辛炔配体合成所述的糖基化合物：
在优选的实施方式中，所述制备方法无需使用铜催化剂，通过点击化学方法实施。
在第六方面，本发明提供第一方面所述的糖基叠氮配体化合物或第二方面所述的糖基化合物在制备检测细菌或治疗细菌感染的生物抗菌材料中的用途。
在优选的实施方式中，所述细菌是耐药菌。
在优选的实施方式中，所述耐药菌是易形成生物被膜的耐药菌；包括但不限绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌；优选绿脓杆菌。
在优选的实施方式中，所述生物抗菌材料是生物医用材料；优选复合材料。
在优选的实施方式中，所述复合材料是纳米材料，包括但不限于：纳米金、纳米银、纳米锌、纳米铜等金属离子的纳米材料；或二维纳米材料。
在优选的实施方式中，所述二维纳米材料包括但不限于：以石墨烯和h-BN为代表的六元环蜂窝状的二维纳米单原子层晶体的纳米材料；以过渡金属硫属化合物 (MoS2、WS2)和金属卤化物(PbI、MoCl)为代表的三原子层晶体的纳米材料，例如二维过渡态金属硫氧化物纳米材料，优选二维硫化钼材料；金属氧化物(MnO2、 WoO3)以及双金属氢氧化物(Mg6Al2(OH)16)的纳米材料。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例) 中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
具体实施方式
发明人经过广泛而深入的研究，出乎意料地获得一种新型的糖基化合物以及包含这种糖基化合物的生物抗菌材料。这些糖基化合物能够特异性靶向绿脓杆菌表面，同时生物抗菌材料的光学性能促进其生物被膜的降解，从而针对体外及活体表皮伤口组织感染的绿脓杆菌，实现靶向标记及在光驱动条件下的热驱动释药与自由基杀菌的协同抑菌效果，进一步将生物抗菌材料应用于骨修复材料上，实现骨修复材料具备体内抗菌效果，最终抑制绿脓杆菌的体内外感染。显著提高抗生素的抗菌效率，为抵御体外、活体表皮伤口乃至体内骨修复材料上感染的绿脓杆菌提供一种新型有效的“诊疗一体化”工具。在此基础上完成了本发明。
耐药菌
本文所用的术语“耐药菌”与本领域技术人员常规理解的意义相同或相似，是指通过各种形式获得抵御抗菌药物的能力的细菌。
细菌可以通过各种方式获得耐药能力。除了长期抗生素使用引发的耐药基因突变以外，大多数细菌是由于其菌体表面形成了顽固的生物被膜。易形成生物被膜的耐药菌是目前临床需要解决的棘手问题。例如，绿脓杆菌凭借其易形成生物被膜顽固地抵御外界的攻击，已是临床患者伤口及呼吸道感染的常见耐药菌之一，尤其针对体外皮肤组织及骨组织损伤的患者感染严重，治疗中抗生素经常成为必选的药物。然而研究发现抗生素过量使用会带来细菌耐药性、变异性等临床问题。
本领域已经知晓多种易形成生物被膜的耐药菌，包括但不限于：绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌；优选绿脓杆菌。
本发明的糖基叠氮配体化合物和糖基化合物
本发明提供一种糖基叠氮配体化合物，所述糖基叠氮配体化合物包含糖基与特定的叠氮配体，并且能够特异性结合易形成生物被膜的耐药菌，例如绿脓杆菌表面分泌的LecA和LecB蛋白。
在具体的实施方式中，本发明的糖基叠氮配体化合物如式I所示：
R-L1-O-L2-N3 I；
式中，R为糖基。
基于本发明的教导，本领域技术人员知晓本发明的糖基叠氮配体化合物中的糖基可以是单糖基、双糖基、多糖基。具体地说，单糖是指分子结构中含有3～6个碳原子的糖，如三碳糖的甘油醛；四碳糖的赤藓糖、苏力糖；五碳糖的阿拉伯糖、核糖、木糖、来苏糖；六碳糖的葡萄糖、甘露糖、果糖、半乳糖。二糖又名双糖，由二分子的单糖通过糖苷键形成，包括但不限于麦芽糖、乳糖、蔗糖、海藻糖。多糖是由多个单糖分子缩合、失水而成，是一类分子结构复杂且庞大的糖类物质，包括但不限于纤维素、糖原、淀粉。
在式I中，L1和L2各自为接头。基于本发明的教导，本领域技术人员可以知晓可以用于本发明的糖基叠氮配体化合物的各种接头。在具体的实施方式中，所述接头，即，L1和L2各自可以独立为取代或未取代的亚烷基；例如，1-6个碳原子的亚烷基接头；优选取代或未取代的1-3个碳原子的亚烷基接头；更优选取代或未取代的2个碳原子的亚烷基接头。在具体的实施方式中，L1和L2上的取代基包括但不限于卤素、C1-C3烷基、卤代C1-C3烷基、C1-C3烷氧基、卤代C1-C3烷氧基、硝基、氰基、羟基；其中取代基的数目只要符合相关碳原子的化合价要求即可。
