CN109321428A

CN109321428A - 一种热循环装置、方法及应用

Info

Publication number: CN109321428A
Application number: CN201811092013.0A
Authority: CN
Inventors: 刘玚; 虞之龙; 邱海维; 胡琬璐
Original assignee: Beijing Kubo Technology Co Ltd
Current assignee: Beijing Kubo Technology Co Ltd
Priority date: 2018-09-20
Filing date: 2018-09-20
Publication date: 2019-02-12
Anticipated expiration: 2038-09-20
Also published as: CN109321428B

Abstract

本发明提供了一种通过将管型组件在多个对应孔准直、温度不同的带孔金属块间轴向移动，对管型组件中的液体进行快速变温的装置、使用此装置进行快速变温的方法，以及使用此方法进行PCR的应用。

Description

一种热循环装置、方法及应用

技术领域

本发明涉及实时荧光PCR领域，具体而言，涉及一种快速实时荧光PCR的方法。

背景技术

已有多种装置被设计来进行PCR反应。在一种常见类型的固定式PCR装置中（US5656493A），将PCR反应液装入单个小管、多个小管、或多个小管排列和相互连接形成的排管或多孔板中，并将小管放入包含单个或多个孔的金属块中，使得小管外壁与孔贴合。金属块可以通过连接在其上的电阻性元件、帕尔贴片等方式加热，亦可以通过吹冷风、帕尔贴片等方式制冷。运行时，相应的控制程序可以读取金属块上连接温度探头的温度，并通过反馈机制设定金属块上连接的加热或制冷器件加热或制冷的功率，来达到控制金属块温度的目的。通过热传导，PCR反应液温度会达到或接近金属块的温度。

在另一类常见的旋转式PCR装置中（US5455175），将盛有PCR反应液的小管放置于一个可以旋转的转盘上，将转盘放置于反应室中。PCR装置中的一个空气管道连接至反应室，向反应室排出已加热至特定温度（如95℃或60℃）的热空气。转盘旋转时，大量空气与小管外壁接触，使管中的PCR反应液接近或达到热空气的温度。

PCR热循环的总时间主要由两个要素决定：PCR反应液中DNA聚合酶完成延伸步骤所需要的时间，以及PCR反应液达到设定温度的时间。第一个要素主要由DNA聚合酶的延伸速率、DNA聚合酶反应性、DNA聚合酶浓度等因素所决定，目前已有包括使用KAPA 2G、Taq、Phusion等数种DNA聚合酶的PCR体系可以进行快速PCR。另一方面，热循环装置本身的变温速率、反应管的形状与厚度以及管外壁与金属块的配合影响了PCR反应液到达设定温度所需要的时间。在上文描述的常规装置中，运行单个热循环的总时间一般不低于20秒，常见为30-120秒。总PCR运行时间一般为25-100分钟。

已有数种快速PCR装置被设计出来进行更快速的PCR检测。在一种快速PCR装置中（US6556940B1），通过将管壁设计得更薄（20-40 μm）来提高从金属块到PCR反应液的导热性，以降低PCR反应液达到设定温度的时间。此方法的缺点在于一方面由于金属块本身也要在此过程中加热或制冷，快速升降温导致装置的功耗较常规PCR装置明显增大；另一方面，薄壁的设计使得小管本身在制造、储存、操作、运行过程中容易出现针眼或裂纹，使PCR反应液体泄漏导致反应失败。

在一类被称为连续流PCR的装置中（FR2796863A1），PCR反应液可被驱动在细长的管道内流动，管道设置为多次反复缠绕或固定在不同温度区域上。PCR反应液连续流过不同的温区来达到PCR反应的目的。这类PCR装置一般需要外部装置驱动PCR反应液，在液体刚进入管道和液体充满管道时的温度会有所差别，液体和管道的接触使得液体的流动不均匀，且微小的管道瑕疵会对结果产生较大的影响。这些原因使得这类装置在进行较快速PCR时稳定性不高。

