CN109321575A - 猪脂肪组织特异性启动子及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了猪脂肪组织特异性启动子及其应用。本发明所提供的特异DNA分子，其核苷酸序列如序列表中序列2自5’末端起第2044至3090位所示或如序列表中序列2所示。实验证明，本发明提供的特异DNA分子可以在猪脂肪组织中特异启动目的基因(如双荧光素酶报告基因)的表达，说明该特异DNA分子是一个脂肪组织特异性启动子。本发明具有重要的应用价值。

Description

猪脂肪组织特异性启动子及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及猪脂肪组织特异性启动子及其应用。

背景技术

启动子是位于基因起始密码子(ATG)上游的一段DNA序列，能够与RNA聚合酶结合并启动基因的转录，相当于基因转录的“开关”。启动子主要包含两个区域：核心启动区和非核心启动区。核心启动区形成普遍性转录结构，通常由一些短的保守序列(如转录起始位点、TATA-box、CAAT-box等)组成。这些序列的结构特征决定着启动子同RNA聚合酶的识别、结合及起始转录过程。非核心启动区包括近端调控区和远端调控区，往往存在一些特异性的转录因子结合的位点，调控基因转录的时间和空间特异性。根据启动子的转录模式不同将其分为组成型、诱导型和组织特异性启动子三类。组成型启动子能在不同类型的细胞及细胞发育的不同阶段，持续高效地驱动基因转录，并且转录活性相对恒定，受组成型启动子驱动的基因往往被称作管家基因(housekeeping gene)。诱导型启动子需要诱导信号刺激，才能启动基因的转录，当诱导信号消失后，诱导型启动子的活性降低或消失，诱导型启动子在植物中更为常见，它所驱动的基因通常在植物生长发育调节和不良环境应对过程中发挥重要作用。组织特异型启动子是仅在某些特定类型的细胞(组织)或细胞(组织)发育的某一特定阶段高效地转录，其含有决定启动子的特异性的顺式调控元件，要与该组织特异性存在的转录因子相结合，才表现出启动子活性，组织特异性启动子驱动的基因往往与该种类型的细胞(组织)功能密切相关。由于组织特异性启动子能够驱动基因仅在特定类型的细胞(组织)中表达，在构建组织特异性基因修饰动物中具有重要的应用，一方面可以通过Cre-LoxP重组酶系统在某种特定类型的细胞(组织)中敲除某一功能基因，研究其对该组织发育和生理功能的影响；另一方面，可以驱动外源基因在某一特定类型的细胞(组织)中转录、表达，而对其他组织、器官不产生(或少产生)影响，目前应用最为成为成功的例子是利用乳腺特异性启动子驱动编码药物蛋白的基因，特异性表达于牛乳中，即乳腺生物反应器。

脂肪沉积性状是猪最重要的经济性状之一，它直接影响着猪的生产效率、猪肉品质、繁殖性能等诸多方面。目前，由于缺乏具有育种价值的功能基因和调控元件，所以极大的限制了家猪分子育种的发展。构建基因修饰(转基因或基因敲除)猪是验证基因育种价值的重要研究手段。猪脂肪组织特异性启动子是构建脂肪组织特异性基因修饰猪的必要条件条件，使深入研究猪脂肪组织代谢调控成为可能。获得猪脂肪组织特异性启动子不仅能够推动家猪分子育种的研究，还能用于构建脂类代谢异常的疾病模型猪，推动相关医学、药学的研究。

发明内容

本发明的目的是启动目的基因在脂肪组织中表达。

本发明首先保护一种特异DNA分子，其可包括区段A；所述区段A的核苷酸序列可如序列表中序列2自5’末端起第2044至3090位所示。

所述特异DNA分子具体可由所述区段A组成。

所述特异DNA分子还可包括区段B；所述区段B位于所述区段A的上游；所述区段B的核苷酸序列可如序列表中序列2自5’末端起第1至2043位所示。

所述特异DNA分子具体可由所述区段A和所述区段B组成。

所述特异DNA分子具体可为b1)或b2)或b3)或b4)所示的DNA分子：

b1)核苷酸序列为序列表中序列2自5’末端起第2044至3090位所示的DNA分子；

b2)核苷酸序列为序列表中序列2所示的DNA分子；

b3)与b1)或b2)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性且具有启动子功能的DNA分子；

b4)与b1)或b2)限定的核苷酸序列杂交且具有启动子功能的DNA分子。

本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的特异DNA分子的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明提供的特异DNA分子的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要具有启动子功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。

这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的特异DNA分子的核苷酸序列具有75％或更高，80％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。

含有上述任一所述特异DNA分子的表达盒也属于本发明的保护范围。

所述表达盒(从5’至3’)可包括启动子区(由所述特异DNA分子组成)、转录起始区、目的基因区、转录终止区和任选的翻译终止区。所述启动子区和目的基因区对宿主细胞而言可为天然的/类似的，或者，所述启动子区和目的基因区相互之间可为天然的/类似的，或者，所述启动子区和/或目的基因区对宿主而言或者其相互之间为异源的。“异源的”指序列为源自外来物种的序列，或，如果来自相同物种，则通过刻意的人为干预在组分和/或基因组位点方面对天然形式进行了实质性修饰。任选含有的转录终止区可与转录起始区同源，与可操作地连接的目的基因区同源，与宿主同源；或；目的基因区、宿主为外源或异源。

所述表达盒还可包括5’引导序列。5’引导序列可增强翻译。

在制备表达盒时，可应用衔接头或联结子连接DNA片段、或、可涉及其它操作以提供适当的限制酶切位点、去除多余的DNA、去除限制酶切位点等。为达到这一目的，可进行体外突变、引物修复、限制性酶切、退火、重新替换，例如转换和颠换。

所述表达盒还可包括用于筛选已转化细胞的选择性标记基因。选择性标记基因可用于筛选已转化细胞或组织。标记基因包括编码抗生素抗性的基因。其它选择性标记包括表型标记例如荧光蛋白。以上列出的选择性标记不具有限制性。本发明可使用任何选择性标记基因。

含有上述任一所述特异DNA分子的重组质粒也属于本发明的保护范围。

所述重组质粒可为将上述任一所述特异DNA分子插入出发质粒，得到的重组质粒。所述重组质粒具体可为将上述任一所述特异DNA分子插入出发质粒的多克隆位点，得到的重组质粒。

所述重组质粒可包括上述任一所述含有所述特异DNA分子的表达盒。

所述重组质粒具体可为实施例提及的重组质粒pGL3-pro-3k。所述重组质粒pGL3-pro-3k可为将质粒pGL3-Basic的限制性内切酶NheI和XhoI识别序列间的小片段替换为序列表中序列2所示的DNA分子。

所述重组质粒具体可为实施例提及的重组质粒pGL3-pro-1k。所述所述重组质粒pGL3-pro-1k为将质粒pGL3-Basic的限制性内切酶NheI和XhoI识别序列间的小片段替换为序列表中序列2自5’末端起第2044至3090位所示的DNA分子。

含有上述任一所述特异DNA分子的转基因动物细胞系也属于本发明的保护范围。

所述动物细胞系可为成熟脂肪细胞。所述成熟脂肪细胞可由3T3-L1前脂肪细胞诱导分化而成。

本发明还保护A1)或A2)。

A1)上述任一所述特异DNA分子作为启动子或脂肪组织特异性启动子的应用。

A2)上述任一所述特异DNA分子、或、上述任一所述表达盒、或、上述任一所述重组质粒在启动目的基因的表达中的应用。

转录因子c/EBPα(GenBank：NC_010448.4)和/或编码转录因子c/EBPα的基因在提高上述任一所述特异DNA分子作为启动子或脂肪组织特异性启动子转录活性中的应用也属于本发明的保护范围。

上述应用中，所述编码转录因子c/EBPα的基因的核苷酸序列可如序列表中序列6所示。

转录因子KLF4(GenBank:EU669075.2)和/或转录因子c/EBPβ(GenBank:AB569088.1)和/或编码转录因子KLF4的基因和/或编码转录因子c/EBPβ的基因在降低上述任一所述特异DNA分子作为启动子或脂肪组织特异性启动子转录活性中的应用也属于本发明的保护范围。

上述应用中，所述编码转录因子C/EBPβ的基因的核苷酸序列可如序列表中序列7所示。

上述应用中，所述编码转录因子KLF4的基因的核苷酸序列可如序列表中序列8所示。

本发明还保护表达目的基因的方法。

本发明所保护的表达目的基因的方法，具体可为方法A，所述方法A可为以上述任一所述特异DNA分子作为启动子或脂肪组织特异性启动子来启动目的基因的表达。

本发明所保护的表达目的基因的方法，具体可为方法B，所述方法B可包括如下步骤：将上述任一所述特异DNA分子插入到任何目的基因或增强子的上游，以此来启动目的基因的表达。

本发明所保护的表达目的基因的方法，具体可为方法C，所述方法C可包括如下步骤：将目的基因插入上述任一所述表达盒中的所述特异DNA分子的下游，由所述特异DNA分子启动所述目的基因的表达。

本发明所保护的表达目的基因的方法，具体可为方法D，所述方法D可包括如下步骤：将目的基因插入上述任一所述重组质粒中的所述特异DNA分子的下游，由所述特异DNA分子启动所述目的基因的表达。

上述任一所述目的基因的表达具体可为目的基因在脂肪组织表达。

上述任一所述特异DNA分子可以作为启动子(具体可为脂肪组织特异性启动子)可在动物中表达基因(如外源基因)。

上述任一所述动物可为猪。

上述任一所述脂肪组织可为猪脂肪组织。

上述任一所述猪具体可为长白猪。

上述任一目的基因可为双荧光素酶报告基因。

实验证明，本发明提供的特异DNA分子可以在猪脂肪组织中特异启动目的基因(如双荧光素酶报告基因)的表达，说明该特异DNA分子是一个脂肪组织特异性启动子。本发明具有重要的应用价值。

附图说明

图1为实施例2中步骤一的实验结果。

图2为成熟脂肪细胞和293T细胞的双荧光素酶报告基因检测结果。

图3为不同转录因子的作用下猪脂肪组织特异性启动子-3的活性检测结果。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的实验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。

以下实施例中的定量实验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

动物组织基因组DNA小量提取试剂盒为QIAGEN公司的产品。质粒pGL3-Basic为Promega公司的产品。IBMX、地塞米松和胰岛素均为Sigma公司的产品，产品目录号分别为I5879、D1756和I5500。质粒pGL3-Promoter和pRL-TK质粒均为Promega公司的产品。

下述实施例中涉及的引物名称及其核苷酸序列见表1。

表1.扩增启动子片段的引物序列

注：单下划线为限制性内切酶NheI的识别序列，双下划线为限制性内切酶XhoI的识别序列。

实施例1、猪脂肪组织特异性启动子的克隆

一、猪脂肪组织特异性启动子-1的克隆

1、采用动物组织基因组DNA小量提取试剂盒提取长白猪的背最长肌的基因组DNA并以其作为模板，采用pro-1k和pro-R组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。