在优选的实施方式中，L1和L2所示接头为亚乙基；在这种的情况下，本发明的糖基叠氮配体化合物如式I’所示
为与二维硫化钼材料等生物抗菌材料形成复合纳米材料，本发明人进一步利用本发明的糖基叠氮配体化合物与下式所示环辛炔配体合成不同糖型的糖基化合物
采用本发明的糖基叠氮配体化合物与环辛炔配体可以无需利用铜催化剂，从而通过非铜点击化学手段合成不同糖型的糖基化合物。这种合成方法成本低，环境友好，从而能够实现绿色合成、操作简便。
因此，本发明还提供式IIa或式IIb所示的糖基化合物：
式中，R、L1和L2各自如上所述。
在L1和L2所示接头为亚乙基的情况下，本发明的糖基化合如下式IIa’或式IIb’所示：
在具体的实施方式中，本发明的糖基化合物为以下化合物：
优选
或者，以下化合物：
优选
生物抗菌材料
本文所用的术语“生物抗菌材料”与本领域技术人员常规理解的意义相同或相似，是指具有杀灭或抑制微生物功能的一类新型功能材料。例如，通过添加一定的抗菌物质((称为抗菌剂)，从而使材料具有抑制或杀灭表面细菌能力的一类新型功能材料，如抗菌塑料、抗菌纤维和织物、抗菌陶瓷、抗菌金属材料等。
本文所用的术语“生物医用材料”与本领域技术人员常规理解的意义相同或相似，是指用来对生物体进行诊断、治疗、修复或替换其病损组织、器官或增进其功能的材料。
为克服细菌耐药性、降解其生物被膜及减少抗生素使用等医学面临的棘手问题，研究中科研人员不断挖掘出纳米银、纳米金等纳米抗菌材料。随后，发现含有金属离子的一些材料及高分子化合物也具有很好的抗菌作用。直至现在，各种纳米材料与分子化合物的复合物及抗菌化合物的衍生物也不断地被挖掘，成为有效的抗菌工具。随着材料科学的不断发展，目前，二维纳米材料借助自身特殊的材料形貌及优异的光学性能，被广泛地应用于不同科研领域，相关文献报道氧化石墨烯和还原石墨烯具有较好的抗菌能力。近期二维过渡态金属硫氧化物，如二维硫化钼及其衍生物的生物医学应用也逐渐被化学生物学家发掘，体外与体内实验均证明这些材料具备比氧化石墨烯更好的生物相容性，可在体内被降解并代谢，大大降低了材料本身所带来的环境与健康危害。此外，这些材料还具备与石墨烯类似乃至更为优异的光学性能，可在白光和近红外光辐射下分别产生自由基和释放热量，达到疾病的光动力学和光热治疗效果。2013年，Nathalie等人借助化学修饰的方法合成一些不同结构的基于岩藻糖基的糖簇类化合物。通过实验筛选出与绿脓杆菌具有很强结合力的岩藻糖基化合物结构，抗菌实验发现，此类化合物具有很好的抗菌活性。同时，研究发现绿脓杆菌表面分泌的蛋白LecA和LecB能够分别与半乳糖和岩藻糖发生识别结合，且已有研究证明蛋白LecA和LecB能够促进绿脓杆菌形成生物被膜，于是该发现也为绿脓杆菌的抗菌化合物结构设计及其生物被膜的降解提供了有益的帮助。
然而，通过借助二维纳米材料光学性能降解生物被膜同时靶向菌体释药的相关文献尚未见报道。基于二维硫化钼材料比石墨烯类材料具有更优异的光学性能，本发明提出通过二维硫化钼材料和糖基靶向化合物自组装构建成复合纳米材料，利用物理包裹的方法携带荧光基团或抗生素，进行荧光标记或靶向细菌释药。借助二维硫化钼材料在不同光照条件下能够释放热及自由基性能，进一步协同抗生素达到更彻底的抑菌效果，且绿脓杆菌的诊疗范围从体外游离态扩展至活体表皮感染组织且延伸至体内骨修复材料。
基于二维硫化钼材料不仅具备良好的生物相容性，且拥有优异的光学性能，可在白光和近红外光辐射下分别产生自由基和释放热量，实现光驱动治疗疾病。研究发现绿脓杆菌表面分泌的蛋白LecA和LecB能够分别与半乳糖和岩藻糖发生识别结合。于是构建携带荧光探针或抗生素药物的复合纳米材料，靶向标记细菌及靶向细菌释药。借助二维硫化钼材料在光驱动条件下能够释放热及自由基性能，进一步协同抗生素达到更彻底的抑菌效果，为体外、活体表皮组织伤口及骨修复材料上感染的绿脓杆菌提供诊疗一体化的新型工具。
在具体的实施方式中，本发明的生物抗菌材料可以广泛应用于各领域，包括但不限于医疗领域、家庭用品、家用电器、食品包装等领域。
