CN109321483A

CN109321483A - 一种环保用复合微生物菌剂的液体高密度发酵方法

Info

Publication number: CN109321483A
Application number: CN201710642519.3A
Authority: CN
Inventors: 王云; 张保安; 黄来云; 罗仕宽; 吕鸿运; 刘树立
Original assignee: Guangdong Zhongwei Environmental Protection Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Guangdong Zhongwei Environmental Protection Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2017-07-31
Filing date: 2017-07-31
Publication date: 2019-02-12
Anticipated expiration: 2037-07-31
Also published as: CN109321483B

Abstract

本发明涉及生物发酵技术领域，具体涉及一种环保用复合微生物菌剂的液体高密度发酵方法，包括下列步骤：步骤A：将含有培养基的摇瓶中接种环保用复合微生物菌种，在培养箱中震荡培养得一级种子液，并控制转速50~300rpm；步骤B：将步骤A得到的一级种子液转接于一级种子罐中，控制一级种子罐内温度、罐压和溶解氧，培养得二级种子液；步骤C：将步骤B得到的二级种子液转接于发酵罐中，控制发酵罐内温度、罐压和溶解氧并保持在梯度酸碱度下进行分段发酵即得。本发明制得的微生物菌剂菌浓(OD₆₀₀)可达160，微生物含量达2.1×10¹³CFU/mL，生产周期短，成本低，菌剂质量好，生产效果高，可实现自动化与连续化生产。

Description

一种环保用复合微生物菌剂的液体高密度发酵方法

技术领域

本发明涉及生物发酵技术领域，具体涉及一种环保用复合微生物菌剂的液体高密度发酵方法。

背景技术

随着我国环境保护事业不断发展，环保用微生物菌剂在水、大气、土壤、固体废物污染的检测、处理和修复中发挥着非常重要的作用。我国是世界上环境污染最严重的国家之一，国内环保微生物菌剂的使用量呈逐年扩大趋势。

微生物对单一污染物质的降解比较容易，但现实工程中的废水、废气、废渣污染物往往种类多、成分复杂，需要功能配合齐全的复合微生物才能彻底降解。

目前复合微生物菌剂的生产往往采用单菌发酵，然后进行复配的方式制得，该方法大大增加了生产工作量。且目前传统微生物菌剂产品普遍采用固体发酵方式，具有很大的生产局限性，往往表现为：机械化程度低，难以实现过程控制；发酵周期长，产量低；条件限制，不适合大规模生产；由于灭菌不彻底，经常有杂菌污染，从而影响产品功效，使功效不稳定或不明显，甚至无效。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术中的上述不足，提供一种环保用复合微生物菌剂的液体高密度发酵方法，使用多种微生物一起进行液体高密度发酵，并控制梯度酸碱度培养，大大缩短生产周期，降低生产成本，提高了菌剂质量和生产效率，可实现全过程大规模的自动化和连续化生产。

本发明的目的通过以下技术方案实现：

一种环保用复合微生物菌剂的液体高密度发酵方法，包括下列步骤：

步骤A：将含有培养基的摇瓶中接种环保用复合微生物菌种，在温度15~39℃培养箱中震荡培养10~24小时得一级种子液，并控制转速50~300rpm；

步骤B：将步骤A得到的一级种子液按体积含量为0.5~20%的接种量转接于一级种子罐中，控制一级种子罐内温度15~39℃，罐压0.02~0.08MPa，溶解氧5~65%，培养10~24小时得二级种子液；

步骤C：将步骤B得到的二级种子液按体积含量为5~25%的接种量转接于发酵罐中，控制发酵罐内温度15~39℃，罐压0.02~0.08MPa，溶解氧5~65%，并保持在梯度酸碱度下进行分段发酵即得；

其中，所述步骤C中梯度酸碱度依次为7.4~7.8、6.8~7.2、6.2~6.6和5.2~5.8，每段的发酵时间为5~12.5小时。

其中，所述步骤C还包括增加体积含量为2~10%的碳源和/或体积含量为0.5~2%的氮源，碳源的质量浓度为40~60%，氮源的质量浓度为10~20%。发酵过程中根据pH和溶解氧变化，流加碳源和/或氮源；当发酵过程pH、溶解氧骤然上升，说明碳源不足，流加碳源；当发酵过程pH骤然下降、溶解氧骤然上升，说明氮源不足，流加氮源。