在另一个被称为极限PCR的装置中（US9932634B2），液体的变温由盛装PCR反应液的小管在两个盛放有大量已预先设置合适温度的液体的容器间运动所实现。小管在运动至不同的容器内时，分别与容器内的液体接触，可迅速达到液体的温度。这种装置使40个PCR热循环能在1-2分钟内完成，但大量高温液体的存在，以及装置运行时产生的溅洒使得这种装置易用性和安全性较低，且第一次使用前需要将大量液体加热，花费时间较长。

除此之外，还有一些快速PCR装置相关的文献（Chan K, Wong P-Y, Wilson SA,et al. (2016) A Rapid and Low-Cost PCR Thermal Cycler for Infectious DiseaseDiagnostics. PLoS ONE 11(2): e0149150，Jun Ho Son, Byungrae Cho, Luke P Lee,et al. (2015) Ultrafast Photonic PCR. Light: Science &Applications 4, pagee280等）。这些装置的结构存在各自的问题：PCR效率低，仪器的稳定性较低，易用性较差等等，在此不再逐一展开。

由于PCR反应在生物学和医学检测上的广泛应用，需要新的快速、稳定、易用的热循环装置，使得每个PCR热循环可以在少于20秒的时间内完成，总PCR检测时间在15分钟以内。

发明内容

针对上述问题，本发明提供了一种通过将管型组件在多个对应孔准直、温度不同的带孔金属块间轴向移动，对管型组件中的液体进行快速变温的装置、使用此装置进行快速变温的方法，以及使用此方法进行PCR的应用。

本发明提供了一种用于进行热循环的装置，其组件包括：

N个金属块（），每个金属块上连接有对应的控温加热装置；

M个连接组件，，每个连接组件位于相邻两个金属块之间，用于连接上述N个金属块；

每个金属块和每个连接组件的内部包含有1个或数个通孔，使得所有N个金属块和M个连接组件上对应的通孔同心且准直，构成1个或数个互相平行的通孔；

管型组件，其上包含1个或数个空心、单端封闭、可盛装液体的柱形管，并部分或完全插入由上述金属块和连接组件形成的1个或数个通孔中，在通孔中轴向一维移动，形成与通孔轴向平行的移动路径；

液体，位于管型组件柱形管的底部，随管型组件的移动路径在N个金属块之间移动。

本发明的装置，其特征在于，每个金属块都存在与其相对应的位置区间，使得管型组件位于第个位置区间内时（1，液体位于第个金属块的内部。

本发明的装置，其特征在于，所述的管型组件插入对应的通孔后，管型组件外壁与金属块内壁之间的间隙小于或等于0.1 mm，优选小于或等于0.05mm。

本发明的装置，其特征在于，连接组件的整体或部分由低导热系数的材料组成，其导热系数不高于5W/(m*K)，例如塑料、橡胶、玻璃、陶瓷中的一种或几种。

本发明的装置，其特征在于，所述柱形管的未封闭端连接有附加部分，该附加部分可以引导液体加入柱形管中，或从连接附加装置的一端封闭柱形管，或使管型组件固定在移动装置上。

本发明的装置，其特征在于，所述的金属块和控温加热装置通过螺纹、焊接、胶粘中的一种或数种组合的方式连接。

本发明的装置，其特征在于，所述的控温加热装置包括用于对控温加热装置加热的加热元件；和用于读取控温加热装置温度的温度探头。

本发明的装置，其特征在于，所述的加热元件和温度探头通过螺纹、焊接、胶粘中的一种或数种组合的方式连接于控温加热装置的表面或内部。

本发明的装置，其特征在于，其中N个金属块中温度较低的金属块上有增强散热组件。

本发明的装置，其特征在于，所述增强散热组件为位于金属块上用于增加金属块表面积的一个或多个槽、孔、柱，或为位于金属块附近用于增强空气流动的组件，或为位于金属块内部的流道，流道中通过温度较低的流体，或为与金属块接触的低温物体。

本发明的装置，其特征在于，金属块中包含用于传导从金属块外部射入金属块内部/从金属块内部射出金属块外部的光线的导光孔。

本发明的装置，其特征在于，所述导光孔在每个金属块中的数量为1个或者多个。

本发明还提供了一种对液体实现变温的方法，其特征在于，使用本发明描述的装置，每个金属块由控温加热装置固定在设定温度，N个金属块固定在至少两个不同温度上，管型组件在通孔中轴向一维移动，形成与通孔轴向平行的移动路径，通过在不同温度的金属块间移动管型组件，来快速变化管型组件内液体的温度，管型组件从第i₁个位置区间沿移动路径移动到第i₂个位置区间（1i₂）,并在第i₂个位置区间停留一段时间；液体的温度在此段时间内接近或达到第i₂个金属块的温度。