例如，本发明的生物抗菌材料可以是生物医用材料，优选复合材料。所述复合材料是将不同性质的材料组分优化组合而成的新材料。本发明的复合材料可以是任何复合材料，只要所述复合材料能够用本发明的糖基化合物进行表面修饰即可。例如，所述复合材料是纳米材料，包括但不限于：纳米金、纳米银、纳米锌、纳米铜等金属离子的纳米材料；或二维纳米材料。本发明的二维纳米材料包括但不限于：以石墨烯和h-BN为代表的六元环蜂窝状的二维纳米单原子层晶体的纳米材料；以过渡金属硫属化合物(MoS2、WS2)和金属卤化物(PbI、MoCl)为代表的三原子层晶体的纳米材料，例如二维过渡态金属硫氧化物纳米材料，优选二维硫化钼材料；金属氧化物(MnO2、WoO3)以及双金属氢氧化物(Mg6Al2(OH)16)的纳米材料。
本发明的优点：
1.本发明的糖基叠氮配体化合物与环辛炔配体合成不同糖型的糖基化合物中无需利用铜催化剂，从而能够实现绿色合成、操作简便；
2.本发明的糖基化合物能够特异性识别绿脓杆菌；
3.由于特定环辛炔配体的使用，包含本发明的糖基化合物的生物抗菌材料的载药量得到显著提高；
4.本发明的生物抗菌材料能够达到更彻底的抑菌效果，并且将绿脓杆菌的诊疗范围从体外游离态扩展至活体表皮感染组织且延伸至体内骨修复材料；和
5.基于复合纳米材料的抗菌应用，本发明减少了抗生素的使用量，从而降低细菌的耐药性；同时借助二维纳米材料的优异光学性能，降解细菌形成的生物被膜，且能够治愈皮肤感染模型。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
实施例
材料与方法：
所有购买的化学品和试剂均为分析级。四氯金酸(III)水合物(HAuCl4·XH2O，99.9％-Au)购自J&K Chemical。柠檬酸钠获自J&K Chemical。利用Bruker AM 400MHz光谱仪，以四甲基硅烷(TMS)作为内标记录1H NMR和13C NMR光谱。利用 Varian Cary 500UV-Vis分光光度计测量吸收光谱。利用Waters Micromass LCT质谱仪记录高分辨率质谱(HRMS)。利用JEOL 100CX透射电子显微镜，以100kV的加速偏压操作获得透射电子显微镜(TEM)图像。利用Shimadzu Prominence系列设备测量高效液相色谱(HPLC)。
2D薄层MoS2的制备.在EtOH和水的混合水溶液中通过超声辅助剥离大量 MoS2晶体获得层状MoS2。将MoS2(100mg)加入装有20mL EtOH/水(1：1，v/v)的 25mL小瓶中。将密封的小瓶超声处理8小时，然后将分散体在3200rpm下离心10分钟以除去聚集物。收集上清液并在60℃下在干燥箱中干燥后，得到军绿色粉末。将获得的粉末溶解在Milli-Q超纯水中并超声处理0.5小时以提供均匀的储备溶液。
糖基片层的超分子自组装.向2D MoS2(10mL，1mg mL-1)或AuNP(10mL，700nM)的水溶液中加入化合物d、e或f(500μM，100μL)。将所得混合物超声处理10 分钟，然后在室温下避光搅拌12小时，然后以10000rpm离心20分钟以除去残留的化合物d、e或f分子。该步骤重复三次。通过相同的方案制备抗生素-纳米复合物药物递送系统。
溶液中活性氧(ROS)的测定.购自Adamas的二氢罗丹明-123(DHR123)用于检测ROS。ROS对DHR123的氧化导致形成荧光罗丹明123。典型的测定中，2D MoS2(1mg mL-1)或糖片层(2D MoS2/Fuc/Ceft＝1mg mL-1/500uM/32μg/mL-1)加入到 DHR123(4μM)的Tris-HCl缓冲溶液(0.01M，pH7.4)中。然后，将混合物在白光(40mW cm-2)下照射0-60分钟，并用485nm的激发记录发射强度。
拉曼光谱.使用Renishaw InVia Reflex Raman系统(Renishaw plc， Wotton-under-Edge，UK)获得拉曼光谱，该系统使用光栅光谱仪，具有耦合到共聚焦显微镜的Peltier冷却电荷耦合器件(CCD)检测器，然后用Renishaw WiRE 3.2软件进行处理。拉曼散射由氩离子激光激发。
细菌菌株和抗菌剂.绿脓杆菌(P.Aeruginosa)菌株ATCC 27853和肺炎克雷伯菌(Klebsiellar pneumonia)菌株ATCC13883从美国典型培养物保藏中心获得。抗生素和抗生素-纳米复合物作为抗微生物剂。
用于光动力学处理的MIC和细菌活力测定.根据临床和实验室标准协会(CLSI) 标准测量最小抑菌浓度(MIC)。为了在有和没有光动力学处理存在的情况下验证单独的抗生素和抗生素-纳米复合材料的效果，在35±2℃的Mueller-Hinton肉汤中培养细菌。防止孵育20-24小时后浑浊出现的最低药物浓度定义为MIC。实验一式三份进行以确保重现性。