其中，所述步骤A中的培养基包括下列成份：葡萄糖1.5~3%，硫酸铵0.2~0.8%，有机氮源0.5~1.5%，磷酸二氢钠0.4~2.5%，乙酸钠0.1~0.3%，七水硫酸镁0.5~1.6%，微量元素0.1~2%。

其中，所述微量元素包括无水氯化钙0.03~0.05%，七水硫酸亚铁0.02~0.04%，七水硫酸锌0.01~0.02%，五水硫酸锰0.005~0.02%，五水硫酸铜0.0001~0.0008%，硼酸0.0001~0.0005%。

其中，所述有机氮源为玉米浆、玉米浆干粉和酵母粉中的一种或二种以上的混合物。

其中，所述环保用复合菌种由一类菌种、二类菌种和三类菌种按质量比1~2:0.1~3:1~5组成。

其中，所述一类菌种为产碱菌、节杆菌、黄杆菌、假单胞菌中一种或两种以上；所述二类菌种为伯克氏菌、短杆菌、假诺卡氏菌、黄单胞菌、芽孢杆菌、棒杆菌、红球菌、鞘氨醇单胞菌、戈登氏菌中一种或两种以上；所述三类菌种为生丝微菌、乳酸杆菌、冢村氏菌中一种或两种以上。

在实际废水、废气处理工程中，pH往往波动比较大。该混合菌剂中含有能适应较宽pH范围的微生物，这些微生物在废水、废气处理过程中是一种协同生长，协同处理作用，但不同的微生物具有不同的最适pH生长范围。在混合菌剂的高密度发酵过程中，如果仅仅采用一种pH进行发酵，则会造成最适生长pH不在该范围的微生物繁殖量减少，甚至不繁殖，从而导致有效微生物种类含量失衡，打破复合微生物的协同生长、协同处理作用，降低复合微生物对废水、废气的处理效率。复合微生物采用酸碱梯度控制培养方法，当发酵过程控制某一pH时，最适生长pH在该范围的微生物即大量繁殖，酸碱梯度控制培养可以保证各种类微生物含量均衡。

其中，所述碳源为葡萄糖、蔗糖、糖蜜、果糖、麦芽糖或阿拉伯糖中的一种或两种以上的混合物。

其中，所述氮源为氯化铵、硫酸铵、玉米浆、玉米浆干粉、酵母粉中的一种或两种以上混合物。

其中，所述步骤C中调整分段发酵的酸碱度使用的酸为磷酸、硫酸、盐酸、乙酸和硝酸中的一种或二种以上混合物，所述步骤C中调整分段发酵的酸碱度使用的碱为氢氧化钠、氢氧化钾、氨水和尿素中的一种或二种以上混合物。

本发明的有益效果：一、本发明的重点是对发酵条件进行了研究改进，发酵时所用的酸碱度、温度、压力和时间是本发明人通过大量实验设计和数据分析优先得到的，使用多种微生物一起进行液体高密度发酵，并控制梯度酸碱度培养，使多种微生物之间配比均衡，而且逐渐发酵增加的浓度不会对微生物产生抑制作用，提高了菌剂质量和生产效率；二、本发明的针对性地对多种微生物在不同梯度酸碱度下进行分段发酵，均衡复合微生物中各种类微生物含量，而且能快速发酵，使菌体浓度不少于10¹² CFU/mL；三、使用本发明的发酵方法可使菌体浓度(OD₆₀₀)可达160，菌体湿重达350g/L，微生物含量达2.1×10¹³CFU/mL。

附图说明

利用附图对发明作进一步说明，但附图中的实施例不构成对本发明的任何限制，对于本领域的普通技术人员，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据以下附图获得其它的附图。