本发明的方法，其特征在于，管型组件在不同位置区间循环往复移动以进行多个变温循环。

本发明的方法，其特征在于，通过负反馈方式控制加热元件的加热功率来控制可控温加热装置的温度。

本发明的方法，其特征在于，透过导光孔向液体发出包含一种或多种特定波段的激发光，用于激发液体中包含的特定荧光分子，液体中包含的特定荧光分子发出特定光谱的发射光，发射光透过一个或者多个导光孔后被检测到。

本发明还提供了一种本发明的装置或方法在扩增PCR反应液中模板分子，检测样品中是否存在特定序列DNA、RNA分子，检测样品中特定序列核酸浓度中的应用。

图1示意了热循环装置的主体由带孔的金属块100、金属块300，和将金属块互相连接的组件200构成。配合此装置使用的管型组件10的中含有进行热循环的液体11。

在图1中，金属块100、金属块300和组件200的外形作为带通孔的圆柱形，或近似柱形出现。应当说明，圆柱形只是金属块100、金属块300、固定组件200的一种可能的外形。这些组件的结构特征在于通过组件200连接后，金属块100和金属块300内部包含对应的孔准直且同心，整体形成通孔。管型组件10的一部分可以完全插入或部分插入此通孔中。图1中的空心双箭头示意了管型组件10的底部在使用中会插入上述通孔中，并可沿此通孔的轴向移动。管型组件10沿从金属块100向金属块300的方向移动时，管型组件10的底部包含的液体11依次达到或经过金属块100内部、固定组件200内部、金属块300内部的位置；管型组件10沿从金属块300向金属块100的方向移动时，内部包含的液体11依次达到或经过金属块300、固定组件200、金属块100内部的位置。在管型组件10移动路径的一个区间，液体11可以完全处于金属块100内部；在移动路径的另一个区间，液体11可以完全处于金属块300内部。

管型组件10为单端封闭的柱形空心管，可在内部盛装液体11。液体11的体积一般在0.1 μl - 1000 μl范围。管型组件的空心管部分内径一般在0.1 - 5 mm之间，长度一般在10 - 200 mm之间。空心管部分的材质可以选择玻璃、塑料、金属或陶瓷，壁厚一般在0.01– 1 mm之间。可选的，管型组件10的另一端连接有附属结构，以达到以下目的中的一种或数种：方便液体11加入、从另一端封闭管型组件、使管型组件易于固定在移动装置上。

为了简明起见，在图1中未画出金属块100、300和组件200上的其它细节与附属结构。这些结构将在后文中逐一详细说明。

如图2所示，金属块100上连接有加热组件120，在使用中可以控制金属块100的温度，常见温度控制范围在20 ℃ - 120℃之间。金属块300上连接有加热组件320，在使用中可以控制金属块300的温度，常见为20℃ - 120℃之间。100和120、300和320的连接方式可通过螺纹连接，也可通过焊接连接、胶水连接，也可通过这些连接方式相组合，以达到机械连接和良好的热传导作用。在金属块100、组件200、金属块300互相连接的结构中，通孔50形成供管型组件10移动的轨道。

组件200连接了金属块100和金属块300。此装置在运行时，金属块100和金属块300一般维持在不同的温度，因此组件200的整体或其中一部分应该选用导热较差的材料，否则金属块100和300二者中温度较高者会将热量快速传导至温度较低者，导致两个金属块中一个或两个的温度无法被有效控制在所期望的温度。同时，组件200与金属块100、金属块300接触和连接的部分应该能够在使用中耐受其设定的温度。基于上述两点，组件200的材料常见为熔点或热变形温度高于120 ℃的塑料、橡胶、玻璃、陶瓷，或由其中的数种复合而成。