细菌光动力疗法.在PDT之前，将细菌以106细胞/mL的密度接种在96孔板中。首先将细菌与抗生素-纳米复合物一起温育15分钟，然后用通过600nm、808nm或白光滤光片过滤的卤素灯宽带光源照射1小时。照射后，将细菌用完全培养基进一步培养16-20小时，通过OD值测定细胞活力。
时间杀伤动力学测定.根据NCCLS方法使用协同测试进行时间杀伤测定。所有时间杀伤实验一式三份进行，初始接种物为约106CFU mL-1。使用32μg mL-1Ceft， Ceft-纳米复合物(MoS2/Fuc/Ceft＝1mg mL-1/500uM/32μg mL-1)。在0、1、2、4、6 小时从培养物中取出等分试样(0.1mL)，并在冷的0.9％氯化钠中连续稀释。通过绘制平均菌落计数(log10CFU mL-1)与时间的关系图来构建时间-杀伤曲线。
LecA/LecB基因表达的定量实时PCR分析.通过RT-PCR检测LecA/LecB基因的表达。在相同条件下培养绿脓杆菌菌株ATCC 27853和肺炎克雷伯菌菌株ATCC 13883。然后收获5×109个细胞用于RNA分离。使用RNeasy Mini Kit(Qiagen， California，USA)的700uL RLT缓冲液重悬细菌沉淀，并将得到的细菌悬浮液转移至裂解基质中，并在Fastprep匀浆器(Mini Beadbeater，USA)中匀浆。然后根据RNeasy Mini Kit的制造商说明书提取总RNA。使用两步rtPCR进行RT-PCR。首先通过Reverse transcription Kit(Qiangen，USA)将RNA逆转录成cDNA；使用 SuperReal Premix Plus(Sybr Green)试剂盒(Tiangen，China)在ABI 7500实时 PCR(Applied Biosystems，California，USA)上进行rtPCR，在95℃下变性15秒、55℃下退火30秒、然后在72℃下延伸32秒，进行40个循环。LecA基因的PCR引物是：
F:GTTACGGACCTACCCAGAAATG；
和R:GTTCCGCTGTTGCCAATCTT；
LecB基因的PCR引物是：
F:CGGGCAAAGCACCAATAACG；
和R:TGACGCTGACCTGGACCTGTA；
16S rRNA的引物为：
F:GTTATTAGGGAAGAACATATGTG；
和R:CCACCTTCCTCCGGTTTGTCACC。
在扩增后立即进行解链曲线分析以验证PCR扩增产物的特异性。在每个循环的退火-延伸阶段结束时测量荧光。手动设定所有样品的荧光阈值。将PCR产物超过该荧光阈值的反应循环确定为阈值循环(CT)。通过2-ΔΔCt方法计算相对定量。
荧光标记-共聚焦激光扫描显微镜(CLSM).将细菌细胞接种在营养肉汤培养基中并培养，37℃振荡5小时，并以106细胞/mL的密度悬浮于营养肉汤培养基中备用。然后，在37℃下将DCM-纳米复合物(MoS2/Fuc/DCM＝1mg mL-1/500uM/2μM) 与细菌在营养肉汤培养基中孵育12小时。温育后，将细胞以8000rpm离心5分钟，除去上清液。用PBS洗涤细菌三次，悬浮在纯水中，置于(200μL)显微镜载玻片上，并在室温下干燥。使用配备有100x油浸物镜的Nikon AIR共聚焦激光扫描显微镜获得CLSM图像。在460nm下进行激发，并在600-640nm下测量发射。
抑制生物膜的形成.
过程：
(1)预培养和生物膜生长的准备。
(2)在有和没有生物膜的光动力学处理存在的情况下的抗生素和抗生素-纳米复合材料.为向孔板中加入抗生素或抗生素-纳米复合物稀释液，将培养板从培养箱中取出并转移到生物安全柜中。取下覆盖箔并向所有孔板中加入20μl抗生素或抗生素-纳米复合物溶液(预先制备不同的抗生素和/或浓度)。然后，除对照组仅含有抗生素或抗生素-纳米复合物的细菌外，将孔板分成两组。第一组用808nm(40mW cm-2)激光连续照射1小时，第二组用808nm(40mW cm-2)激光连续照射1小时，然后用白光(40mW cm-2)连续照射1小时。照射后，将孔板在37℃下进一步培养24小时。
(3)生物膜的染色.在加入抗生素溶液后直接向每个孔中加入20μl染色溶液，以在孔板中获得1.4μM的Syto9和8.3μM的PI的终浓度。用新鲜的透气性箔覆盖微量滴定板并将孔板返回培养箱。继续在37℃下孵育12小时然后成像。
(4)显微镜检测.