图1是实施例1环保用复合微生物菌剂进行液体高密度发酵方法的生长曲线；

图2是实施例2环保用复合微生物菌剂进行液体高密度发酵方法的生长曲线；

图3是实施例3环保用复合微生物菌剂进行液体高密度发酵方法的生长曲线；

图4是实施例4环保用复合微生物菌剂进行液体高密度发酵方法的生长曲线；

图5是实施例5环保用复合微生物菌剂进行液体高密度发酵方法的生长曲线；

图6是实施例6环保用复合微生物菌剂进行液体高密度发酵方法的生长曲线；

图7是传统分批发酵方法制得的生长曲线。

具体实施方式

结合以下实施例及附图对本发明作进一步描述。

实施例1

步骤A：将含有培养基的摇瓶中接种环保用复合微生物菌种，在15℃培养箱中震荡培养12小时得一级种子液，并控制转速50rpm；

步骤B：将步骤A得到的一级种子液按体积含量为1.5%的接种量转接于一级种子罐中，控制一级种子罐内温度30℃，罐压0.06MPa，溶解氧10%，培养12小时得二级种子液；

步骤C：将步骤B得到的二级种子液按体积含量为15%的接种量转接于发酵罐中，控制发酵罐内温度30℃，罐压0.04MPa，通过调节搅拌桨转速和通气量控制罐内溶解氧7%，并保持在梯度酸碱度下进行分段发酵即得；

其中，所述步骤C中梯度酸碱度依次为7.6、7.0、6.5和5.6，每段的发酵时间为12.5小时。

本实施例的步骤C还包括增加体积含量为2%的碳源和体积含量为0.8%的氮源，碳源的质量浓度为40%，氮源的质量浓度为15%。通过调节搅拌桨转速和通气量控制种子罐中溶解氧7%，发酵过程中流加酸和碱调节发酵过程使各功能微生物含量不少于10⁸CFU/mL。

如图1所示，发酵时间达到6小时，菌体浓度开始有增加，并呈现一定增长速率增加，最终在50小时终止发酵，发酵液体菌浓(OD₆₀₀)为79，菌体湿重193g/L，微生物含量达7.8×10¹²CFU/mL。如图7所示，按传统的高密度发酵方法，菌体发酵速率不稳定，而且最终的发酵的菌浓(OD₆₀₀)仅可达22.01，远远小于本发明高密度发酵的菌浓，不能满足实现生产需要。

本实施例的培养基：葡萄糖1.5%，硫酸铵0.5%，玉米浆干粉1.5%，磷酸二氢钠0.8%，乙酸钠0.2%，七水硫酸镁0.9%，微量元素0.1%；

本实施例的微量元素：无水氯化钙0.03%，七水硫酸亚铁0.02%，七水硫酸锌0.02%，五水硫酸锰0.005%，五水硫酸铜0.0001%，硼酸0.0001%。

本实施例的碳源为葡萄糖、蔗糖、糖蜜和果糖按质量比1:2:3:1.2混合的混合物。

本实施例的氮源为氯化铵和玉米浆按质量比0.5:1.3混合的混合物。

本实施例的所述步骤C中调整分段发酵的酸碱度使用的酸为磷酸，所述步骤C中调整分段发酵的酸碱度使用的碱为氢氧化钠。

本实施例的所述环保用复合微生物菌种由一类菌种、二类菌种和三类菌种按质量比1:0.5:2组成。所述一类菌种为产碱菌和节杆菌按质量比1:0.5组成的混合物，所述二类菌种为伯克氏菌、假诺卡氏菌、黄单胞菌、棒杆菌、红球菌、鞘氨醇单胞菌和戈登氏菌按质量比0.5:1.5:2.5:7:0.1:4:2组成的混合物，所述三类菌种为生丝微菌、乳酸杆菌和冢村氏菌按质量比4:3:5组成的混合物。

实施例2

步骤A：将含有培养基的摇瓶中接种环保用复合微生物菌种，在温度20℃培养箱中震荡培养22小时得一级种子液，并控制转速120rpm；

步骤B：将步骤A得到的一级种子液按体积含量为15%的接种量转接于一级种子罐中，控制一级种子罐内温度37℃，罐压0.08MPa，溶解氧60%，培养22小时得二级种子液；

步骤C：将步骤B得到的二级种子液按体积含量为25%的接种量转接于发酵罐中，控制发酵罐内温度15℃，罐压0.07MPa，通过调节搅拌桨转速和通气量控制罐内溶解氧60%并保持在梯度酸碱度下进行分段发酵即得；