反应条件：98℃预变性30s；98℃变性10s，58℃退火30s，68℃延伸45s，30个循环；68℃延伸10min。

2、完成步骤1后，将PCR扩增产物进行1％(1g/100mL)琼脂糖凝胶电泳检测，然后回收1047bp的PCR扩增产物。

3、用限制性内切酶NheI和XhoI酶切步骤2回收的PCR扩增产物，回收酶切产物。

4、用限制性内切酶NheI和XhoI酶切质粒pGL3-Basic，回收约4818bp的载体骨架。

5、将步骤3得到的酶切产物和步骤4得到的载体骨架连接，得到重组质粒pGL3-pro-1k。

对重组质粒pGL3-pro-1k进行测序。根据测序结果，对重组质粒pGL3-pro-1k进行结构描述如下：将质粒pGL3-Basic的限制性内切酶NheI和XhoI识别序列间的小片段替换为序列表中序列1所示的DNA分子。序列表中序列1所示的DNA分子即为猪脂肪组织特异性启动子-1的核苷酸序列。

二、猪脂肪组织特异性启动子-3的克隆

按照步骤一的方法，将步骤1中的pro-1k替换为pro-3k，其它步骤均不变，得到重组质粒pGL3-pro-3k。

对重组质粒pGL3-pro-3k进行测序。根据测序结果，对重组质粒pGL3-pro-3k进行结构描述如下：将质粒pGL3-Basic的限制性内切酶NheI和XhoI识别序列间的小片段替换为序列表中序列2所示的DNA分子。序列表中序列2所示的DNA分子即为猪脂肪组织特异性启动子-3的核苷酸序列。

三、猪脂肪组织特异性启动子-5的克隆

按照步骤一的方法，将步骤1中的pro-1k替换为pro-5k，其它步骤均不变，得到重组质粒pGL3-pro-5k。

对重组质粒pGL3-pro-5k进行测序。根据测序结果，对重组质粒pGL3-pro-5k进行结构描述如下：将质粒pGL3-Basic的限制性内切酶NheI和XhoI识别序列间的小片段替换为序列表中序列3所示的DNA分子。序列表中序列3所示的DNA分子即为猪脂肪组织特异性启动子-5的核苷酸序列。

四、猪脂肪组织特异性启动子-8的克隆

将质粒pGL3-Basic的限制性内切酶NheI和XhoI识别序列间的小片段替换为序列表中序列4所示的DNA分子，得到重组质粒pGL3-pro-8k。

序列表中序列4所示的DNA分子即为猪脂肪组织特异性启动子-8的核苷酸序列。

五、猪脂肪组织特异性启动子-9的克隆

将质粒pGL3-Basic的限制性内切酶NheI和XhoI识别序列间的小片段替换为序列表中序列5所示的DNA分子，得到重组质粒pGL3-pro-9k。

序列表中序列5所示的DNA分子即为猪脂肪组织特异性启动子-9的核苷酸序列。

实施例2、猪脂肪组织特异性启动子的活性检测

3T3-L1前脂肪细胞为上海弘顺生物科技有限公司的产品。

一、3T3-L1前脂肪细胞诱导分化为成熟脂肪细胞

1、取12孔板，加入适量3T3-L1前脂肪细胞和1mL含10％(v/v)FBS的DMEM培养基，置于37.0℃、5％CO₂饱和湿度的培养箱中培养(培养期间，1-2d换液一次)。

2、待步骤1 12孔板中的3T3-L1前脂肪细胞生长至汇合度为70％-80％时，弃培养基，每孔加入2mL脂肪细胞分化诱导培养基，37.0℃、5％CO₂培养48h。

脂肪细胞分化诱导培养基：含0.5mM IBMX、1μM地塞米松和5μg/ml胰岛素的DMEM完全培养基。

3、完成步骤2后，弃培养基，每孔加入1mL脂肪细胞分化保持培养基，37.0℃、5％CO₂培养48h。

脂肪细胞分化保持培养基：含5μg/ml胰岛素的DMEM完全培养基。

4、完成步骤2后，弃培养基，每孔加入1mL含10％(v/v)FBS的DMEM培养基，37.0℃、5％CO₂培养(培养期间，1-2d换液一次)，直至成熟脂肪细胞占总细胞面积的90％时停止培养。

油红染色实验结果见图1(左图为3T3-L1前脂肪细胞，右图为成脂细胞，即成熟脂肪细胞)。结果表明，步骤4中37.0℃、5％CO₂培养24h时(此时为诱导第5d)，12孔板中的细胞变成椭梭形，呈束状排列成一片，且细胞内有大量脂滴积累，油红染色可见细胞内有大量红染颗粒。由此可见，3T3-L1前脂肪细胞成功诱导分化为成熟脂肪细胞。

二、共转染成熟脂肪细胞和293T细胞

质粒pGL3-Promoter作为阳性对照质粒。pRL-TK质粒作为内对照质粒。

进行每次实验时，待测质粒都做三个平行样。

1、取离心管(规格为1.5mL)，每管分别加入1μg待测质粒(重组质粒pGL3-pro-1k、重组质粒pGL3-pro-3k、重组质粒pGL3-pro-5k、重组质粒pGL3-pro-8k、重组质粒pGL3-pro-9k、质粒pGL3-Promoter或质粒pGL3-Basic)和125μL DMEM培养基，吹打混匀。

2、完成步骤1后，取所述离心管，每管加入2μL转染试剂Lipofectamine 2000和2.5μg pRL-TK质粒，混匀，室温孵育20min。

3、取完成步骤一中4的12孔板，弃培养基，用DMEM培养基洗涤3次，然后每孔加入1mL DMEM培养基。

4、取完成步骤3的12孔板，每孔加入完成步骤2的离心管中的液体250μL，然后将所述12孔板置于37.0℃、5％CO₂饱和湿度的培养箱中培养5h。

5、取完成步骤4的12孔板，弃培养基，用含10％(v/v)FBS的DMEM培养基洗涤3次，然后每孔加入1mL含10％(v/v)FBS的DMEM培养基，置于37.0℃、5％CO₂饱和湿度的培养箱中培养24h，得到待测质粒和内对照质粒共转染的成熟脂肪细胞。

按照上述步骤，将步骤3替换为步骤A，其它步骤均不变，得到待测质粒和内对照质粒共转染的293T细胞。步骤A为：取生长至对数期的293T细胞，弃培养基，用DMEM培养基洗涤3次，然后每孔加入1mL DMEM培养基。

三、双荧光素酶报告基因检测猪脂肪组织特异性启动子的活性

Luciferase Reagent：(1)将 Luciferase Buffer和 Stop& Buffer提前数天放于室温下平衡；(2)将Luciferase Buffer完全加入到 Luciferase Substrate瓶中，完全溶解底物，形成 Luciferase Reagent，分装保存于-70℃。

Stop& Reagent：由1体积份 Stop&Substrate和100体积份 Stop& Buffer混合而成。

1、取完成步骤二中5的12孔板(12孔板中含有“待测质粒和内对照质粒共转染的成熟脂肪细胞”或“待测质粒和内对照质粒共转染的293T细胞”)，用真空泵将孔内的培养基缓慢吸净，然后每孔加入1mL pH7.25-7.35、0.01mM的PBS缓冲液漂洗，重复两次。

2、完成步骤1后，取所述12孔板，每孔加入200μL 0.1％胰蛋白酶，37℃消化2min(此时全部细胞被消化)；然后每孔加入500μL含10％(v/v)FBS的DMEM培养基以终止消化，用移液枪反复吹打孔底直到细胞完全脱离孔底；迅速将细胞转移至无菌离心管(规格为1.5mL)，然后置于离心机，1000r/min离心5min，收集沉淀。

3、完成步骤2后，取所述沉淀，加入75μL pH7.25-7.35、0.01mM的PBS缓冲液重悬，混匀；然后加入75μL Luciferase Reagent，室温反应10min，待细胞充分裂解后，吹打混匀转移至Lockwell maxisorp检测板(用蒸馏水清洗后，经紫外照射1h)。检测板的每孔加50μL，共三个复孔。

4、完成步骤3后，将所述Lockwell maxisorp检测板置于摇床上，避光、70r/min振荡20min，然后采用酶标仪检测萤火虫萤光素酶荧光值。

5、完成步骤4后，在所述Lockwell maxisorp检测板的每孔加入50μL Stop& Reagent，吹打混匀；然后再在所述Lockwell maxisorp检测板的每孔加入50μL Stop& Reagent，吹打混匀；最后采用酶标仪检测海肾荧光素酶荧光值，该检测时间点距离 Luciferase Reagent加入时间点与firefly luminescence检测时间点距 Luciferase Reagent加入时间点一致。

成熟脂肪细胞的双荧光素酶报告基因检测结果见图2中A(Basic为质粒pGL3-Basic，FABP4-1kb为重组质粒pGL3-pro-1k，FABP4-3kb为重组质粒pGL3-pro-3k，FABP4-5kb为重组质粒pGL3-pro-5k，FABP4-8kb为重组质粒pGL3-pro-8k，FABP4-9kb为重组质粒pGL3-pro-9k)。结果表明，猪脂肪组织特异性启动子-1、猪脂肪组织特异性启动子-3、猪脂肪组织特异性启动子-5、猪脂肪组织特异性启动子-8和猪脂肪组织特异性启动子-9在成熟脂肪细胞中表现出不同的活性，猪脂肪组织特异性启动子-3的启动子活性最高，猪脂肪组织特异性启动子-1的启动子活性次之，猪脂肪组织特异性启动子-5、猪脂肪组织特异性启动子-8和猪脂肪组织特异性启动子-9几乎均没有启动子活性。

293T细胞的双荧光素酶报告基因检测结果见图2中B(Basic为质粒pGL3-Basic，FABP4-1kb为重组质粒pGL3-pro-1k，FABP4-3kb为重组质粒pGL3-pro-3k，FABP4-5kb为重组质粒pGL3-pro-5k，FABP4-8kb为重组质粒pGL3-pro-8k，FABP4-9kb为重组质粒pGL3-pro-9k)。结果表明，猪脂肪组织特异性启动子-1、猪脂肪组织特异性启动子-3、猪脂肪组织特异性启动子-5、猪脂肪组织特异性启动子-8和猪脂肪组织特异性启动子-9在293T细胞均没有启动子活性。

由此可见，猪脂肪组织特异性启动子-1和猪脂肪组织特异性启动子-3为脂肪组织特异性启动子。

实施例3、不同转录因子的作用下猪脂肪组织特异性启动子-3的活性检测

一、3T3-L1前脂肪细胞诱导分化成成熟脂肪细胞

同实施例2中步骤一。

二、重组质粒pGL3-pro-3k、含转录因子的重组质粒和内对照质粒共转染成熟脂肪细胞

进行每次实验时，待测质粒都做三个平行样。

1、取离心管(规格为1.5mL)，每管加入1μg重组质粒pGL3-pro-3k和125μL DMEM培养基，吹打混匀。

2、完成步骤1后，取所述离心管，每管加入0.5μg含转录因子的重组质粒(重组质粒pcDNA3.1-C/EBPα、重组质粒pcDNA3.1-C/EBPβ、重组质粒pcDNA3.1-KLF4、重组质粒pcDNA3.1-KLF15或重组质粒pcDNA3.1-PPARγ)、0.5μg pRL-TK质粒、2μL转染试剂Lipofectamine 2000和125μL DMEM培养基混匀，室温孵育20min。

载体pcDNA3.1为赛默飞公司的产品。

将载体pcDNA3.1的限制性内切酶Xho I和BamH I识别序列间的小片段替换为序列表中序列6所示的DNA分子(即转录因子C/EBPα的编码基因)，得到重组质粒pcDNA3.1-C/EBPα。重组质粒pcDNA3.1-C/EBPα表达转录因子C/EBPα(GenBank：NC_010448.4)。