(5)数据分析.使用Image-j计算来自分析堆栈的蓝色(活细菌)和黄色/共定位(死细菌)生物体积的不同比例。
实施例1.二维硫化钼材料制备
如“材料和方法”所述，根据现有文献中报道的方法(Angew.Chem.Int.Ed. 2011,50,10839)，以天然硫化钼粉末为原材料，通过控制超声温度、时间、功率等操作手段，最后经过离心、冷冻制备出尺寸均一的二硫化钼材料。
实施例2.糖基化合物的合成
本发明的糖基化合物的总体合成过程为：首先通过糖基化反应合成半乳糖、岩藻糖、麦芽糖等三种叠氮糖配体；同时，通过酰胺化反应合成带有二硫键的环辛炔配体；最后，将上述合成得到的叠氮糖配体与环辛炔配体通过非铜点击化学手段，最终合成三种不同糖型的糖基化合物。
具体的合成情况如下所述：
方案S1.
3的合成：向1(55mg，0.19mmol)(Bioconjugate Chem.2012,23,1680-1686)在CH2Cl2为溶剂的溶液中加入EDCl(69.2mg，0.23mmol)和HOBt(31.1mg，0.23mmol)，然后加入2(60.0毫克，0.29毫摩尔)。将混合物在氮气下搅拌12小时。将所得混合物用CH2Cl2稀释并用盐水洗涤。将合并的有机层用MgSO4干燥，过滤，并真空浓缩得到粗产物，随后经柱层析纯化得到3(74.3mg，81.8％)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ 7.69(d,J＝7.4Hz,1H),7.39(dd,J＝12.4,7.1Hz,4H),7.32(t,J＝6.7Hz,2H),7.28(s, 1H),5.15(d,J＝13.8Hz,1H),3.68(d,J＝13.8Hz,1H),3.60–3.52(m,1H),3.21–3.08 (m,2H),3.01–2.91(m,2H),2.49–2.41(m,1H),2.37–2.33(m,1H),1.94–1.87(m,4H), 1.67–1.61(m,4H),1.57–1.49(m,2H),1.42–1.35(m,2H).13C NMR(101MHz,CDCl3) δ178.7,178.1,143.2,142.4,142.1,138.1,135.7,135.5,135.4,134.6,134.3,133.9, 133.8,133.6,65.1,60.7,57.4,41.0,36.9,34.7,34.6,34.5,34.4,34.3(2),30.2,27.7. HRMS(ESI,m/z):[M+H]+calcd for C27H31N2O2S2479.1827,found 479.1829.
方案S2
合成S2.条件和试剂：(I)BF3·Et2O，干燥CH2Cl2配制，(II)MeOH/NH3·H2O(4/1, v/v).
合成a：向a1(500mg，1.28mmol)的无水CH2Cl2(20mL)为溶剂的溶液中加入 4(167mg，1.28mmol)(Tetrahedron 70(2014)7780-7787)，然后加入BF3·Et2O(1.2mL，0.64mmol)。在氮气下搅拌混合物5小时，然后用CH2Cl2稀释并用盐水洗涤。将合并的有机层用MgSO4干燥，过滤，真空浓缩，得到粗产物，然后经柱层析纯化得到中间体。然后将中间体(452mg，0.98mmol)溶解在CH3OH(20mL)中，随后加入 NH3·H2O(1.3mL，5.8mmol)。将混合物在室温下搅拌过夜，然后真空浓缩得到粗产物，然后经柱层析纯化得到a(261mg，91％，收率)：从a1(500mg，1.28mmol)和4 (167mg，1.28mmol)开始，通过柱层析(二氯甲烷(DCM)/MeOH＝17:1，v/v)得到 a(261mg，70％，2步产率)，为白色固体。Rf＝0.31(DCM/MeOH＝10:1,v/v).1H NMR (400MHz,DMSO-d6)δ4.45(d,J＝11.1Hz,1H),3.87(s,2H),3.79–3.67(m,3H),3.63–3.57(m,2H),3.49(d,J＝5.5Hz,3H),3.17(q,J＝7.1Hz,2H),1.28(t,J＝7.2Hz, 2H)；13C NMR(101MHz,MeOD)δ102.9,75.9,73.9,73.6,73.5,72.4,70.6,69.8,54.1, 18.9.HRMS[M+H]+calcd for C10H20N3O7 +294.1296,found 294.1235.