其中，所述步骤C中梯度酸碱度依次为7.6、7.0、6.5和5.6，每段的发酵时间为10.5小时。

本实施例的步骤C还包括增加体积含量为8%的碳源和体积含量为1.5%的氮源，碳源的质量浓度为50%，氮源的质量浓度为16%。通过调节搅拌桨转速和通气量控制种子罐中溶解氧60%，发酵过程中流加酸和碱调节发酵过程使各功能微生物含量不少于10⁸CFU/mL。

如图2所示，开始发酵时的菌体浓度较大，刚开始菌体就呈现一定增长速率增加，最终在42小时终止发酵，发酵液体菌浓(OD₆₀₀)91，菌体湿重220g/L，微生物含量达9.51×10¹²CFU/mL。

本实施例的培养基：葡萄糖1.5%，硫酸铵0.5%，玉米浆干粉1.5%，磷酸二氢钠0.4%，乙酸钠0.3%，七水硫酸镁1.0%，微量元素1.5%；

本实施例的微量元素：无水氯化钙0.04%，七水硫酸亚铁0.03%，七水硫酸锌0.02%，五水硫酸锰0.015%，五水硫酸铜0.0006%，硼酸0.0003%。

本实施例的碳源为葡萄糖、麦芽糖和阿拉伯糖按质量分数比为2:4:3的混合物。

本实施例的氮源为硫酸铵、玉米浆、玉米浆干粉和酵母粉按质量分数比为1:2:0.4:1.2的混合物。

本实施例的步骤C中调整分段发酵的酸碱度使用的酸为盐酸、乙酸和硝酸的混合物按质量分数比为1:2:3的混合物，步骤C中调整分段发酵的酸碱度使用的碱为氢氧化钠、氨水和尿素按质量分数比为0.5:2:1.5的混合物。

本实施例的环保用复合菌种由一类菌种、二类菌种和三类菌种按质量比1:3:4组成。本实施例的一类菌种为产碱菌、节杆菌、黄杆菌和假单胞菌按质量比0.1:2:5:4组成的混合物；所述二类菌种为伯克氏菌、假诺卡氏菌、芽孢杆菌、棒杆菌、红球菌、鞘氨醇单胞菌、戈登氏菌按质量比2:4:1:3:6:0.1:1组成的混合物；所述三类菌种为生丝微菌、乳酸杆菌和冢村氏菌按质量比2:3:4组成的混合物。

实施例3

步骤A：将含有培养基的摇瓶中接种环保用复合微生物菌种，在温度28℃培养箱中震荡培养16小时得一级种子液，并控制转速250rpm；

步骤B：将步骤A得到的一级种子液按体积含量为18%的接种量转接于一级种子罐中，控制一级种子罐内温度15℃，罐压0.04MPa，溶解氧35%，培养15小时得二级种子液；

步骤C：将步骤B得到的二级种子液按体积含量为20%的接种量转接于发酵罐中，控制发酵罐内温度36℃，罐压0.06MPa，通过调节搅拌桨转速和通气量控制罐内溶解氧60%，并保持在梯度酸碱度下进行分段发酵即得；

其中，所述步骤C中梯度酸碱度依次为7.4、7.1、6.4和5.4，每段的发酵时间为8小时。

本实施例的步骤C还包括增加体积含量为8%的碳源和体积含量为1.6%的氮源，碳源的质量浓度为50%，氮源的质量浓度为18%。通过调节搅拌桨转速和通气量控制种子罐中溶解氧60%，发酵过程中流加酸和碱调节发酵过程使各功能微生物含量不少于10⁸CFU/mL。

如图3所示，开始发酵时的菌体浓度较小，前12个小时菌体以相对更小的速率增加，随后12个小时菌体以较大的速率增加，并最终在32小时时发酵终止，发酵液体菌浓(OD₆₀₀)110，菌体湿重270g/L，微生物含量达1.10×10¹³CFU/mL。

本实施例的培养基：葡萄糖2%，硫酸铵0.5%，玉米浆1.2%，磷酸二氢钠1.0%，乙酸钠0.15%，七水硫酸镁1.6%，微量元素1.5%；

本实施例的微量元素：无水氯化钙0.04%，七水硫酸亚铁0.03%，七水硫酸锌0.01%，五水硫酸锰0.015%，五水硫酸铜0.0006%，硼酸0.0004%。

本实施例的碳源为葡萄糖。

本实施例的氮源为氯化铵和硫酸铵按质量比1:0.4比例的混合物。

本实施例的所述步骤C中调整分段发酵的酸碱度使用的酸为硫酸和盐酸按质量分数比1:1的混合物，所述步骤C中调整分段发酵的酸碱度使用的碱为氢氧化钠、氢氧化钾按质量分数比为1:0.2的混合物。