将载体pcDNA3.1的限制性内切酶Xho I和BamH I识别序列间的小片段替换为序列表中序列7所示的DNA分子(即转录因子C/EBPβ的编码基因)，得到重组质粒pcDNA3.1-C/EBPβ。重组质粒pcDNA3.1-C/EBPβ表达转录因子C/EBPβ(GenBank:AB569088.1)。

将载体pcDNA3.1的限制性内切酶Xho I和BamH I识别序列间的小片段替换为序列表中序列8所示的DNA分子(即转录因子KLF4的编码基因)，得到重组质粒pcDNA3.1-KLF4。重组质粒pcDNA3.1-KLF4表达转录因子KLF4(GenBank:EU669075.2)。

将载体pcDNA3.1的限制性内切酶Xho I和BamH I识别序列间的小片段替换为序列表中序列9所示的DNA分子(即转录因子KLF15的编码基因)，得到重组质粒pcDNA3.1-KLF15。重组质粒pcDNA3.1-KLF15表达转录因子KLF15(GenBank:NM_001134349.2)。

将载体pcDNA3.1的限制性内切酶Xho I和BamH I识别序列间的小片段替换为序列表中序列10所示的DNA分子(即转录因子PPARγ的编码基因)，得到重组质粒pcDNA3.1-PPARγ。重组质粒pcDNA3.1-PPARγ表达转录因子PPARγ(GenBank:AB097930.1)。

3、同实施例2步骤二中3。

4、同实施例2步骤二中4。

5、取完成步骤4的12孔板，弃培养基，用含10％(v/v)FBS的DMEM培养基洗涤3次，然后每孔加入1mL含10％(v/v)FBS的DMEM培养基，置于37.0℃、5％CO₂饱和湿度的培养箱中培养24h，得到重组质粒pGL3-pro-3k、含转录因子的重组质粒和内对照质粒共转染成熟脂肪细胞。

按照上述步骤，将步骤2替换为步骤B，其它步骤均不变，得到重组质粒pGL3-pro-3k和内对照质粒共转染成熟脂肪细胞(阴性对照)。步骤B为：完成步骤1后，取所述离心管，每管加入0.5μg pRL-TK质粒和2μL转染试剂Lipofectamine 2000，混匀，室温孵育20min。

按照上述步骤，将步骤1替换为步骤C，步骤2替换为所述步骤B，其它步骤均不变，得到质粒pGL3-Basic和内对照质粒共转染成熟脂肪细胞(阴性对照)。步骤C为：取离心管(规格为1.5mL)，每管加入1μg质粒pGL3-Basic和125μL DMEM培养基，吹打混匀。

三、双荧光素酶报告基因检测不同转录因子的作用下猪脂肪组织特异性启动子-3的活性

1、取完成步骤二中5的12孔板(12孔板中含有“重组质粒pGL3-pro-3k、含转录因子的重组质粒和内对照质粒共转染成熟脂肪细胞”、“重组质粒pGL3-pro-3k和内对照质粒共转染成熟脂肪细胞”或“质粒pGL3-Basic和内对照质粒共转染成熟脂肪细胞”)，用真空泵将孔内的培养基缓慢吸净，然后每孔加入1mL pH7.25-7.35、0.01mM的PBS缓冲液漂洗，重复两次。

2、同实施例2步骤三中2。

3、同实施例2步骤三中3。

4、同实施例2步骤三中4。

5、同实施例2步骤三中5。

实验结果见图3(Basic为质粒pGL3-Basic和内对照质粒共转染成熟脂肪细胞，3k可为重组质粒pGL3-pro-3k和内对照质粒共转染成熟脂肪细胞，3k+C/EBPα为重组质粒pGL3-pro-3k、重组质粒pcDNA3.1-C/EBPα和内对照质粒共转染成熟脂肪细胞，3k+C/EBPβ为重组质粒pGL3-pro-3k、重组质粒pcDNA3.1-C/EBPβ和内对照质粒共转染成熟脂肪细胞，3k+KLF4为重组质粒pGL3-pro-3k、重组质粒pcDNA3.1-KLF4和内对照质粒共转染成熟脂肪细胞；3k+KLF15为重组质粒pGL3-pro-3k、重组质粒pcDNA3.1-KLF15和内对照质粒共转染成熟脂肪细胞；3k+PPARγ为重组质粒pGL3-pro-3k、重组质粒pcDNA3.1-PPARγ和内对照质粒共转染成熟脂肪细胞)。结果表明，猪脂肪组织特异性启动子-3在不同的转录因子的作用下具有不同的启动子活性。c/EBPα使猪脂肪组织特异性启动子-3启动子活性增强，差异极其显著；KLF15和PPARγ对猪脂肪组织特异性启动子-3启动子活性影响不明显；KLF4使猪脂肪组织特异性启动子-3启动子活性减弱，差异极其显著；c/EBPβ使猪脂肪组织特异性启动子-3启动子活性减弱，差异显著。由此可见，c/EBPα是猪脂肪组织特异性启动子-3的正调控转录因子，KLF4和c/EBPβ是猪脂肪组织特异性启动子-3的负调控转录因子。

上述结果表明，C/EBPα是成熟脂肪细胞表达的重要转录因子。猪脂肪组织特异性启动子-1的核苷酸序列中由于存在C/EBPα正调控元件结合位点，具有启动子活性。猪脂肪组织特异性启动子-3的核苷酸序列中不仅存在多个C/EBPα正调控元件结合位点，而且还存在TATA-box、GC-box等一系列顺式作用元件，具有较强的启动子活性。猪脂肪组织特异性启动子-5虽然存在猪脂肪组织特异性启动子-3中的多个C/EBPα正调控元件结合位点和TATA-box、GC-box等一系列顺式作用元件，但其还存在C/EBPβ负调控元件结合位点和KLF4负调控元件结合位点，几乎无启动子活性。