合成b：向b1(400mg，1.2mmol)的干燥CH2Cl2(20mL)为溶剂的溶液中加入4 (157mg，1.2mmol)(Tetrahedron 70(2014)7780-7787)，然后加入BF3·Et2O(1.1mL，0.6mmol)。在氮气下搅拌混合物5小时，然后用CH2Cl2稀释并用盐水洗涤。将合并的有机层用MgSO4干燥，过滤，真空浓缩，得到粗产物，然后经柱层析纯化得到中间体。随后将中间体(401mg，0.99mmol)溶解在CH3OH(20mL)中，然后加入NH3·H2O (1.4mL，5.9mmol)。将混合物在室温下搅拌过夜，然后真空浓缩得到粗产物，然后经柱层析纯化得到b(247mg，90％，收率)：从b1(400mg，1.2mmol)和4(157mg， 1.2mmol)开始，通过柱层析(二氯甲烷(DCM)/MeOH＝20:1，v/v)得到b(247mg， 75％，2步产率)，为白色固体。Rf＝0.32(DCM/MeOH＝10:1,v/v).1H NMR(400MHz, MeOD)δ4.69(d,J＝3.5Hz,1H),3.94(q,J＝6.6Hz,1H),3.72(dd,J＝9.7,4.6Hz,1H),3.67–3.63(m,1H),3.62–3.57(m,3H),3.56–3.53(m,1H),3.50(d,J＝7.3Hz,1H),3.30–3.27(m,2H),1.20(d,J＝7.7Hz,2H),1.11(d,J＝6.6Hz,3H)；13C NMR(101 MHz,MeOD)δ94.8,81.2,77.2,74.3,72.4,64.7,49.9,26.1,11.5.HRMS(ESI,m/z): [M+Na]+calcd forC10H19N3O6Na+300.1172,found 300.1154.
合成c：向c1(500mg，0.74mmol)的干燥CH2Cl2(20mL)为溶剂的溶液中加入 4(96.6mg，0.74mmol)(Tetrahedron 70(2014)7780-7787)，然后加入BF3·Et2O (0.67mL，0.37mmol)。在氮气下搅拌混合物5小时，然后用CH2Cl2稀释并用盐水洗涤。将合并的有机层用MgSO4干燥，过滤，真空浓缩，得到粗产物，然后通过柱层析纯化得到中间体。然后将中间体(381mg，0.51mmol)溶解在CH3OH(20mL)中，然后加入NH3·H2O(0.68mL，3.1mmol)。将混合物在室温下搅拌过夜，然后真空浓缩得到粗产物，然后经柱层析纯化得到d(211mg，91％，收率)：从c1(500mg，0.74mmol) 和4(96.6mg，0.74mmol)开始，通过柱层析(二氯甲烷(DCM)/MeOH＝15:1，v/v) 得到c(211mg，62％，2步产率)，为白色固体。Rf＝0.3(DCM/MeOH＝10:1,v/v).1H NMR(400MHz,MeOD)δ4.85(d,J＝9.5Hz,2H),3.96–3.90(m,2H),3.89–3.87(m,2H),3.85(d,J＝2.2Hz,1H),3.78(d,J＝2.3Hz,1H),3.75(dd,J＝7.6,4.1Hz,3H), 3.67(d,J＝2.5Hz,1H),3.66–3.63(m,2H),3.62–3.58(m,2H),3.44(t,J＝4.9Hz,3H), 3.21(q,J＝7.3Hz,1H),1.32(t,J＝7.2Hz,2H)；13C NMR(101MHz,MeOD)δ156.9, 136.0,100.4,92.8,92.1,89.8,84.9,82.7,82.5,76.1,73.6,44.1,42.1,38.3,35.1,26.9. HRMS(ESI,m/z):[M+Na]+calcd for C16H29N3O12Na+478.1649,found 478.1650.