本实施例的所述环保用复合菌种由一类菌种、二类菌种和三类菌种按质量比2:3:0.4组成。所述一类菌种为产碱菌、节杆菌、黄杆菌、假单胞菌按质量比2:1:1:2组成的混合菌种；所述二类菌种为伯克氏菌、短杆菌、假诺卡氏菌、黄单胞菌、芽孢杆菌、棒杆菌、戈登氏菌按2:3:2:1:1.5:0.5:1组成的混合菌种；所述三类菌种为生丝微菌、乳酸杆菌、冢村氏菌按质量比0.5:1:4组成的混合菌种。

实施例4

步骤A：将含有培养基的摇瓶中接种环保用复合微生物菌种，在温度39℃培养箱中震荡培养22小时得一级种子液，并控制转速280rpm；

步骤B：将步骤A得到的一级种子液按体积含量为18%的接种量转接于一级种子罐中，控制一级种子罐内温度34℃，罐压0.02MPa，溶解氧35%，培养20小时得二级种子液；

步骤C：将步骤B得到的二级种子液按体积含量为19%的接种量转接于发酵罐中，控制发酵罐内温度39℃，罐压0.06MPa，通过调节搅拌桨转速和通气量控制罐内溶解氧19%，并保持在梯度酸碱度下进行分段发酵即得；

其中，所述步骤C中梯度酸碱度依次为7.8、7.1、6.4和5.7，每段的发酵时间为7.5小时。

本实施例的步骤C还包括增加体积含量为10%的碳源和体积含量为1.5%的氮源，碳源的质量浓度为60%，氮源的质量浓度为20%。通过调节搅拌桨转速和通气量控制种子罐中溶解氧19%，发酵过程中流加酸和碱调节发酵过程使各功能微生物含量不少于10⁸CFU/mL。

如图4所示，菌体在前24小时内持续高密度发酵，并在第24小时接近最大值，最终在30小时时发酵终止，发酵液体菌浓(OD₆₀₀)162，菌体湿重370g/L，微生物含量达2.23×10¹³CFU/mL。

本实施例的培养基：葡萄糖3%，硫酸铵0.8%，酵母粉0.8%，磷酸二氢钠1.2%，乙酸钠0.2%，七水硫酸镁0.9%，微量元素0.5%；

本实施例的微量元素：无水氯化钙0.05%，七水硫酸亚铁0.04%，七水硫酸锌0.01%，五水硫酸锰0.018%，五水硫酸铜0.0003%，硼酸0.0005%。

本实施例的碳源为葡萄糖、阿拉伯糖、糖蜜和果糖按质量比1:1:3:1.5混合的混合物。

本实施例的氮源为玉米浆干粉、酵母粉和氯化铵按质量比1:0.5:1:5混合的混合物。

本实施例的所述步骤C中调整分段发酵的酸碱度使用的酸为硫酸，所述步骤C中调整分段发酵的酸碱度使用的碱为氨水和尿素按质量比为2:1的混合物。

本实施例的所述环保用复合菌种由一类菌种、二类菌种和三类菌种按质量比1:1:2组成。所述一类菌种为产碱菌、节杆菌、黄杆菌、假单胞菌按质量比2:1:4:0.5组成的混合物，所述二类菌种为伯克氏菌、短杆菌、假诺卡氏菌、黄单胞菌、棒杆菌、红球菌、鞘氨醇单胞菌和戈登氏菌按质量比1:4:7:2:3:1.5:0.1:2组成的混合物，所述三类菌种为生丝微菌、乳酸杆菌和冢村氏菌按质量比0.4:0.5:2组成的混合物。

实施例5

步骤A：将含有培养基的摇瓶中接种环保用复合微生物菌种，在温度30℃培养箱中震荡培养16小时得一级种子液，并控制转速300rpm；

步骤B：将步骤A得到的一级种子液按体积含量为5%的接种量转接于一级种子罐中，控制一级种子罐内温度29℃，罐压0.07MPa，溶解氧30%，培养15小时得二级种子液；