<110> 嘉兴学院

<120> 猪脂肪组织特异性启动子及其应用

<160> 10

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1047

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 1

atggcttgtg accaaaccac ttctgattat ttttaaggaa agcaacacca ttgagctctg 60

gataaattta gagcttatga tatagttcag gaattggatg aattttctca gtatgggaag 120

tatgttttgg actggggtct atttttttaa ggggtccgtg aaaagcaaca tcatcctctc 180

attgaggttt aattatcatt attaattaaa tctactgtcc agatcacagt ggataattgg 240

atttactctt ttttttttta aatccatccc aaatatttga aatgagaagc ttcggttact 300

ttgaaatgcc attactcatt ttgttttaat tgccaggtaa ttcttaagat aaaactgttc 360

cccaaagcct ctgcaaataa cttaatattc aaggtaattc ttacattcct caattctaac 420

gaaccacaca attgtaattt taataaagac ttcagaaaag ggagtcaaaa tttaccccat 480

gataataagc ctgctctact ccacactggg ataaatatgt atgaaaataa taggaggaaa 540

ttcaatgcgc cgaacactaa atggtcagaa cgaaaatgtt taaaatattt tcttaacggc 600

taaaaataag ttgtactcta agtccaatga cccgttgcca gggagaacca aagttgagaa 660

atttctatta aaaacatgac tcagaagaaa aactgcagag gctagtaatg gtggaaatga 720

tatgatattg ttcctaattg gttactccta agatcacatg ttctgggcat ctttaaaagg 780

aagttatctg gactgaagag agtcattgca ccttcctgaa ggttacggct tctttctcac 840

cttgaagaat aatcctagag tgctcacaaa atgtgtgatg catttgtagg tacctggaaa 900

cttgtctcca gtgaaaactt tgatgattac atgaaagaag tgggtaagga aatacattat 960

gggatagctg gatttacaag tttttctctg gggaagagta atttatggct gtttttcact 1020

ctggaagcac cagccagaca tgaagta 1047

<210> 2

<211> 3090

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 2

gaggatatac gggtggccaa tatgcatatg aaaagatgtt ccacattatg tcatcaggaa 60

aatgcaaact gaaacaatga gatagcacca gttaaaatgg ccaaaattac aacattgaca 120

acatcaagtg ctgctgagga tgtgaagcaa cagaacactc attcatttct actgggaatg 180

taaaatagtg ctgcccattt ggaagccagt gcgatggttt cttacagaac taaatattct 240

cgtaccccat catgcttctt ggtatttacc caaagaaagt aaaaactatc tccacccaaa 300

aacctgcatg tggaagttcc cactgtggtg caatgggatg ggcagtgctt tggagcactg 360

ggatgcacct tcaatccctg gcccaataca acgggttaag gatctggagt tgctacagat 420

gcagattagg ctgcaatggc gggttggatc tgatccctgg cttagggact tcatatgcct 480

aggggtggcc aaaaaaacca aaaggacccc caaacaaaca aacaaacaaa cagaaaaccc 540

tgcatgtgga tgtttacagc agatttattg ataatcgcta gaccttggaa accaccacaa 600

tggccccaat agttgaatat atgaataaac tgtagtacct tcagacaatg gaatattctt 660

cagtgttaaa aacgaaatga actcttaagc catgaagaaa catggaggaa acttaaatgc 720

atattactaa gtgaaaaaag ccaatctgac aaggctacta cacactgtat gctcccaatt 780

atatgaaaaa gcagaactat ggagagagta aaaatggcag tggtttgatg gggttgagag 840

caggagtgtg ggagagagat gaacaggcaa agcacagtgg attcttaagg cagtaaaaat 900

actctgtatg atgttataag gatgcacata tgtcattata cttttgtcca aatacataga 960

gaatacaaca tcaagagcga actctaaagt aaaatatgga ctttgggaga ttgtgatgtg 1020

ctggtgtagg ttcatcatta ggaaaaaatg caccattcca gtgagtgatg ttgataatag 1080

gagagactat gcttgtgtca gggcagggtg tatatgagat atctctgtac ttcctctcac 1140

gttttttgta aacttaaaac ttctttaaaa acaattgtct tagaacataa gctaaaaacc 1200

aagcaaacaa aaaataaaag ccattattag tttagaacat tgttatccct ggatgaagac 1260

tgatcatttt tctttcctat ctttctttct ttcttttctt ttttcccctg cttttttagg 1320

gcttctcctg cagcatatgg aagttcccag gctaggggtc aaatcagagc cacagcttgg 1380

cctacaccac agccacaaca atgtggggtc cgagccgtgt ctgtgaccta caccccggct 1440

cctggcaaca ccggattctt aagcaactga gtgaggccag ggatcaaaca tgagtcctca 1500

tggttactag tcaggtttgt tactgttgaa ccgtaatggg aactccccat ttttattttc 1560

ttgttcaatg aatatataat aacaaaagcc catggggaaa cgtacaccac ccacagtcta 1620

tatctctaag caacagtcct gagtgagcaa acatatgtta ctgtgccatt aacatatgca 1680

acacttaaaa ttactattgt aacatgactt tatcaatttt tcatagcaac ttgctttcct 1740

ccagaaaatc ctgtggttta cagaaggctc tgtctcaaat atttctggga agatttcagg 1800

atactgacaa atcaattctt tgatgcagat actgctcagt tgaatacatg gtgtagagat 1860

tcaccactct gtaatatttt aatttgtttt ttttctttcc tgaaatttgg gtacatttat 1920

gtgaatatct cccatcattc tggtacaggg aaggaagtgg gggagggggc tgaaatacat 1980

aattatttta gaaaagcatc ctcaggaata cttcaccatg tgagagaaag aaattagatt 2040

ttgatggctt gtgaccaaac cacttctgat tatttttaag gaaagcaaca ccattgagct 2100

ctggataaat ttagagctta tgatatagtt caggaattgg atgaattttc tcagtatggg 2160

aagtatgttt tggactgggg tctatttttt taaggggtcc gtgaaaagca acatcatcct 2220

ctcattgagg tttaattatc attattaatt aaatctactg tccagatcac agtggataat 2280

tggatttact cttttttttt ttaaatccat cccaaatatt tgaaatgaga agcttcggtt 2340

actttgaaat gccattactc attttgtttt aattgccagg taattcttaa gataaaactg 2400

ttccccaaag cctctgcaaa taacttaata ttcaaggtaa ttcttacatt cctcaattct 2460

aacgaaccac acaattgtaa ttttaataaa gacttcagaa aagggagtca aaatttaccc 2520

catgataata agcctgctct actccacact gggataaata tgtatgaaaa taataggagg 2580

aaattcaatg cgccgaacac taaatggtca gaacgaaaat gtttaaaata ttttcttaac 2640

ggctaaaaat aagttgtact ctaagtccaa tgacccgttg ccagggagaa ccaaagttga 2700

gaaatttcta ttaaaaacat gactcagaag aaaaactgca gaggctagta atggtggaaa 2760

tgatatgata ttgttcctaa ttggttactc ctaagatcac atgttctggg catctttaaa 2820

aggaagttat ctggactgaa gagagtcatt gcaccttcct gaaggttacg gcttctttct 2880

caccttgaag aataatccta gagtgctcac aaaatgtgtg atgcatttgt aggtacctgg 2940

aaacttgtct ccagtgaaaa ctttgatgat tacatgaaag aagtgggtaa ggaaatacat 3000

tatgggatag ctggatttac aagtttttct ctggggaaga gtaatttatg gctgtttttc 3060

actctggaag caccagccag acatgaagta 3090

<210> 3

<211> 5230

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 3

actgcccaat agaaacataa catgagctac atatgtaatc tacaattttc ttacaggcac 60

actaagaaat aagaaaataa acaggtgaaa ttaattttag taatatattt tatttaaccc 120

aatatttcta aaatgttgtt atttcaacat ataagcaatg taagaaaaac ataaaaaaat 180

ttttgagaaa aatttatagc tgaaaagata gactcataat caaattctta tacatctatt 240

taaaagttct gcaataactt aatcaaggtc tttcttaaat tttagttaaa attaagtgaa 300

atacatcaac atcatgaata ttttctcagg tcagtctccc aaagcaatag aaattagagc 360

aaaaataaac ccatgggacc tcatcaaact gaaaagcttt tgcacagcaa aggaaaccaa 420

aaagaaaacc aaaagacaac ttacagaatg ggagaaaata gtttcaaatg atgcaaccga 480

caagggctta atctctagaa tatataagca acttatacaa cccaacagca aaaaagccaa 540

tcaatcaatg gaaaaatggg caaaagacct gaatagacat ttctccaagg aagatataca 600

gatggccagc aaaaacatga aaaaatgctc aacatcactg attataagag aaatgcaaat 660

caaaactacc atgagatacc acctcacccc agtcagaatg gccatcatta agaagtccac 720

aaataacaag tgctggaggg gctgtggaga aaaaggaacc ctcctgcact gttggtggga 780

atgtaaactg gtacagccac tatggagaac agtttggaga taccttagaa atctatacat 840

agaacttcca tatgaccccg caatcccact cttgggcata tatccagaca aaactctcct 900

taaaagagac acatgcaccc gcatgttcat agcagcacta ttcacaatag ccaggacatg 960

gaaacaaccc aaatgtccat cgacagatga ttggattcgg aagatggggt atatatacac 1020

aatggaatac tactaagcca taaaaaagaa tgccataatg ccatttgcag caacatggat 1080

ggaactagag aatctcatac tgagtgaaat gagccagaaa gacaaagata aacaccatat 1140

gatatcactt ataactggaa tctaatatcc agcacagatg aacatctcct cagaaaagaa 1200

aatcatggac ttggagaaga gacttgtggc tgcctgatgg gagggggagg gagtgggagg 1260

gatcgggagc ttgggcttat cagacacaac tgagaataga tttgcaggag ttcccgtcgt 1320

ggcgcagtgg ttaacgaatc cgactaggaa ccatgaggtt gcgggtttgg tccctgccct 1380

tgctcagtgg gttaaggatc cggcgttgcc gtgagctgtg gtgtaggttg cagacacggc 1440

tcggatcccg tgttgctgtg gctctggcgt aggctgatgg ctacagctcc gattcgaccc 1500

ctagcctggg aacctccata tgccacagga gcggcccaaa gaaatagcaa agacaaaaaa 1560

aaaaaaaaag aatagattta caaggagatc ctgctgaata gcattgagaa ctttgtctag 1620

atactcatgt tgcaacagaa caaagggtgg ggaaaaaaat gtaattgtaa tgtatacatg 1680

taaggataac ttgatcccct tgctgtacag tgggaaaatt aaaaaaaaat taaaaaaaaa 1740

taaaataaaa gaaagcataa aaaaattaag tgaaataaaa atttaatgtc tcagttacac 1800

tagcatgtct caagtatttg agagccacat gtgattagaa actacagtat tgaatagccc 1860

atctctaaaa aaatgtttaa atagcagtct cacaatacac acatgttcaa tgtgatgatc 1920

atttgaaaat ctgtctgaag cagtttgtta ttaaaagtaa agaaccagca tatattttga 1980

aaaataaacc attatttaca gactgtgaaa aaatatttac aaaaaccaca ttggaaagaa 2040

gactgttatc caaaatgtac aaagagctct tcaaactaaa aaataagaaa caacataatt 2100

gaaaaaatgg tctatggact ttaatggaca cctcaccaaa gaggatatac gggtggccaa 2160

tatgcatatg aaaagatgtt ccacattatg tcatcaggaa aatgcaaact gaaacaatga 2220

gatagcacca gttaaaatgg ccaaaattac aacattgaca acatcaagtg ctgctgagga 2280

tgtgaagcaa cagaacactc attcatttct actgggaatg taaaatagtg ctgcccattt 2340

ggaagccagt gcgatggttt cttacagaac taaatattct cgtaccccat catgcttctt 2400

ggtatttacc caaagaaagt aaaaactatc tccacccaaa aacctgcatg tggaagttcc 2460

cactgtggtg caatgggatg ggcagtgctt tggagcactg ggatgcacct tcaatccctg 2520

gcccaataca acgggttaag gatctggagt tgctacagat gcagattagg ctgcaatggc 2580

gggttggatc tgatccctgg cttagggact tcatatgcct aggggtggcc aaaaaaacca 2640