图3表示了加热组件120和加热组件320的内部结构、加热组件与控制系统的连接与控制机制。加热组件120的内部包含有加热器件121和测温器件122。加热器件121和测温器件122通过螺纹连接、焊接连接或胶水连接中的一种或数种组合连接于加热组件120内部。类似的，在加热组件320的内部包含加热器件321和测温器件322。321和322通过螺纹连接、焊接连接或胶水连接中的一种或数种组合连接于加热器件320内部。测温器件122和322分别通过导线对124和324连接至控制电路500中，并由控制电路500分别读取加热组件120和320的温度。控制电路500经过计算后，分别通过导线对123和323向加热器件121和321输出一定的功率，以控制加热组件120和320的温度。为了保证加热组件120与金属块100，以及加热组件320与金属块300之间的良好导热，以及加热组件120与加热组件320外壳与内部的温度均匀性，加热组件120和320的主体采用高导热性的材料制作，常见为铜或铜合金、铝或铝合金、高导热陶瓷材料等。由于这些材料的导热性较高，可以认为温度探头121测得的温度基本等同于金属块100的温度；温度探头321测得的温度基本等同于金属块300测得的温度。

图4示意了管型组件10的底部在中央通孔50中沿轴向移动时，移动路径中的两个特征性位置所代表的状态和其转换过程。在图4左侧所示的状态中，液体11完全处于金属块100的中心孔内，管型组件10的下部和液体维持在金属块100的温度，或接近金属块100的温度。通过向金属块300的方向移动管型组件10一段距离后，液体11完全进入金属块300的中心孔内，液体11的温度很快达到或接近金属块300的温度，达到图4右侧所示的状态。类似的，在图4右侧所示的状态中，液体完全处于金属块300的中心孔内，管型组件10的下部和液体11维持在金属块300的温度，或接近金属块300的温度。通过向金属块100的方向移动管型组件10一段距离后，液体11完全进入金属块100的中心孔内，液体11的温度很快达到或接近金属块100的温度，达到图4左侧所示的状态。

图5用一次实验中管型组件10内液体11的温度变化来说明本发明中描述的装置可以对液体进行快速变温。在此实验中，管型组件10置于中央通孔50中，在金属块100、组件200和金属块300形成的两个温区往复移动。在此次实验中，管型组件10内除了少量液体11外，还包含有完全浸入在液体11中的温度探头，用以测量液体11的温度。在此次实验中，金属块100的温度控制在约60℃，金属块300的温度被控制在约95℃。图中的实线表示了温度探头的读数；虚线代表了管型组件10在此过程中的相对位置：虚线最高处代表着液体11已经完全处于金属块300的内部；虚线最低处代表液体11已经完全处于金属块100的内部。图中可以看出，管型组件10从金属块100向金属块300开始移动约2.0 s的时间内，液体11温度已经升至93℃以上；管型组件10从金属块300向金属块100开始移动约2.0 s的时间内，液体11温度已经降至62℃以下。

图6描述了内部呈有少量液体的管型组件10封口端处于中央通孔50内部靠金属块300一侧时，此装置径向方向截面的结构示意图。400是金属块300的截面；402是管型组件10底部空心圆柱管的管壁截面；403是管型组件10内部盛装的液体11的截面；401是由管型组件10底部圆柱管外壁和金属块300的孔内壁形成间隙的截面，由空气所填充。由于空气的导热性在此图中较其它材料低1-5个数量级，此间隙的平均厚度d _gap在一定程度上决定了管型组件10内部液体的最大变温速率。

图7中展示了在一组实验中，不同间隙d _gap对液体变温速率的影响。在实验中，将管型组件10中填充少量液体，温度探头浸没于液体中用于读取液体温度。金属块100的温度控制在约57℃，金属块300的温度控制在约103℃。在初始时，管型组件10的底部在金属块100的内部。之后将管型组件10迅速向金属块300的方向移动，使其底部停留在金属块300的内部孔中。在实验中，通过逐渐加大金属块300的孔尺寸，实验中记录了d _gap不同时，管型组件10内部液体温度在移动发生后一段时间内的变化。实线代表温度探头在相应时间读取的温度，虚线代表了管型组件10在此过程中的相对位置：虚线最高处代表着管型组件10内的液体已经完全进入金属块300的温度区域；虚线最低处代表管型组件10内的液体已经完全进入金属块100的温度区域。结果表明，d _gap加大时，液体变温速率变慢，达到设定温度的时间增加。当d _gap小于0.1 mm时，在此系统下可以在10 s内达到或接近至相应金属块温度的5℃之内。在低温金属块100对外散热是充分的前提下，如管型组件10从较高温金属块向较低温金属块快速移动，当d _gap小于0.1 mm时，管内液体也可以在10 s内降到或降至接近至相应较低金属块温度的5℃之内，且d _gap越小，管内液体达到或接近设定温度的速度越快。

