CN109350614A - 一种荜茇酰胺生物碱的降糖用途 - Google Patents

一种荜茇酰胺生物碱的降糖用途 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种荜茇酰胺生物碱的降糖用途，所述荜茇酰胺生物碱为假荜茇酰胺A、假荜茇酰胺B、假荜茇酰胺C和几内亚胡椒酰胺，并对其进行了体外蛋白酪氨酸磷酸酶1B（PTP1B）的活性测定，结果表明：所述荜茇酰胺生物碱中的假荜茇酰胺A、假荜茇酰胺B、假荜茇酰胺C和几内亚胡椒酰胺能不同程度抑制体外蛋白酪氨酸磷酸酶1B（PTP1B），可用于制备治疗糖尿病的药物，为荜茇中酰胺生物碱治疗糖尿病的药物开发提供了有利物质基础。

Description

一种荜茇酰胺生物碱的降糖用途
技术领域
本发明涉及医药技术领域，涉及一种荜茇酰胺生物碱的降糖用途，具体涉及荜茇酰胺生物碱在抑制蛋白酪氨酸磷酸酶1B(PTP1B)活性中的用途。
背景技术
荜茇(Piper longum Linn.)是一种多年生草质藤本植物，属于胡椒科(Piperaceae)胡椒属(Piper)，其干燥近成熟或者成熟果穗是中药、维药、藏药、蒙药及印度阿育吠陀医学中的常用药材，用于脘腹冷痛，呕吐，泄泻，寒凝气滞，胸痹心痛，头痛，牙痛，收载于《中国药典》和《中华人民共和国药典卫生部药品标准维吾尔药分册》中。酰胺生物碱是荜茇及胡椒属植物中的特征性次生代谢产物和主要活性物质，被发现具有显著的抗肿瘤、抗动脉粥样硬化、降血脂、免疫调节、护肝和抗抑郁作用。在悉达(Siddha)、尤那尼(Unani)和阿育吠陀(Ayurveda)医药论著记载中，荜茇被认为有益于糖尿病的治疗。然而到目前，仅有一篇文献报道了荜茇果实的乙醇提取物对阿脲诱导的糖尿病大鼠具有降糖效果，还未见荜茇中酰胺生物碱类化合物降糖活性的报道。
糖尿病是由于胰岛素分泌缺陷或胰岛素作用障碍所导致的以高血糖为特征的代谢性疾病，是严重危害人体健康的慢性终身疾病。持续高血糖与长期代谢紊乱等可导致全身组织器官，尤其是眼、肾、心血管及神经系统的损害及其功能障碍和衰竭，引起多种并发症。糖尿病是一种终身疾病，难以彻底治愈，需要长期服药。蛋白酪氨酸磷酸酶1B(PTP1B)广泛存在于人体组织中，已发现其与糖尿病的发生和发展密切相关，研究表明蛋白酪氨酸磷酸酶1B(PTP1B)抑制剂能够提高胰岛素的敏感性，从而达到治疗糖尿病的效果。而α-葡萄糖苷酶抑制剂则是通过减少机体对摄入的碳水化合物的消化吸收，从而降低餐后血糖水平，对糖尿病起到治疗作用。至目前，蛋白酪氨酸磷酸酶1B(PTP1B)和α-葡萄糖苷酶均是治疗糖尿病的热门靶点，二者通过不同途径和作用机制起到降糖作用，蛋白酪氨酸磷酸酶1B(PTP1B)和α-葡萄糖苷酶的靶向抑制剂均是开发新型降糖药物的重要途径。
发明内容
本发明的目的在于，提供一种荜茇酰胺生物碱的降糖用途，所述荜茇酰胺生物碱为假荜茇酰胺A、假荜茇酰胺B、假荜茇酰胺C和几内亚胡椒酰胺，对其进行了体外蛋白酪氨酸磷酸酶1B(PTP1B)的活性测定，结果表明：所述假荜茇酰胺A、假荜茇酰胺B、假荜茇酰胺C和几内亚胡椒酰胺能不同程度抑制体外蛋白酪氨酸磷酸酶1B(PTP1B)，可用于制备治疗糖尿病的药物。
本发明所述的一种荜茇酰胺生物碱的降糖用途，所述荜茇酰胺生物碱为假荜茇酰胺A、假荜茇酰胺B、假荜茇酰胺C和几内亚胡椒酰胺在制备抑制蛋白酪氨酸磷酸酶1B活性中的用途。
本发明所述的一种荜茇酰胺生物碱的降糖用途，所述荜茇酰胺生物碱——假荜茇酰胺A、假荜茇酰胺B、假荜茇酰胺C和几内亚胡椒酰胺是申请人2017年从荜茇中分离鉴定的酰胺生物碱，其结构式为：
对于从荜茇中分离鉴定的10个具有类似结构的酰胺生物碱做了蛋白酪氨酸磷酸酶1B(PTP1B)的抑制活性筛选，结果显示只有四个即假荜茇酰胺A、假荜茇酰胺B、假荜茇酰胺C和几内亚胡椒酰胺具有抑制蛋白酪氨酸磷酸酶1B(PTP1B)的活性。这四个中含有共同结构特征的结构式为：
该结构特征：都含有结构片段I(3-乙烯基-1,2-亚甲二氧苯)和结构片段II(N-叔丁基丙烯酰胺)，且两个结构片段之间的脂肪链长度(n)为4到8个碳原子，而两个结构片段之间的脂肪链长度小于4的化合物对蛋白酪氨酸磷酸酶1B(PTP1B)则没有抑制活性。结果表明，含有结构片段Ⅰ和结构片段Ⅱ，以及两个结构片段之间脂肪链长度为4到8个碳原子可能是这类酰胺生物碱具有蛋白酪氨酸磷酸酶1B(PTP1B)抑制活性的必要条件。
本发明所述的一种荜茇酰胺生物碱的降糖用途，其中所述的荜茇酰胺生物碱是从荜茇的果穗中分离鉴定的，具体操作按下列步骤进行：