aaaggacccc caaacaaaca aacaaacaaa cagaaaaccc tgcatgtgga tgtttacagc 2700

agatttattg ataatcgcta gaccttggaa accaccacaa tggccccaat agttgaatat 2760

atgaataaac tgtagtacct tcagacaatg gaatattctt cagtgttaaa aacgaaatga 2820

actcttaagc catgaagaaa catggaggaa acttaaatgc atattactaa gtgaaaaaag 2880

ccaatctgac aaggctacta cacactgtat gctcccaatt atatgaaaaa gcagaactat 2940

ggagagagta aaaatggcag tggtttgatg gggttgagag caggagtgtg ggagagagat 3000

gaacaggcaa agcacagtgg attcttaagg cagtaaaaat actctgtatg atgttataag 3060

gatgcacata tgtcattata cttttgtcca aatacataga gaatacaaca tcaagagcga 3120

actctaaagt aaaatatgga ctttgggaga ttgtgatgtg ctggtgtagg ttcatcatta 3180

ggaaaaaatg caccattcca gtgagtgatg ttgataatag gagagactat gcttgtgtca 3240

gggcagggtg tatatgagat atctctgtac ttcctctcac gttttttgta aacttaaaac 3300

ttctttaaaa acaattgtct tagaacataa gctaaaaacc aagcaaacaa aaaataaaag 3360

ccattattag tttagaacat tgttatccct ggatgaagac tgatcatttt tctttcctat 3420

ctttctttct ttcttttctt ttttcccctg cttttttagg gcttctcctg cagcatatgg 3480

aagttcccag gctaggggtc aaatcagagc cacagcttgg cctacaccac agccacaaca 3540

atgtggggtc cgagccgtgt ctgtgaccta caccccggct cctggcaaca ccggattctt 3600

aagcaactga gtgaggccag ggatcaaaca tgagtcctca tggttactag tcaggtttgt 3660

tactgttgaa ccgtaatggg aactccccat ttttattttc ttgttcaatg aatatataat 3720

aacaaaagcc catggggaaa cgtacaccac ccacagtcta tatctctaag caacagtcct 3780

gagtgagcaa acatatgtta ctgtgccatt aacatatgca acacttaaaa ttactattgt 3840

aacatgactt tatcaatttt tcatagcaac ttgctttcct ccagaaaatc ctgtggttta 3900

cagaaggctc tgtctcaaat atttctggga agatttcagg atactgacaa atcaattctt 3960

tgatgcagat actgctcagt tgaatacatg gtgtagagat tcaccactct gtaatatttt 4020

aatttgtttt ttttctttcc tgaaatttgg gtacatttat gtgaatatct cccatcattc 4080

tggtacaggg aaggaagtgg gggagggggc tgaaatacat aattatttta gaaaagcatc 4140

ctcaggaata cttcaccatg tgagagaaag aaattagatt ttgatggctt gtgaccaaac 4200

cacttctgat tatttttaag gaaagcaaca ccattgagct ctggataaat ttagagctta 4260

tgatatagtt caggaattgg atgaattttc tcagtatggg aagtatgttt tggactgggg 4320

tctatttttt taaggggtcc gtgaaaagca acatcatcct ctcattgagg tttaattatc 4380

attattaatt aaatctactg tccagatcac agtggataat tggatttact cttttttttt 4440

ttaaatccat cccaaatatt tgaaatgaga agcttcggtt actttgaaat gccattactc 4500

attttgtttt aattgccagg taattcttaa gataaaactg ttccccaaag cctctgcaaa 4560

taacttaata ttcaaggtaa ttcttacatt cctcaattct aacgaaccac acaattgtaa 4620

ttttaataaa gacttcagaa aagggagtca aaatttaccc catgataata agcctgctct 4680

actccacact gggataaata tgtatgaaaa taataggagg aaattcaatg cgccgaacac 4740

taaatggtca gaacgaaaat gtttaaaata ttttcttaac ggctaaaaat aagttgtact 4800

ctaagtccaa tgacccgttg ccagggagaa ccaaagttga gaaatttcta ttaaaaacat 4860

gactcagaag aaaaactgca gaggctagta atggtggaaa tgatatgata ttgttcctaa 4920

ttggttactc ctaagatcac atgttctggg catctttaaa aggaagttat ctggactgaa 4980

gagagtcatt gcaccttcct gaaggttacg gcttctttct caccttgaag aataatccta 5040

gagtgctcac aaaatgtgtg atgcatttgt aggtacctgg aaacttgtct ccagtgaaaa 5100

ctttgatgat tacatgaaag aagtgggtaa ggaaatacat tatgggatag ctggatttac 5160

aagtttttct ctggggaaga gtaatttatg gctgtttttc actctggaag caccagccag 5220

acatgaagta 5230

<210> 4

<211> 8356

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 4

aacatgcttg aagccacaac acaagcctgt aattaaccac tactttttta actgacccat 60

agcctactgg cttactcact ctttccaaaa ccaccatttt gaagtcagac tggatgatcg 120

atcactatga acatgtgttc aatgaatggt atacaaacta atataggggt acctttatgt 180

tgcctctatg taaaataatg taagacctag gaaatataaa acaaatttca tctgagatat 240

tcccagcagt ttgtaggggg agagaatcaa gtgatgcttg cctaaatttc ctgtcagaat 300

ttcatcttag aactcttgac aaaccccaaa atgttggtaa tgatatgcat tcatatagaa 360

actttgtttc aataaaaaaa agagccttgg catgacctct ttcttaccct accacccaca 420

tgctgtgaaa acactccctc tcatcagggc tttgtcccta ctctttatta tccagtgatt 480

gggtatgttt cctcttgaac ttaaaaattt tcagagaaaa taccctcatt tcctccaaaa 540

gaaataaaca caggcaaagg tcagagggat gcattccatg gaagctgtcc attgtagagc 600

aaagtgcaag acagttggcc caaaccaaag agtgccggtc ccatccccat cagcactgag 660

gattagggat tacatccccc attcccacat ttcccagcaa agcaagactc tgtgcactga 720

agaccccttc ccacagctct gaggaaaggg ctttgtatgt gcatttgaat gttatatttg 780

aatatttgtg aacaaaagca tagtcttccc tatgggaatt actttcctaa acagtcgtta 840

ttttctccca tgtaccttgt ttatggagac caggctcctc cagaagaaag agcctcccat 900

acccctccta tagcatttct caatttcttc caccaccctt ccactatctc attgtcattg 960

cttttgctca gccccttgcc atctcttaac tattgccttg taaggagatt tacatctgcc 1020

tactccactc tttataatac accctttcta gtgccgctat atctttgcaa aactcatatt 1080

tgaggtttgt tggttcaaaa ttcataaaca agcatgaaac atgatttcat accctaaatc 1140

catacctcat tccttttgtt cattaataca ttaatccagc aaatatttgg tgaatgagta 1200

aggttctaga aactttaagt tagagatggg atacagttca ggatggagaa gggaggttag 1260

gacagaggga ggactgggaa tgagatgaaa gtgttactca tcttttacac atcgtatgct 1320

aataaaaatg ctaaatatgt aaaaaaaatt taggagagca tcaagaaccg cttgtgcaaa 1380

aaaaaaaata attcatataa gatgcttgta aaagcaaaat atataaaaag attttatatt 1440

gtagtatgtt tttttcccag gatggtaact agaatgagaa attggatcac tgaagaaaga 1500

caaaaatcat gtgttattta ttattacatt tctgcaccat acctagcata gcgccttgga 1560

catagcaaat ttgaaaaaaa aatgtgaaaa tattcgtcat tgggagcttt atgtaatgga 1620

actaggttaa gtctgaattc tcttcattaa aacaaaggga aaatagtctt ttttttttcc 1680

cccctttggc catgcccata gcatgcggta gggttagaga tcaaacctgc actacagcag 1740

tgacaaagct ggattcttaa cacactgata ttccttaaag agtgttgaac acaaggttgc 1800

ataacattaa ttttttttag tgtgatcctc ttcatcatat accactttcc tcacttccaa 1860

tccattggat gctggggtga aagatgatgg ttattaggtc agggaacatt ctaccttatt 1920

tatacagcaa gagaaagtct tagaagttga gatgaagata tattatgcag gaactatttc 1980

tcatattccc agttatactg cagagcagat acagaaaata tgaggtatgg gcttctgatt 2040

taaatttctg gacaaccgat tgtctagaaa gaattctcta ccttacatga tacataactt 2100

agtggacttg tgcatggaaa gaatatcagc actccgcagg attgcctata tgtttggaac 2160

aaaaaaatga gctgctctta aagacaacct ctcttcaagt aagtaattct gttaacctta 2220

ttttgttact ccacataact gataacatga aattccttca tgtaaactca attactttct 2280

cacattttaa ttctttcatt gccaagaccc ttcattgtgg ggttactact attttttttt 2340

aatatgcaat cattacagga gctagtggtt gtttctagaa aatctcaact ctgctgttga 2400

tcaggcaccc aacaatgatc agacactaaa tatgttgaca tatggacatg aagatactag 2460

cctgcagaaa tgttcttgca gtatttttac agaaaattct gctgaattct cactagccta 2520

cctaactagg atttccttta tgaattttat tgaatatttg attacttgat actcatcagt 2580

gaaaaaccta gatgaaagcc ccttccttaa gggactttag attctgatcg ccaagaacat 2640

atatctatac ttttgtcatg gtttacagga atatatatct atacatttgt catcgtttct 2700

attggtggtc ttgtttgagt aaacttctca ttaacaagtt atggaaccag aaactcctgt 2760

tattctcttt gtctggaaca ttcttttctc tggtctttcc atagctgtcg tcttctcatt 2820

actcaagtgt cagaccagtt gtccacctcc tttgactgat cttcttggac tgcaatgtcc 2880

agtggtcatt agctcagatt actctgcttt gttttctata aaacacacac ttaggttggt 2940

ttatttactt atatctttgt atattatttt ctccaatact agactgtaag ctccatgatg 3000

gcaagcaaga gcctgctgtg gcttgcccat gattgaatct ctggtggcta gcaaattgca 3060

tatgattcat gctgaataaa caaatgaacc ttggtgtcat ggtattctaa aagagcactg 3120

cccaatagaa acataacatg agctacatat gtaatctaca attttcttac aggcacacta 3180

agaaataaga aaataaacag gtgaaattaa ttttagtaat atattttatt taacccaata 3240

tttctaaaat gttgttattt caacatataa gcaatgtaag aaaaacataa aaaaattttt 3300

gagaaaaatt tatagctgaa aagatagact cataatcaaa ttcttataca tctatttaaa 3360

agttctgcaa taacttaatc aaggtctttc ttaaatttta gttaaaatta agtgaaatac 3420

atcaacatca tgaatatttt ctcaggtcag tctcccaaag caatagaaat tagagcaaaa 3480

ataaacccat gggacctcat caaactgaaa agcttttgca cagcaaagga aaccaaaaag 3540

aaaaccaaaa gacaacttac agaatgggag aaaatagttt caaatgatgc aaccgacaag 3600

ggcttaatct ctagaatata taagcaactt atacaaccca acagcaaaaa agccaatcaa 3660

tcaatggaaa aatgggcaaa agacctgaat agacatttct ccaaggaaga tatacagatg 3720

gccagcaaaa acatgaaaaa atgctcaaca tcactgatta taagagaaat gcaaatcaaa 3780

actaccatga gataccacct caccccagtc agaatggcca tcattaagaa gtccacaaat 3840

aacaagtgct ggaggggctg tggagaaaaa ggaaccctcc tgcactgttg gtgggaatgt 3900

aaactggtac agccactatg gagaacagtt tggagatacc ttagaaatct atacatagaa 3960

cttccatatg accccgcaat cccactcttg ggcatatatc cagacaaaac tctccttaaa 4020

agagacacat gcacccgcat gttcatagca gcactattca caatagccag gacatggaaa 4080

caacccaaat gtccatcgac agatgattgg attcggaaga tggggtatat atacacaatg 4140

gaatactact aagccataaa aaagaatgcc ataatgccat ttgcagcaac atggatggaa 4200

ctagagaatc tcatactgag tgaaatgagc cagaaagaca aagataaaca ccatatgata 4260

tcacttataa ctggaatcta atatccagca cagatgaaca tctcctcaga aaagaaaatc 4320