管型组件10在金属块100、金属块300间来回移动时，可根据需要，采取合适结构对较低温度的金属块进行增强散热。假设金属块100的温度控制恒定在t ₁，金属块300的温度控制恒定在t ₃，且t ₃>t ₁。在某一时刻，管型组件10中的液体11处于金属块300的内部孔中，且温度已达到或接近t ₃，然后迅速将管型组件向金属块100的方向移动，使液体11的位置处于金属块100的内部孔中。此时液体11的温度接近t ₃，高于金属块100的温度t ₁，因此在一段时间内，液体将通过管壁向金属块100传递热量，直至液体温度达到或接近金属块100的温度t ₁。在此过程中，金属块100从管型组件10和液体11接受的总热量H = C * ( t ₃ - t ₁ ) ，其中C为管型组件10底部管壁和其中液体11的热容。为维持金属块100的温度基本恒定，此热量H需要从金属块100的内表面转移至与金属块100相连接附件、附近空气、与金属块100接触的冷却液体等介质中。应当在此指出，此段和下段中均只讨论了金属块100的温度t1低于金属块300的温度t3的情形，需要对金属块100进行增强散热；反过来，如果在某些应用中，金属块100的温度需要控制到高于金属块300的温度，且金属块300的被动散热无法达到从管型组件10和其中包含液体中接受的热量，则可相应选择对金属块300进行增强散热。

在图 8a-d中，分别展示了4种对较低温金属块（假定为金属块100；金属块100在各图因形状和内部结构的不同分别在8a-8d中对应标注为100a、100b、100c、100d）进行增强散热的方式及其对应结构：

图8a中描述了通过增大金属块100的表面积增强散热，例如将金属块100a的一部分加工成一个或多个条形、槽形或柱形结构（150），以增大金属块100a与接触介质（一般为空气，但可以是其它气体、液体）的接触面积，达到增强散热的效果。

图8b中描述了通过附加气体驱动装置（160）驱动金属块100b附近的气体，使其运动速度加快，可带走更多金属块100的热量，达到增强散热的效果。图中160与100b中的箭头仅示意气体流动，不代表气体流动方向必须与此箭头方向一致。

图8c中描述了通过在金属块100c内部加工出供流体流过的流道（170），在内部流道170通过较低温的流体（可为气体或液体）时带走金属块100的热量，达到增强散热的效果。流道170两端的两个箭头示意流体流动，不代表流动方向一定与箭头方向一致。

图8d中描述了通过将金属块100d与其它较低温介质（180）直接接触或固定连接，通过将金属块100的热量传导至较低温介质180上，达到增强散热的效果。金属块100d和较低温介质180中间的空心箭头示意热传量导方向是从100d向180传导。

图9中展示了在一次快速变温实验中，比较不进行增强散热和联合使用了图8a、8b中描述的方式增强散热时，管形组件10中液体11的温度变化。在图9a代表的装置中，较低温金属块100上仅固定有控温加热组件120。而在图9b代表的装置中，较低温金属块上除控温加热组件120外，还固定一个带有鳍片（150）的散热器，并在其附近放置一个风扇（160）用于鼓风，以同时达到增大表面积和增加附近气体流动以增强散热的目的。一个温度探头被放置于管型组件10内的液体11中，以读取液体11的实时温度。在两个装置中，金属块300的温度和金属块100的温度均分别设定为97度和58度，在图9a和9b中用虚线表示。图9a中的实线代表了未对较低温金属块进行增强散热时，液体11的温度变化情况。可以看出，在未进行增强散热时，管形组件10和液体11在热循环时，随着热循环次数增加，液体低温升高，说明较低温金属块100的温度不断升高，在后期超过了金属块的设定温度约8-10度。而在图9b中所示的进行增强散热的情况下，低温金属块100的温度可以稳定在设定温度。这组实验表明了增强散热对较低温金属块温度恒定的作用，在多个连续循环中可以使液体稳定地达到设定温度。在应用本发明描述的装置时，可根据环境温度、热循环程序、液体热容等参数不同，在控制系统中控制散热的功率，达到恒定低温金属块温度的目的。