步骤C：将步骤B得到的二级种子液按体积含量为23%的接种量转接于发酵罐中，控制发酵罐内温度33℃，罐压0.03MPa，通过调节搅拌桨转速和通气量控制罐内溶解氧34%，并保持在梯度酸碱度下进行分段发酵即得；

其中，所述步骤C中梯度酸碱度依次为7.4、7.1、6.3和5.3，每段的发酵时间为7小时。

本实施例的步骤C还包括增加体积含量为7%的碳源和体积含量为1.7%的氮源，碳源的质量浓度为46%，氮源的质量浓度为18%。通过调节搅拌桨转速和通气量控制种子罐中溶解氧34%，发酵过程中流加酸和碱调节发酵过程使各功能微生物含量不少于10⁸CFU/mL。

如图5所示，菌体在前6小时内低速发酵，随后持续高速高密度发酵，发酵液体菌浓(OD₆₀₀)143，菌体湿重333g/L，微生物含量达1.99×10¹²CFU/mL。

本实施例的培养基：葡萄糖2.5%，硫酸铵0.2%，玉米浆干粉1.2%，磷酸二氢钠1.2%，乙酸钠0.2%，七水硫酸镁0.5%，微量元素0.8%；

本实施例的微量元素：无水氯化钙0.05%，七水硫酸亚铁0.02%，七水硫酸锌0.01%，五水硫酸锰0.009%，五水硫酸铜0.0003%，硼酸0.0002%。

本实施例的碳源为糖蜜。

本实施例的氮源为硫酸铵。

本实施例的所述步骤C中调整分段发酵的酸碱度使用的酸为硝酸，所述步骤C中调整分段发酵的酸碱度使用的碱为氨水和尿素按质量分数比为1:1.5的混合物。

本实施例的所述环保用复合菌种由一类菌种、二类菌种和三类菌种按质量比1.3:1:2组成。所述一类菌种为产碱菌和节杆菌按质量比0.5:7组成的混合物，所述二类菌种为伯克氏菌、假诺卡氏菌、黄单胞菌、棒杆菌、红球菌、鞘氨醇单胞菌和戈登氏菌按质量比1:4:7:5:10:2.5:0.1组成的混合物，所述三类菌种为生丝微菌和乳酸杆菌按质量比1:4组成的混合物。

实施例6

步骤A：将含有培养基的摇瓶中接种环保用复合微生物菌种，在温度30℃培养箱中震荡培养23小时得一级种子液，并控制转速280rpm；

步骤B：将步骤A得到的一级种子液按体积含量为18%的接种量转接于一级种子罐中，控制一级种子罐内温度39℃，罐压0.05MPa，溶解氧26%，培养17小时得二级种子液；

步骤C：将步骤B得到的二级种子液按体积含量为16%的接种量转接于发酵罐中，控制发酵罐内温度31℃，罐压0.02MPa，通过调节搅拌桨转速和通气量控制罐内溶解氧55%，并保持在梯度酸碱度下进行分段发酵即得；其中，所述步骤C中梯度酸碱度依次为7.8、6.9、6.3和5.2，每段的发酵时间为5小时。

本实施例的步骤C还包括增加体积含量为4%的碳源和体积含量为1.8%的氮源，碳源的质量浓度为43%，氮源的质量浓度为18%。通过调节搅拌桨转速和通气量控制种子罐中溶解氧55%，发酵过程中流加酸和碱调节发酵过程使各功能微生物含量不少于10⁸CFU/mL。

如图6所示，菌体一开始就持续高速高密度发酵，在17小时时达到最大值，发酵液体菌浓(OD₆₀₀)131.3，最终在20小时时发酵液体菌浓(OD₆₀₀)130，菌体湿重312g/L，微生物含量达1.86×10¹²CFU/mL。