atggacttgg agaagagact tgtggctgcc tgatgggagg gggagggagt gggagggatc 4380

gggagcttgg gcttatcaga cacaactgag aatagatttg caggagttcc cgtcgtggcg 4440

cagtggttaa cgaatccgac taggaaccat gaggttgcgg gtttggtccc tgcccttgct 4500

cagtgggtta aggatccggc gttgccgtga gctgtggtgt aggttgcaga cacggctcgg 4560

atcccgtgtt gctgtggctc tggcgtaggc tgatggctac agctccgatt cgacccctag 4620

cctgggaacc tccatatgcc acaggagcgg cccaaagaaa tagcaaagac aaaaaaaaaa 4680

aaaaagaata gatttacaag gagatcctgc tgaatagcat tgagaacttt gtctagatac 4740

tcatgttgca acagaacaaa gggtggggaa aaaaatgtaa ttgtaatgta tacatgtaag 4800

gataacttga tccccttgct gtacagtggg aaaattaaaa aaaaattaaa aaaaaataaa 4860

ataaaagaaa gcataaaaaa attaagtgaa ataaaaattt aatgtctcag ttacactagc 4920

atgtctcaag tatttgagag ccacatgtga ttagaaacta cagtattgaa tagcccatct 4980

ctaaaaaaat gtttaaatag cagtctcaca atacacacat gttcaatgtg atgatcattt 5040

gaaaatctgt ctgaagcagt ttgttattaa aagtaaagaa ccagcatata ttttgaaaaa 5100

taaaccatta tttacagact gtgaaaaaat atttacaaaa accacattgg aaagaagact 5160

gttatccaaa atgtacaaag agctcttcaa actaaaaaat aagaaacaac ataattgaaa 5220

aaatggtcta tggactttaa tggacacctc accaaagagg atatacaggt ggccaagggt 5280

ggccaatatg catatgaaaa gatgttccac attatgtcat caggaaaatg caaactgaaa 5340

caatgagata gcaccagtta aaatggccaa aattacaaca ttgacaacat caagtgctgc 5400

tgaggatgtg aagcaacaga acactcattc atttctactg ggaatgtaaa atagtgctgc 5460

ccatttggaa gccagtgcga tggtttctta cagaactaaa tattctcgta ccccatcatg 5520

cttcttggta tttacccaaa gaaagtaaaa actatctcca cccaaaaacc tgcatgtgga 5580

agttcccact gtggtgcaat gggatgggca gtgctttgga gcactgggat gcaccttcaa 5640

tccctggccc aatacaacgg gttaaggatc tggagttgct acagatgcag attaggctgc 5700

aatggcgggt tggatctgat ccctggctta gggacttcat atgcctaggg gtggccaaaa 5760

aaaccaaaag gacccccaaa caaacaaaca aacaaacaga aaaccctgca tgtggatgtt 5820

tacagcagat ttattgataa tcgctagacc ttggaaacca ccacaatggc cccaatagtt 5880

gaatatatga ataaactgta gtaccttcag acaatggaat attcttcagt gttaaaaacg 5940

aaatgaactc ttaagccatg aagaaacatg gaggaaactt aaatgcatat tactaagtga 6000

aaaaagccaa tctgacaagg ctactacaca ctgtatgctc ccaattatat gaaaaagcag 6060

aactatggag agagtaaaaa tggcagtggt ttgatggggt tgagagcagg agtgtgggag 6120

agagatgaac aggcaaagca cagtggattc ttaaggcagt aaaaatactc tgtatgatgt 6180

tataaggatg cacatatgtc attatacttt tgtccaaata catagagaat acaacatcaa 6240

gagcgaactc taaagtaaaa tatggacttt gggagattgt gatgtgctgg tgtaggttca 6300

tcattaggaa aaaatgcacc attccagtga gtgatgttga taataggaga gactatgctt 6360

gtgtcagggc agggtgtata tgagatatct ctgtacttcc tctcacgttt tttgtaaact 6420

taaaacttct ttaaaaacaa ttgtcttaga acataagcta aaaaccaagc aaacaaaaaa 6480

taaaagccat tattagttta gaacattgtt atccctggat gaagactgat catttttctt 6540

tcctatcttt ctttctttct tttctttttt cccctgcttt tttagggctt ctcctgcagc 6600

atatggaagt tcccaggcta ggggtcaaat cagagccaca gcttggccta caccacagcc 6660

acaacaatgt ggggtccgag ccgtgtctgt gacctacacc ccggctcctg gcaacaccgg 6720

attcttaagc aactgagtga ggccagggat caaacatgag tcctcatggt tactagtcag 6780

gtttgttact gttgaaccgt aatgggaact ccccattttt attttcttgt tcaatgaata 6840

tataataaca aaagcccatg gggaaacgta caccacccac agtctatatc tctaagcaac 6900

agtcctgagt gagcaaacat atgttactgt gccattaaca tatgcaacac ttaaaattac 6960

tattgtaaca tgactttatc aatttttcat agcaacttgc tttcctccag aaaatcctgt 7020

ggtttacaga aggctctgtc tcaaatattt ctgggaagat ttcaggatac tgacaaatca 7080

attctttgat gcagatactg ctcagttgaa tacatggtgt agagattcac cactctgtaa 7140

tattttaatt tgtttttttt ctttcctgaa atttgggtac atttatgtga atatctccca 7200

tcattctggt acagggaagg aagtggggga gggggctgaa atacataatt attttagaaa 7260

agcatcctca ggaatacttc accatgtgag agaaagaaat tagattttga tggcttgtga 7320

ccaaaccact tctgattatt tttaaggaaa gcaacaccat tgagctctgg ataaatttag 7380

agcttatgat atagttcagg aattggatga attttctcag tatgggaagt atgttttgga 7440

ctggggtcta tttttttaag gggtccgtga aaagcaacat catcctctca ttgaggttta 7500

attatcatta ttaattaaat ctactgtcca gatcacagtg gataattgga tttactcttt 7560

ttttttttaa atccatccca aatatttgaa atgagaagct tcggttactt tgaaatgcca 7620

ttactcattt tgttttaatt gccaggtaat tcttaagata aaactgttcc ccaaagcctc 7680

tgcaaataac ttaatattca aggtaattct tacattcctc aattctaacg aaccacacaa 7740

ttgtaatttt aataaagact tcagaaaagg gagtcaaaat ttaccccatg ataataagcc 7800

tgctctactc cacactggga taaatatgta tgaaaataat aggaggaaat tcaatgcgcc 7860

gaacactaaa tggtcagaac gaaaatgttt aaaatatttt cttaacggct aaaaataagt 7920

tgtactctaa gtccaatgac ccgttgccag ggagaaccaa agttgagaaa tttctattaa 7980

aaacatgact cagaagaaaa actgcagagg ctagtaatgg tggaaatgat atgatattgt 8040

tcctaattgg ttactcctaa gatcacatgt tctgggcatc tttaaaagga agttatctgg 8100

actgaagaga gtcattgcac cttcctgaag gttacggctt ctttctcacc ttgaagaata 8160

atcctagagt gctcacaaaa tgtgtgatgc atttgtaggt acctggaaac ttgtctccag 8220

tgaaaacttt gatgattaca tgaaagaagt gggtaaggaa atacattatg ggatagctgg 8280

atttacaagt ttttctctgg ggaagagtaa tttatggctg tttttcactc tggaagcacc 8340

agccagacat gaagta 8356

<210> 5

<211> 9256

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 5

aaattctcat atgccttccc tgctcatttt actcattctt gtgccagagc atcagtcaca 60

aagactggta cttattagac atgcaatgaa tacatagctg actatctgcc tgtaactctg 120

tttatttaat ttaaaactca atatgtggac aatttaaaaa gcatatagaa tctagctggg 180

ctgagactgg caaaagtgag aatatgaaca gaagtttaga agagacagag tgtggtggtc 240

attctttgtg aattgaaaag cattcttata agcataagta gcagttgaca taattactac 300

agcttcaagg gtccagactg gttcttctgc tctatggtat accccaaccc taaaaatttc 360

cccttgattc tgtcacaaac aattttgagg ggttaatcag aatcttttta aaagatgtaa 420

atacttctag taatattatg atattatctg tcatttatat cttaatatga tctaaatcaa 480

tctaatcgat ttcctcctaa ttcaacaatg agctctaaaa ccgctgttac acagggtgcc 540

aagcctgagt atttaagggt gaataaacta taatccctac ccccaaagag ctcacagcca 600

gaagagaaca aacttgggtg tgtgtacgtg tgtttctgtc tgtcctcctg aacattttct 660

tggtgacgtc ttctgattca tttgtacatt cctttctggt tttcctagtt aatattttca 720

tttttgccta gagtcagttc ttcatcatga tgcttgcttt atcaaataaa gacaaagtag 780

ggcacactct acattcagaa agtgctttgc tagctcttta gttggttcct acttaacgcc 840

taccagacta tggatgaaga atgcctttta tgagtaagag ggcaagtgag gaagttatgc 900

aacatgcttg aagccacaac acaagcctgt aattaaccac tactttttta actgacccat 960

agcctactgg cttactcact ctttccaaaa ccaccatttt gaagtcagac tggatgatcg 1020

atcactatga acatgtgttc aatgaatggt atacaaacta atataggggt acctttatgt 1080

tgcctctatg taaaataatg taagacctag gaaatataaa acaaatttca tctgagatat 1140

tcccagcagt ttgtaggggg agagaatcaa gtgatgcttg cctaaatttc ctgtcagaat 1200

ttcatcttag aactcttgac aaaccccaaa atgttggtaa tgatatgcat tcatatagaa 1260

actttgtttc aataaaaaaa agagccttgg catgacctct ttcttaccct accacccaca 1320

tgctgtgaaa acactccctc tcatcagggc tttgtcccta ctctttatta tccagtgatt 1380

gggtatgttt cctcttgaac ttaaaaattt tcagagaaaa taccctcatt tcctccaaaa 1440

gaaataaaca caggcaaagg tcagagggat gcattccatg gaagctgtcc attgtagagc 1500

aaagtgcaag acagttggcc caaaccaaag agtgccggtc ccatccccat cagcactgag 1560

gattagggat tacatccccc attcccacat ttcccagcaa agcaagactc tgtgcactga 1620

agaccccttc ccacagctct gaggaaaggg ctttgtatgt gcatttgaat gttatatttg 1680

aatatttgtg aacaaaagca tagtcttccc tatgggaatt actttcctaa acagtcgtta 1740

ttttctccca tgtaccttgt ttatggagac caggctcctc cagaagaaag agcctcccat 1800

acccctccta tagcatttct caatttcttc caccaccctt ccactatctc attgtcattg 1860

cttttgctca gccccttgcc atctcttaac tattgccttg taaggagatt tacatctgcc 1920

tactccactc tttataatac accctttcta gtgccgctat atctttgcaa aactcatatt 1980

tgaggtttgt tggttcaaaa ttcataaaca agcatgaaac atgatttcat accctaaatc 2040

catacctcat tccttttgtt cattaataca ttaatccagc aaatatttgg tgaatgagta 2100

aggttctaga aactttaagt tagagatggg atacagttca ggatggagaa gggaggttag 2160

gacagaggga ggactgggaa tgagatgaaa gtgttactca tcttttacac atcgtatgct 2220

aataaaaatg ctaaatatgt aaaaaaaatt taggagagca tcaagaaccg cttgtgcaaa 2280

aaaaaaaata attcatataa gatgcttgta aaagcaaaat atataaaaag attttatatt 2340

gtagtatgtt tttttcccag gatggtaact agaatgagaa attggatcac tgaagaaaga 2400

caaaaatcat gtgttattta ttattacatt tctgcaccat acctagcata gcgccttgga 2460

catagcaaat ttgaaaaaaa aatgtgaaaa tattcgtcat tgggagcttt atgtaatgga 2520

actaggttaa gtctgaattc tcttcattaa aacaaaggga aaatagtctt ttttttttcc 2580

cccctttggc catgcccata gcatgcggta gggttagaga tcaaacctgc actacagcag 2640

tgacaaagct ggattcttaa cacactgata ttccttaaag agtgttgaac acaaggttgc 2700

ataacattaa ttttttttag tgtgatcctc ttcatcatat accactttcc tcacttccaa 2760

tccattggat gctggggtga aagatgatgg ttattaggtc agggaacatt ctaccttatt 2820

tatacagcaa gagaaagtct tagaagttga gatgaagata tattatgcag gaactatttc 2880