a、将干燥的荜茇果穗4.5公斤粉碎，用95％的乙醇室温下冷浸提取三次，每次用20L乙醇，将提取液45℃条件下用旋转蒸发仪减压蒸干，得到450克的提取物。
b、将步骤a所得提取物用水分散，加入石油醚、乙酸乙酯、正丁醇依次萃取3-5次，将萃取液减压蒸干，分别得到石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取物。
c、将步骤b所得的乙酸乙酯萃取物用正向硅胶柱层析分离，用体积比100:0－1:1的氯仿-甲醇进行梯度洗脱，得到30个流分Fr1－Fr30。流分经硅胶薄层层析(TLC)分析，将流分Fr1－Fr8合并，得到合并流分F1。
d、将合并流分F1用正向硅胶柱层析分离，用体积比100：0－1：1的石油醚-乙酸乙酯进行梯度洗脱，得到99个流分F1-1－F1-99。
e、几内亚胡椒酰胺从流分F1-56～F1-64中结晶，利用重结晶的方法纯化得到其单体化合物。
f、经硅胶薄层层析(TLC)分析，将流分F1-81－F1-88合并，得到合并流分F2。
g、将合并流分F2用反相C-18球形硅胶柱层析进行分离，用体积比40：60－100：0的甲醇-水进行梯度洗脱，得到220个流分F2-1－F2-220。
h、经硅胶薄层层析(TLC)分析，将流分F2-30－F2-51合并，利用半制备高效液相色谱进行分离纯化，用体积比58：42－67：33的甲醇-水进行梯度洗脱，得到假荜茇酰胺A、假荜茇酰胺B和假荜茇酰胺C。
具体实施方式
实施例
材料与试剂：假荜茇酰胺A、假荜茇酰胺B、假荜茇酰胺C和几内亚胡椒酰胺是从荜茇中分离得到；二硫代苏糖醇(dithiothreitol，DTT)，对硝基苯磷酸二钠盐(4-nitrophenylphosphate，pNPP)，胰蛋白胨，酵母提取物，异丙基硫代吡喃半乳糖(isopropylβ-D-Thiogalactoside，IPTG)均购自Sigma公司；
PTP1B-抑制剂[3-(3,5-dibromo-4-hydroxy-benzoyl)-2-ethyl-benzofuran-6-sulfonicacid-(4-(thiazol-2-ylsulfamyl)-phenyl)-amide]购自Merck公司；
酶标仪(SpectraMax MD5)购自美国Molecular Devices公司。
实验方法：
蛋白酪氨酸磷酸酶1B(PTP1B)抑制活性的测定：
蛋白酪氨酸磷酸酶1B(PTP1B)活性测定反应体系：取0.5微升酶于300微升磷酸盐缓冲液(PBS)中充分混匀，取出179微升混合好的酶液于96孔板中，再加入1微升二甲基亚砜(DMSO)，室温孵育5分钟，加入20微升对硝基苯磷酸二钠盐(3.5mM)，室温避光孵育30分钟后，用酶标仪在405纳米处检测光密度(OD)值，以光密度值(OD)在0.8±0.1之间为指标确定酶溶液的浓度，取179微升蛋白酪氨酸磷酸酶1B(PTP1B)酶工作液加入96孔板，加入1微升测试样品(或者DMSO做空白)，震匀后反应5分钟，再放置5分钟，加入20微升对硝基苯磷酸二钠盐，震匀后室温避光反应30分钟，酶标仪405纳米处检测光密度(OD)值，计算不同浓度的抑制率。抑制率(％)＝[1–(样品组OD–样品空白组OD)/(酶活组OD–酶活对照组OD)]×100％；
实验所得数据用平均数士标准差(mean士SD)表示，用SPSS19.0进行加药组与模型组之间进行单因素方差显著性分析,*p<0.05，**p<0.01为差异有显著性意义；
实验结果：从荜茇中分离得到的酰胺生物碱对蛋白酪氨酸磷酸酶1B(PTP1B)活性的影响见表1：
表1.荜茇酰胺生物碱对蛋白酪氨酸磷酸酶1B(PTP1B)的IC50值
由表可知，荜茇酰胺生物碱中的假荜茇酰胺A、假荜茇酰胺B、假荜茇酰胺C和几内亚胡椒酰胺均能抑制蛋白酪氨酸磷酸酶1B(PTP1B)的活性。
综上，荜茇酰胺生物碱假荜茇酰胺A、假荜茇酰胺B、假荜茇酰胺C和几内亚胡椒酰胺可以通过抑制蛋白酪氨酸磷酸酶1B(PTP1B)的活性而起到降糖的用途，而这类活性化合物的结构中均含有结构片段I(3-乙烯基-1,2-亚甲二氧苯)和结构片段II(N-叔丁基丙烯酰胺)且两个结构片段之间的脂肪链长度为4到8个碳原子。

Claims (1)

1.一种荜茇酰胺生物碱的降糖用途，其特征在于，所述荜茇酰胺生物碱中的假荜茇酰胺A、假荜茇酰胺B、假荜茇酰胺C和几内亚胡椒酰胺在制备抑制蛋白酪氨酸磷酸酶1B活性中的用途。
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