本实施例的培养基：葡萄糖2.5%，硫酸铵0.2%，玉米浆0.5%，磷酸二氢钠2.5%，乙酸钠0.1%，七水硫酸镁0.5%，微量元素0.8%；

本实施例的微量元素：无水氯化钙0.04%，七水硫酸亚铁0.03%，七水硫酸锌0.01%，五水硫酸锰0.015%，五水硫酸铜0.0004%，硼酸0.0004%。

本实施例的碳源为葡萄糖、果糖、麦芽糖或阿拉伯糖按质量比1:1:0.5:1.2混合的混合物。

本实施例的氮源为玉米浆干粉、氯化铵和玉米浆按质量比1.5:0.5:1.3混合的混合物。

本实施例的所述步骤C中调整分段发酵的酸碱度使用的酸为乙酸，所述步骤C中调整分段发酵的酸碱度使用的碱为氢氧化钠。

本实施例的所述环保用复合菌种由一类菌种、二类菌种和三类菌种按质量比1:1.5:2组成。所述一类菌种为黄杆菌和假单胞菌按质量比1:1组成的混合菌，所述二类菌种为短杆菌、黄单胞菌、棒杆菌、红球菌、鞘氨醇单胞菌和戈登氏菌按质量比2:2:1.5:4:0.5:1组成的混合物，所述三类菌种为生丝微菌、乳酸杆菌和冢村氏菌按质量比3:4:4组成的混合物。

最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细地说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims

1.一种环保用复合微生物菌剂的液体高密度发酵方法，其特征在于：包括下列步骤：

2.根据权利要求1所述的一种环保用复合微生物菌剂的液体高密度发酵方法，其特征在于：所述步骤C还包括增加体积含量为2~10%的碳源和/或体积含量为0.5~2%的氮源，碳源的质量浓度为40~60%，氮源的质量浓度为10~20%。

3.根据权利要求1所述的一种环保用复合微生物菌剂的液体高密度发酵方法，其特征在于：所述步骤A中的培养基包括下列成份：葡萄糖1.5~3%，硫酸铵0.2~0.8%，有机氮源0.5~1.5%，磷酸二氢钠0.4~2.5%，乙酸钠0.1~0.3%，七水硫酸镁0.5~1.6%，微量元素0.1-2%。

4.根据权利要求3所述的一种环保用复合微生物菌剂的液体高密度发酵方法，其特征在于：所述微量元素包括无水氯化钙0.03~0.05%，七水硫酸亚铁0.02~0.04%，七水硫酸锌0.01~0.02%，五水硫酸锰0.005~0.02%，五水硫酸铜0.0001~0.0008%，硼酸0.0001~0.0005%。

5.根据权利要求3所述的一种环保用复合微生物菌剂的液体高密度发酵方法，其特征在于：所述有机氮源为玉米浆、玉米浆干粉和酵母粉中的一种或二种以上的混合物。

6.根据权利要求1所述的一种环保用复合微生物菌剂的液体高密度发酵方法，其特征在于：所述环保用复合微生物菌种由一类菌种、二类菌种和三类菌种按质量比1~2:0.1~3:1~5组成。

7.根据权利要求6所述的一种环保用复合微生物菌剂的液体高密度发酵方法，其特征在于：所述一类菌种为产碱菌、节杆菌、黄杆菌、假单胞菌中一种或两种以上；所述二类菌种为伯克氏菌、短杆菌、假诺卡氏菌、黄单胞菌、芽孢杆菌、棒杆菌、红球菌、鞘氨醇单胞菌、戈登氏菌中一种或两种以上；所述三类菌种为生丝微菌、乳酸杆菌、冢村氏菌中一种或两种以上。

8.根据权利要求2所述的一种环保用复合微生物菌剂的液体高密度发酵方法，其特征在于：所述碳源为葡萄糖、蔗糖、糖蜜、果糖、麦芽糖或阿拉伯糖中的一种或两种以上的混合物。

9.根据权利要求2所述的一种环保用复合微生物菌剂的液体高密度发酵方法，其特征在于：所述氮源为氯化铵、硫酸铵、玉米浆、玉米浆干粉、酵母粉中的一种或两种以上混合物。

10.根据权利要求1所述的一种环保用复合微生物菌剂的液体高密度发酵方法，其特征在于：所述步骤C中调整分段发酵的酸碱度使用的酸为磷酸、硫酸、盐酸、乙酸和硝酸中的一种或二种以上混合物，所述步骤C中调整分段发酵的酸碱度使用的碱为氢氧化钠、氢氧化钾、氨水和尿素中的一种或二种以上混合物。