tcatattccc agttatactg cagagcagat acagaaaata tgaggtatgg gcttctgatt 2940

taaatttctg gacaaccgat tgtctagaaa gaattctcta ccttacatga tacataactt 3000

agtggacttg tgcatggaaa gaatatcagc actccgcagg attgcctata tgtttggaac 3060

aaaaaaatga gctgctctta aagacaacct ctcttcaagt aagtaattct gttaacctta 3120

ttttgttact ccacataact gataacatga aattccttca tgtaaactca attactttct 3180

cacattttaa ttctttcatt gccaagaccc ttcattgtgg ggttactact attttttttt 3240

aatatgcaat cattacagga gctagtggtt gtttctagaa aatctcaact ctgctgttga 3300

tcaggcaccc aacaatgatc agacactaaa tatgttgaca tatggacatg aagatactag 3360

cctgcagaaa tgttcttgca gtatttttac agaaaattct gctgaattct cactagccta 3420

cctaactagg atttccttta tgaattttat tgaatatttg attacttgat actcatcagt 3480

gaaaaaccta gatgaaagcc ccttccttaa gggactttag attctgatcg ccaagaacat 3540

atatctatac ttttgtcatg gtttacagga atatatatct atacatttgt catcgtttct 3600

attggtggtc ttgtttgagt aaacttctca ttaacaagtt atggaaccag aaactcctgt 3660

tattctcttt gtctggaaca ttcttttctc tggtctttcc atagctgtcg tcttctcatt 3720

actcaagtgt cagaccagtt gtccacctcc tttgactgat cttcttggac tgcaatgtcc 3780

agtggtcatt agctcagatt actctgcttt gttttctata aaacacacac ttaggttggt 3840

ttatttactt atatctttgt atattatttt ctccaatact agactgtaag ctccatgatg 3900

gcaagcaaga gcctgctgtg gcttgcccat gattgaatct ctggtggcta gcaaattgca 3960

tatgattcat gctgaataaa caaatgaacc ttggtgtcat ggtattctaa aagagcactg 4020

cccaatagaa acataacatg agctacatat gtaatctaca attttcttac aggcacacta 4080

agaaataaga aaataaacag gtgaaattaa ttttagtaat atattttatt taacccaata 4140

tttctaaaat gttgttattt caacatataa gcaatgtaag aaaaacataa aaaaattttt 4200

gagaaaaatt tatagctgaa aagatagact cataatcaaa ttcttataca tctatttaaa 4260

agttctgcaa taacttaatc aaggtctttc ttaaatttta gttaaaatta agtgaaatac 4320

atcaacatca tgaatatttt ctcaggtcag tctcccaaag caatagaaat tagagcaaaa 4380

ataaacccat gggacctcat caaactgaaa agcttttgca cagcaaagga aaccaaaaag 4440

aaaaccaaaa gacaacttac agaatgggag aaaatagttt caaatgatgc aaccgacaag 4500

ggcttaatct ctagaatata taagcaactt atacaaccca acagcaaaaa agccaatcaa 4560

tcaatggaaa aatgggcaaa agacctgaat agacatttct ccaaggaaga tatacagatg 4620

gccagcaaaa acatgaaaaa atgctcaaca tcactgatta taagagaaat gcaaatcaaa 4680

actaccatga gataccacct caccccagtc agaatggcca tcattaagaa gtccacaaat 4740

aacaagtgct ggaggggctg tggagaaaaa ggaaccctcc tgcactgttg gtgggaatgt 4800

aaactggtac agccactatg gagaacagtt tggagatacc ttagaaatct atacatagaa 4860

cttccatatg accccgcaat cccactcttg ggcatatatc cagacaaaac tctccttaaa 4920

agagacacat gcacccgcat gttcatagca gcactattca caatagccag gacatggaaa 4980

caacccaaat gtccatcgac agatgattgg attcggaaga tggggtatat atacacaatg 5040

gaatactact aagccataaa aaagaatgcc ataatgccat ttgcagcaac atggatggaa 5100

ctagagaatc tcatactgag tgaaatgagc cagaaagaca aagataaaca ccatatgata 5160

tcacttataa ctggaatcta atatccagca cagatgaaca tctcctcaga aaagaaaatc 5220

atggacttgg agaagagact tgtggctgcc tgatgggagg gggagggagt gggagggatc 5280

gggagcttgg gcttatcaga cacaactgag aatagatttg caggagttcc cgtcgtggcg 5340

cagtggttaa cgaatccgac taggaaccat gaggttgcgg gtttggtccc tgcccttgct 5400

cagtgggtta aggatccggc gttgccgtga gctgtggtgt aggttgcaga cacggctcgg 5460

atcccgtgtt gctgtggctc tggcgtaggc tgatggctac agctccgatt cgacccctag 5520

cctgggaacc tccatatgcc acaggagcgg cccaaagaaa tagcaaagac aaaaaaaaaa 5580

aaaaagaata gatttacaag gagatcctgc tgaatagcat tgagaacttt gtctagatac 5640

tcatgttgca acagaacaaa gggtggggaa aaaaatgtaa ttgtaatgta tacatgtaag 5700

gataacttga tccccttgct gtacagtggg aaaattaaaa aaaaattaaa aaaaaataaa 5760

ataaaagaaa gcataaaaaa attaagtgaa ataaaaattt aatgtctcag ttacactagc 5820

atgtctcaag tatttgagag ccacatgtga ttagaaacta cagtattgaa tagcccatct 5880

ctaaaaaaat gtttaaatag cagtctcaca atacacacat gttcaatgtg atgatcattt 5940

gaaaatctgt ctgaagcagt ttgttattaa aagtaaagaa ccagcatata ttttgaaaaa 6000

taaaccatta tttacagact gtgaaaaaat atttacaaaa accacattgg aaagaagact 6060

gttatccaaa atgtacaaag agctcttcaa actaaaaaat aagaaacaac ataattgaaa 6120

aaatggtcta tggactttaa tggacacctc accaaagagg atatacaggt ggccaagggt 6180

ggccaatatg catatgaaaa gatgttccac attatgtcat caggaaaatg caaactgaaa 6240

caatgagata gcaccagtta aaatggccaa aattacaaca ttgacaacat caagtgctgc 6300

tgaggatgtg aagcaacaga acactcattc atttctactg ggaatgtaaa atagtgctgc 6360

ccatttggaa gccagtgcga tggtttctta cagaactaaa tattctcgta ccccatcatg 6420

cttcttggta tttacccaaa gaaagtaaaa actatctcca cccaaaaacc tgcatgtgga 6480

agttcccact gtggtgcaat gggatgggca gtgctttgga gcactgggat gcaccttcaa 6540

tccctggccc aatacaacgg gttaaggatc tggagttgct acagatgcag attaggctgc 6600

aatggcgggt tggatctgat ccctggctta gggacttcat atgcctaggg gtggccaaaa 6660

aaaccaaaag gacccccaaa caaacaaaca aacaaacaga aaaccctgca tgtggatgtt 6720

tacagcagat ttattgataa tcgctagacc ttggaaacca ccacaatggc cccaatagtt 6780

gaatatatga ataaactgta gtaccttcag acaatggaat attcttcagt gttaaaaacg 6840

aaatgaactc ttaagccatg aagaaacatg gaggaaactt aaatgcatat tactaagtga 6900

aaaaagccaa tctgacaagg ctactacaca ctgtatgctc ccaattatat gaaaaagcag 6960

aactatggag agagtaaaaa tggcagtggt ttgatggggt tgagagcagg agtgtgggag 7020

agagatgaac aggcaaagca cagtggattc ttaaggcagt aaaaatactc tgtatgatgt 7080

tataaggatg cacatatgtc attatacttt tgtccaaata catagagaat acaacatcaa 7140

gagcgaactc taaagtaaaa tatggacttt gggagattgt gatgtgctgg tgtaggttca 7200

tcattaggaa aaaatgcacc attccagtga gtgatgttga taataggaga gactatgctt 7260

gtgtcagggc agggtgtata tgagatatct ctgtacttcc tctcacgttt tttgtaaact 7320

taaaacttct ttaaaaacaa ttgtcttaga acataagcta aaaaccaagc aaacaaaaaa 7380

taaaagccat tattagttta gaacattgtt atccctggat gaagactgat catttttctt 7440

tcctatcttt ctttctttct tttctttttt cccctgcttt tttagggctt ctcctgcagc 7500

atatggaagt tcccaggcta ggggtcaaat cagagccaca gcttggccta caccacagcc 7560

acaacaatgt ggggtccgag ccgtgtctgt gacctacacc ccggctcctg gcaacaccgg 7620

attcttaagc aactgagtga ggccagggat caaacatgag tcctcatggt tactagtcag 7680

gtttgttact gttgaaccgt aatgggaact ccccattttt attttcttgt tcaatgaata 7740

tataataaca aaagcccatg gggaaacgta caccacccac agtctatatc tctaagcaac 7800

agtcctgagt gagcaaacat atgttactgt gccattaaca tatgcaacac ttaaaattac 7860

tattgtaaca tgactttatc aatttttcat agcaacttgc tttcctccag aaaatcctgt 7920

ggtttacaga aggctctgtc tcaaatattt ctgggaagat ttcaggatac tgacaaatca 7980

attctttgat gcagatactg ctcagttgaa tacatggtgt agagattcac cactctgtaa 8040

tattttaatt tgtttttttt ctttcctgaa atttgggtac atttatgtga atatctccca 8100

tcattctggt acagggaagg aagtggggga gggggctgaa atacataatt attttagaaa 8160

agcatcctca ggaatacttc accatgtgag agaaagaaat tagattttga tggcttgtga 8220

ccaaaccact tctgattatt tttaaggaaa gcaacaccat tgagctctgg ataaatttag 8280

agcttatgat atagttcagg aattggatga attttctcag tatgggaagt atgttttgga 8340

ctggggtcta tttttttaag gggtccgtga aaagcaacat catcctctca ttgaggttta 8400

attatcatta ttaattaaat ctactgtcca gatcacagtg gataattgga tttactcttt 8460

ttttttttaa atccatccca aatatttgaa atgagaagct tcggttactt tgaaatgcca 8520

ttactcattt tgttttaatt gccaggtaat tcttaagata aaactgttcc ccaaagcctc 8580

tgcaaataac ttaatattca aggtaattct tacattcctc aattctaacg aaccacacaa 8640

ttgtaatttt aataaagact tcagaaaagg gagtcaaaat ttaccccatg ataataagcc 8700

tgctctactc cacactggga taaatatgta tgaaaataat aggaggaaat tcaatgcgcc 8760

gaacactaaa tggtcagaac gaaaatgttt aaaatatttt cttaacggct aaaaataagt 8820

tgtactctaa gtccaatgac ccgttgccag ggagaaccaa agttgagaaa tttctattaa 8880

aaacatgact cagaagaaaa actgcagagg ctagtaatgg tggaaatgat atgatattgt 8940

tcctaattgg ttactcctaa gatcacatgt tctgggcatc tttaaaagga agttatctgg 9000

actgaagaga gtcattgcac cttcctgaag gttacggctt ctttctcacc ttgaagaata 9060

atcctagagt gctcacaaaa tgtgtgatgc atttgtaggt acctggaaac ttgtctccag 9120

tgaaaacttt gatgattaca tgaaagaagt gggtaaggaa atacattatg ggatagctgg 9180

atttacaagt ttttctctgg ggaagagtaa tttatggctg tttttcactc tggaagcacc 9240

agccagacat gaagta 9256

<210> 6

<211> 1065

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 6

atggagtcgg ccgacttcta cgaggcggag ccgcggcccc cgatgagcag ccacctccag 60

agccccccgc acgcgcccag cagcgccgcc ttcggctttc cccggggcgc gggccccgcg 120

cagcccccag ccccacctgc cgccccggag ccgctgggcg gcatctgcga acacgagacg 180

tccatcgaca tcagcgccta catcgacccg gccgccttca acgacgagtt cctggccgac 240

ctgtttcagc acagccggca gcaagagaag gccaaggcgg ccgcggcccc cgcgggaggc 300

ggcggcgact ttgactaccc gggcgccccc gtgggccccg gcggcgccgt catgcccggg 360

ggggctcacg gcccccctcc cagctacggc tgcgcggcgg ccggctacct ggacggcagg 420

ctggagcccc tgtacgagcg cgtcggggcg ccggcgctgc ggccgctagt gatcaagcag 480

gagccgcgcg aggaggacga gtcgaagcag ctggcgctgg ccggcctctt tccctaccag 540