方案S3
无铜点击反应的通用程序.叠氮基糖苷和炔基脂质在MeCN/MeOH(1:1，V/ V)的溶剂混合物中制成溶液。将混合物在40℃下搅拌12小时。将所得混合物用CH2Cl2稀释并用盐水洗涤。将合并的有机层用MgSO4干燥，过滤，并真空浓缩得到粗产物，将其经柱层析纯化。
合成d：从a(200mg，0.68mmol)和3(325mg，0.68mmol)开始，通过柱层析(二氯甲烷(DCM)/MeOH＝15:1，v/v)得到d，为白色固体(495mg，94％)。TLC：Rf＝ 0.38(二氯甲烷(DCM)/MeOH＝10:1，v/v)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ 7.72–7.62(m,1H),7.60–7.26(m,7H),5.94–5.84(m,1H),4.69–4.59(m,4H), 4.50–4.43(m,4H),4.15(t,J＝12.1Hz,1H),3.82(d,J＝4.4Hz,1H),3.68(d,J＝2.5 Hz,1H),3.62–3.54(m,4H),3.52–3.47(m,3H),3.21–3.09(m,4H),2.81(dd,J＝12.2, 6.2Hz,1H),2.71(dd,J＝13.4,7.1Hz,1H),2.45–2.37(m,1H),1.99(t,J＝6.8Hz,2H), 1.86(dd,J＝12.9,6.6Hz,1H),1.80(s,1H),1.65(dd,J＝12.4,6.6Hz,1H),1.56–1.49 (m,1H),1.48–1.37(m,3H),1.36–1.27(m,3H),1.23(s,2H)；13C NMR(101MHz, DMSO-d6)δ172.3,172.2,171.4,171.0,144.0,142.8,142.7,141.8,140.7,136.1,134.5, 132.8,132.4,132.1,132.0,131.9,130.4,129.9,129.7,129.6,129.3,129.0,128.7,128.6, 127.9,127.3,127.2,100.6,100.5,100.4(2),74.4,74.4,71.4,70.7,67.3,66.2,66.1,61.7, 56.6,56.5,52.2,48.9,38.5,38.1,35.6,34.5,31.7,31.6,30.9,30.8,30.2,29.4,28.8,25.5, 25.4,24.8,22.5,19.0,14.4.HRMS(ESI,m/z):[M+Na]+calcd for C37H49N5O9S2Na+ 794.2869,found 794.2869.
合成e：从b(200mg，0.72mmol)和3(344mg，0.72mmol)开始，通过柱层析(二氯甲烷(DCM)/MeOH＝15:1，v/v)得到e，为白色固体(270mg，92％)。TLC：Rf＝ 0.41(二氯甲烷(DCM)/MeOH＝10:1，v/v)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.73–7.71(m,1H),7.63–7.28(m,7H),5.96–5.89(m,1H),4.67–4.59(m,2H), 4.54–4.48(dd,J＝12.9,4.4Hz,2H),4.43–4.39(m,2H),4.17–4.11(m,1H),3.89–3.81 (m,1H),3.75–3.58(m,4H),3.55–3.51(m,3H),3.41(s,1H),3.26–3.21(m,1H), 3.19–3.14(m,1H),2.87–2.82(m,1H),2.75–2.71(m,1H),2.48–2.42(m,1H),1.97(dd, J＝13.4,7.7Hz,2H),1.94–1.87(m,1H),1.83(s,1H),1.70–1.66(m,2H),1.61–1.55(m, 1H),1.51–1.48(m,2H),1.36(dd,J＝13.1,8.1Hz,2H),1.36–1.28(m,4H),1.13–0.97 (m,3H)；13C NMR(101MHz,DMSO-d6)δ172.1,172.1,171.3,170.9,143.9(2),142.6, 141.7,140.6,136.1,136.0,134.3,132.7,132.3,131.5,131.5,130.1,129.6,129.5,129.3, 128.9,128.7,127.7,127.1,125.1,124.9,100.1,99.9,99.8,99.7,71.9,71.8,70.3,70.1, 69.9,69.3,69.2,69.1,68.3,67.3,67.2,67.1,66.2,56.5,55.3,52.2,51.2,50.5,48.8,48.3, 38.4,38.0,35.5,34.4,30.9,30.7,29.4,29.2,28.6,25.4,25.2,24.7,16.8,16.7.HRMS (ESI,m/z):[M+Na]+calcd for C37H49N5O8S2Na+778.2920,found778.2921.
合成f：从c(200mg，0.44mmol)和3(210mg，0.44mmol)开始，通过柱层析(二氯甲烷(DCM)/MeOH＝15:1，v/v)得到f，为白色固体(388mg，94％)。TLC：Rf＝ 0.43(二氯甲烷(DCM)/MeOH＝10:1，v/v)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6) δ7.70–7.25(m,8H),5.92–5.84(m,1H),5.12–5.00(m,1H),4.90–4.67(m,3H), 4.63–4.58(m,4H),4.51–4.44(m,5H),4.22–4.18(m,2H),3.81–3.68(m,3H), 3.62–3.53(m,7H),3.31–3.26(m,4H),3.18–3.16(m,3H),2.98–2.93(m,1H), 2.83–2.66(m,2H),2.44–2.37(m,1H),1.98(dd,J＝13.6,6.7Hz,2H),1.86–1.83(m, 1H),1.67–1.61(m,1H),1.55–1.27(m,7H),1.23(s,2H)；13C NMR(101MHz, DMSO-d6)δ171.7,170.9,140.2,135.6,131.5,130.5,129.9,129.5,129.1,128.5,128.5, 128.0,127.4,124.5,103.7,99.1,96.5,91.9,81.2,80.9,75.4,74.9,74.8,74.7,74.5,73.2,72.1,71.4,70.9,70.5,69.6,17.8,69.5,68.6,68.3,68.0,66.5,60.4,60.2,60.1,56.1,50.8, 50.0,48.6,38.1,37.6,35.2,34.1,30.4,29.4,28.3,28.3,26.5,25.0,24.3,22.1,13.9. HRMS(ESI,m/z):[M+Na]+calcd for C43H59N5O14S2Na+956.3398,found 956.3372.
实施例3.携带荧光基团或抗生素药物的复合纳米材料的自组装
如“材料和方法”中所述，基于糖基化合物上修饰的二硫键基团与二维硫化钼材料的表面能够配位结合，将糖基化合物与二维纳米材料在溶液中进行超声组装，随后通过离心分离得到表面修饰糖基化合物的复合纳米材料。然后进一步借助物理包裹的方法，将荧光基团或抗生素组装到糖基复合纳米材料中，并通过离心、紫外检测等手段定量出包裹荧光基团或抗生素的浓度，最终组装形成携带荧光基团或抗生素药物的复合纳米材料。
实施例4.携带荧光基团或抗生素药物的复合纳米材料的活性检测
如“材料和方法”中所述，检测携带荧光基团或抗生素药物的复合纳米材料靶向标记及光驱动治疗活体表皮组织及骨修复材料上感染的绿脓杆菌：
首先，针对体外游离态的绿脓杆菌，进行特异性细菌的荧光靶向标记，进而在不同光照条件下(近红外光照(808nm)及白光照射(400-700nm))，进行抗菌活性 (MIC)的测定，设立光照组和非光照组作为对比。探究复合纳米材料在不同光照条件下的释热性能、释放自由基性能及两性能叠加的抗菌效果。确定最佳具备抗菌效果的复合纳米材料组份配比及光照实验条件，最后，将上述具备良好抗菌性能的复合纳米材料应用于治疗活体表皮伤口组织感染的绿脓杆菌，通过间断时间提取感染伤口组织样本，检测其绿脓杆菌存活率、观察感染伤口组织愈合情况及组织切片染色，来说明该功能化复合纳米材料的抑菌效果。进一步在相同实验条件下，将其应用于治疗骨修复材料上感染的绿脓杆菌，同样通过检测绿脓杆菌的存活率及骨组织成长情况来说明其抑菌效果。
结果可以发现，携带荧光基团的本发明复合纳米材料能够特异性识别绿脓杆菌，携带抗生素药物的本发明复合纳米材料可以彻底杀伤绿脓杆菌，有效抑制生物被膜的形成。
此外，不想受限于特定的机理，但本发明人相信由于特定环辛炔配体的使用，本发明的糖基叠氮配体化合物与环辛炔配体合成不同糖型的糖基化合物无需利用铜催化剂，并且本发明的复合纳米材料的载药量显著提高。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (12)

1.一种式I所示糖基叠氮配体化合物：
R-L1-O-L2-N3I
式中，R为糖基；
L1和L2各自独立为取代或未取代的1-6个碳原子的亚烷基接头；优选取代或未取代的1-3个碳原子的亚烷基接头；更优选取代或未取代的2个碳原子的亚烷基接头。
2.如权利要求1所述的糖基叠氮配体化合物，其特征在于，所述化合物如下式I’所示：
式中，R如权利要求1所限定。
3.如权利要求1或2所述的糖基叠氮配体化合物，其特征在于，所述糖基可以是单糖基、双糖基、多糖基。
4.如权利要求3所述的糖基叠氮配体化合物，其特征在于，式I’所示糖基叠氮配体化合物为以下化合物：
优选
5.一种式IIa或式IIb所示的糖基化合物：
式中，R为糖基；
L1和L2各自独立为取代或未取代的1-6个碳原子的亚烷基接头；优选取代或未取代的1-3个碳原子的亚烷基接头；更优选取代或未取代的2个碳原子的亚烷基接头。
6.如权利要求5所述的糖基化合物，其特征在于，所述化合物如下式IIa’或式IIb’所示：
式中，R如权利要求5所限定。
7.如权利要求5或6所述的糖基化合物，其特征在于，所述糖基可以是单糖基、双糖基、多糖基。
8.如权利要求7所述的化合物，其特征在于，式IIa’所示糖基化合物为以下化合物：
优选
式IIb’所示糖基化合物为以下化合物：
优选
9.一种生物抗菌材料，所述生物抗菌材料包含权利要求5-8中任一项所述的糖基化合物。
10.一种生物抗菌材料，所述生物抗菌材料包含权利要求5-8中任一项所述的糖基化合物并携带荧光基团或抗生素药物。
11.权利要求5-8中任一项所述的糖基化合物的制备方法，包括利用权利要求1-4中任一项所述的糖基叠氮配体化合物与下式所示环辛炔配体合成所述的糖基化合物：
12.权利要求1-4中任一项所述的糖基叠氮配体化合物或权利要求5-8中任一项所述的糖基化合物在制备检测细菌或治疗细菌感染的生物抗菌材料中的用途。
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