ccaccgccgc caccgccacc accgcattca caccctccgc ccgcacacct ggccgccccg 600

cacttgcagt tccagatcgc gcactgcggc cagaccacca tgcacctgca gcccggccac 660

cccacgccgc cgcccacgcc cgtgcccagc ccgcacccag cgcccgcgct tggcgccgct 720

ggcctgccag gccccggcgg cgctctcaag gggctggccc cagcgcaccc cgacctgcgc 780

gcgggcggcg gcggcggcgc aggcaaagcc aagaagtcgg tagacaagaa cagcaacgag 840

taccgggtgc ggcgtgagcg caacaacatc gcggtgcgca agagccggga caaggccaag 900

cagcgcaacg tggagactca acagaaggtg ctggagctga ccagtgacaa tgaccgcctg 960

cgcaagcggg tggaacaact gagccgcgaa ctggacacgc tgcggggcat cttccgccag 1020

ctgcccgaga gctccctggt caaggccatg ggcaactgcg cttga 1065

<210> 7

<211> 1041

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 7

atgcaacgcc tggtggcctg ggacccagca tgtctccccc tgccgccgcc gcctgccttt 60

aaatccatgg aagtggccaa cttctactac gaggcggact gcttggctgc tgcgtacggc 120

ggcaaggcgg cccccgcggc gccccccgcg gccagacccg ggccgcgccc ccccgccggc 180

gagctgggta gcatcggtga ccacgagcgc gccatcgact tcagcccata cctggagccg 240

ctgggcgcgc cgcaggcccc ggcgccggcc acggccaccg acaccttcga ggcggctccg 300

cccgcgcccg cccccgcgcc cgcctcctcc gggcagcacc acgacttcct ctccgatctc 360

ttctccgacg actacggggg caagaactgc aagaaggcgg ccgaatacgg ctacgtgagc 420

ctggggcgtc tgggggccgc caagaacgcg ctgcacccgg gctgcttcgc gcccctacac 480

ccgccgcccc cgccgccgcc gccgcagccg gccgagctca aggcggagcc gggcttcgag 540

cccgcggact gcaagcggaa ggaggaggcc ggagcgccgg gcggcggcgc cgcaggcatg 600

gcggctggct tcccgtatgc gctgcgcgcc tacctcggct accaggcggt gccgagcggc 660

agcagcggga gcctgtccac atcctcgtcg tccagcccgc ccggcacgcc gagccccgcc 720

gacgccaagg cgcccccagc cgcctgctac gcgggggcgg cgccggcgcc ctcgcaggtc 780

aagagtaaga ccaagaagac cgtggataag cacagcgacg agtacaagat ccggcgtgag 840

cgcaacaaca tcgcggtgcg caagagccgc gacaaggcca agatgcgcaa cctggagacg 900

cagcataagg tcctggagct cacggccgag aacgagcggc tccagaagaa ggtggagcag 960

ctgtcgcgcg agctcagcac cctgcggaac ttgttcaagc agctgcccga gcccctgctc 1020

gcctcctccg gccactgcta g 1041

<210> 8

<211> 1533

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 8

atggctgtca gcgacgcact gctcccgtcc ttctccacgt tcgcgtccgg cccggcggga 60

agggagaaga cactgcgtcc agcaggtgcc ccgaataacc gctggcggga ggagctctcc 120

cacatgaagc aaagacttcc cccggtgctt cccggccgcc cctacgacct ggcggcggcg 180

accgtggcca ccgacctgga gagtggcgga gtcggcgcgg cttgcggcag tagcaacccg 240

gctcttctac cccggaggga gacggaggag ttcaatgatc tcctggacct ggactttatc 300

ctctccaact cactgtctca tcaggagtca gtggccgcca ccgtgtcctc gtcggcttca 360

gcctcatcct cttcctcccc atcgagcagc ggtcccgcca gtgcgccctc cacctgcagc 420

ttcagctatc cgatccgggc tgggggcgac ccgggcgtgg caccgggcag cactggaggc 480

agcctcctct atggccggga gtctgcacct cccccgacag ctcccttcaa cctggcagac 540

atcaacgatg tgagcccctc gggcggcttc gtggccgaac tcctgcggcc tgaattggac 600

ccagtgtaca ttccgccgca gcagtcgcag ccgccaggtg gcgggctgat gggcaagttt 660

gtgttgaagg catcgctgag tgcccccggc agcgagtacg gcagcccatc ggtcatcagt 720

gttagcaaag gcagcccaga tgggagccac ccggtggtgg tggcgcccta cagcggtggc 780

ccgccgcgca tgtgccccaa gatcaagcag gaggctgtct cctcgtgcac cgtcggccgg 840

cccttagagg cccacttggg cactggaccc cctctcagca atggccaccg gccgcctgcc 900

cacgactttc ccctggggcg gcagctcccc agcaggacta ccccaaccct gggtgcggag 960

gaactgctaa gcagcaggga ctgtcatcct gccctgccgc tccccccggg cttccatccc 1020

caccatgggc caaactaccc acccttcctg ccggatcagc tgcagccgca ggtcccaccg 1080

ctccattacc aaggtcagtc ccggggaatc gtagttgggg ctggggagcc ctgcatctgc 1140

cggccctctg gggcccacgg aatggtgttg accccacctt cttcacccct agagctcatg 1200

ccacctggtt cctgcatgcc agaggagcca aagccaaaga gggggagaag gtcgtggccc 1260

cggaaaagga cggccactca cacttgtgat tacgcgggct gcggcaaaac ctacacgaag 1320

agttctcatc tcaaggcaca cctgcgaacc cacacaggtg agaaacctta ccactgtgac 1380

tgggatggct gtgggtggaa atttgcccgc tcagatgaac tgaccaggca ctaccgcaaa 1440

catactgggc accgcccctt ccagtgccag aagtgcgacc gggcattttc aaggtcggac 1500

caccttgcct tacacatgaa gaggcatttt taa 1533

<210> 9

<211> 1239

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 9

atggtggacc acttgcttcc agtggacgag agcttctcgt cgccgaaatg cccggttggt 60

tatctgggtg acaggctggc cagcgggcgg tcataccaca tgctgccctc gcccctctca 120

gaggacgaca gcgacgcctc cagcctctgc tcctgtgcca gccctgactc gcaagccctt 180

tgctcctgct acagcggtgg ctcaggtgct gaggggcagg acagcatctt ggacttcctg 240

ctgtcccagg ccacgctggg cggtggcggt ggctgtggca gcatcggggc taacggtggc 300

cccgtggcct gggggacctg gcgaaaaaca ccagctcctg tgaaggggga gcatttctgc 360

ctccccgagt ttcctgcggg cgaccctgat gatgtcccaa ggcccttcca gcccaccctg 420

gaggaaatcg aagagttttt ggaggaaaac atggagccag gggtgaaaga ggccccagaa 480

agccacagca aggacttgga gacctgcggc cagctctcca ccgggccaca caggagccac 540

ctccatcctg ggtccggtgg gagagagcgc ggtgccgcat tgtcgggcgc cagtgcaggc 600

agcagccagg gcaccggtgg gggtcccacg ccagacggcc ccatccccgt gctgctgcag 660

atccagccca tgcaggtgaa gcgggaatgt ggtgcagagc ccgcctcgcc tgggcaggcc 720

ccagagagcg ttaaggtggc ccagctcctg gtcaacatcc aggggcagac cttcacgctc 780

gtgccccagg tggtgccctc ctccagcttg aacctgccct ccaagttcgt gcgcattgcc 840

cctgtgccca tcgccgccaa gcccattggg tccggacccc tggggcctgg ctccaccagc 900

ctcctcatgg gccagaagtt ccccaagaac ccggcggcag aactcatcaa aatgcacaag 960

tgtactttcc ccggctgcag caagatgtac accaaaagca gccacctcaa ggcccacctg 1020

cgccggcaca cgggcgagaa gccgttcgcc tgcacctggc cgggctgcgg ctggaggttc 1080

tcgcgctcgg atgagctgtc ccggcaccgg cgctcgcact cgggcgtgaa gccctaccag 1140

tgccccgtgt gcgagaagaa gttcgcgcgc agcgaccacc tctccaagca cgtcaaggtg 1200

caccgcttcc cgcgcagcag ccgcgctgcg cgcccctga 1239

<210> 10

<211> 1515

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 10

atgggtgaaa ctctgggaga ttctcttatt gacccagaaa gcgatgcctt cgacacgctg 60

tctgcaaaca tttcacaaga ggtgaccatg gttgacaccg agatgccgtt ttggcccacc 120

aactttggga tcagctctgt ggacctgtcg gtgatggacg accactccca ctcctttgac 180

atcaagccct tcaccactgt tgatttctcc agcatttcca ctccacacta tgaagacatc 240

ccattcccga gagctgatcc aatggttgca gattataagt acgacctgaa gctccaggac 300

taccaaagtg ccatcaaagt ggagcctgtg tccccgcctt attattctga aaagactcag 360

ctgtacaaca aacctcacga agagccttcc aactccctca tggcaattga atgccgtgtc 420

tgtggggata aagcctcggg gttccactat ggagttcatg cttgtgaagg atgcaagggt 480

ttcttccgga ggactatcag attgaagctt atttatgata ggtgcgatct taactgtcgg 540

atccacaaaa aaagtagaaa taaatgtcag tactgtcggt ttcagaaatg ccttgctgtg 600

gggatgtctc ataacgccat caggtttggg cggatgccac aggctgagaa ggagaagctg 660

ttggcagaga tctccagtga tatcgaccag ctgaacccag agtctgctga cctccgcgcc 720

ctggcaaagc acttgtatga ctcatacata aagtccttcc cgctgaccaa agcaaaggcg 780

agggcgatct tgacaggaaa gaccacagac aaatcaccct ttgtcatcta tgacatgaat 840

tccttaatga tgggagaaga taaaatcaag ttcaaacaca tcacccccct gcaggagcag 900

agcaaagagg tggccattcg catctttcag gggtgtcagt ttcgctccgt ggaggccgtg 960

caggagatca cagagtatgc caagaacatc cctgggtttg taaaccttga cctgaatgac 1020

caagtaactc tcctaaagta tggcgtccac gagatcattt acaccatgct ggcctccttg 1080

atgaataaag acggggtcct catctccgag ggccaaggat tcatgacaag ggagtttctc 1140

aagagcctga gaaagccctt tggtgacttt atggagccca agttcgagtt tgctgtgaag 1200

ttcaacgcac tggaattaga tgacagcgac ctggcgatat ttatagctgt cattattctc 1260

agtggagacc gcccaggttt gctgaatgtg aagcccatcg aggacattca agacaatttg 1320

ctgcaagcct tggagctgca gctcaagttg aaccacccag agtcctccca gctctttgct 1380

aagctgctcc agaaaatgac agacctcaga cagattgtga cagagcacgt gcagctgctg 1440

caagtaataa agaagacaga gacggacatg agccttcacc cactcctaca ggaaatatac 1500

aaggacttgt actag 1515

Claims (10)

1.特异DNA分子，包括区段A；所述区段A的核苷酸序列如序列表中序列2自5’末端起第2044至3090位所示。

2.如权利要求1所述的特异DNA分子，其特征在于：所述特异DNA分子还包括区段B；所述区段B位于所述区段A的上游；

所述区段B的核苷酸序列如序列表中序列2自5’末端起第1至2043位所示。

3.如权利要求1或2所述的特异DNA分子，其特征在于：所述特异DNA分子为b1)或b2)或b3)或b4)所示的DNA分子：

b1)核苷酸序列为序列表中序列2自5’末端起第2044至3090位所示的DNA分子；

b2)核苷酸序列为序列表中序列2所示的DNA分子；

b3)与b1)或b2)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性且具有启动子功能的DNA分子；

b4)与b1)或b2)限定的核苷酸序列杂交且具有启动子功能的DNA分子。

4.含有权利要求1至3任一所述特异DNA分子的表达盒。

5.含有权利要求1至3任一所述特异DNA分子的重组质粒。

6.含有权利要求1至3任一所述特异DNA分子的转基因动物细胞系。

7.A1)或A2)：

A1)权利要求1至3任一所述特异DNA分子作为启动子或脂肪组织特异性启动子的应用；

A2)权利要求1至3任一所述特异DNA分子、或、权利要求4所述表达盒、或、权利要求5所述重组质粒在启动目的基因的表达中的应用。

8.转录因子c/EBPα和/或编码转录因子c/EBPα的基因在提高权利要求1至3任一所述特异DNA分子作为启动子或脂肪组织特异性启动子转录活性中的应用。

9.转录因子KLF4和/或转录因子c/EBPβ和/或编码转录因子KLF4的基因和/或编码转录因子c/EBPβ的基因在降低权利要求1至3任一所述特异DNA分子作为启动子或脂肪组织特异性启动子转录活性中的应用。

10.表达目的基因的方法，为方法A、方法B、方法C或方法D；

所述方法A为以权利要求1至3任一所述特异DNA分子作为启动子或脂肪组织特异性启动子来启动目的基因的表达；

所述方法B包括如下步骤：将权利要求1至3任一所述特异DNA分子插入到任何目的基因或增强子的上游，以此来启动目的基因的表达；

所述方法C包括如下步骤：将目的基因插入权利要求4所述表达盒中的所述特异DNA分子的下游，由所述特异DNA分子启动所述目的基因的表达；

所述方法D包括如下步骤：将目的基因插入权利要求5所述重组质粒中的所述特异DNA分子的下游，由所述特异DNA分子启动所述目的基因的表达。