在图10中描述了可选择在金属块100与金属块300上增加导光孔，在运行过程中用于检测液体11的光学特性。在每个金属块上可以不含有导光孔，也可以包含有1个或多个导光孔。外部光线可以穿过导光孔射向液体11。从液体11中向外发射的光，或穿过液体11的光，或在液体11中散射的光也可以通过导光孔向外发射。导光孔从通孔穿透至金属块的外表面（如图中对应标注Ex₁-Ex₉/Em₁-Em₉的9个孔），一般与通孔50的轴向垂直；除此以外，通孔50的非插入端（在图中对应标注Ex₁₀/Em₁₀）开口也可作为导光孔。

特别的，通过导光孔可以检测液体11的荧光信号。在使用中，包含特定波段的激发光（在图中标注为Ex₁-Ex₁₀，用实线细箭头表示激发光的大致方向）可通过导光孔，激发液体11中含有的相应荧光分子。荧光分子在被激发光激发后，发射出相应较长波段的发射光（在图中标注为Em₁-Em₁₀，用虚线细箭头表示发射光透过导光孔部分的大致方向），并部分通过导光孔，被孔外对应波长的检测器所检测到。液体中可能包含有适合不同波段激发和发射的荧光分子。在荧光检测中，可将某几种波段的激发光和发射光在同一个导光孔中检测，也可以各自在不同的导光孔中检测；也可以由一个导光孔导入激发光，通过此孔或邻近的几个导光孔读取发射光信号。

根据需要，金属块100与金属块300中可以包含有多于一个通孔50；每个通孔50都可以选择性地插入一个管型组件，或包含有多个柱形管的管型组件，以达到多个样品在同一个装置中同时检测的目的。在图11所示的例子中，金属块100q和金属块300q上各含有4个互相平行的内孔，相邻孔间的距离相等。金属块100q、金属块300q与组件200q进行连接后，金属块上相应的孔构成了4个通孔50，可以供4个含有单根柱形管的管型组件10插入。在使用时，金属块100q和金属块300q控制在不同的温度。4个管型组件10可以同时在4个通孔50中往复移动，达到对其中各自不同的样品进行相同程序热循环的目的。多个管型组件10可以按照相同移动方式进行热循环，也可以各自独立在其对应通孔50中往复移动进行热循环，也可以按一定方式分组后，按组在其对应通孔中往复移动进行热循环。应当指出，此例子是为了说明本发明描述中的金属块100和金属块300在分别与组件200连接后，其组合结构可以包含多个通孔50，每个通孔50均可以供一个柱形管内的不同液体样品在同一段时间内进行变温和热循环，并不限定每个通孔50的方向、间距、位置、数量。

上文已描述通过在2个不同温度的金属块100和300间移动管型组件10，使液体11在两个不同温度间进行热循环。作为本发明的一部分，可以通过将管型组件10在3个或更多个金属块之间移动，使液体11在3个或更多个不同温度间进行热循环。图12中示意了一个可以控制液体在3个温度之间进行热循环装置。金属块100、300a、300b中均含有一个内孔，通过组件200a、200b将这三个金属块进行连接后，所有金属块的内孔互相同心准直形成通孔50，可供管型组件10的柱形部分在其中按轴向移动。图12的左侧、中间、右侧示意了三种特征状态，这三种状态中，管型组件的位置使得其中的液体11分别对应处于金属块100、金属块300a、金属块300b的内部。当液体11处于某一个金属块内部后，液体的温度将很快达到或接近此金属块的温度。通过移动管型组件10，可以使液体在三个不同温度的金属块内部移动，液体的温度也相应在三个金属块设定的对应温度间来回转换。

上文已描述通过在不同温度的金属块间移动管型组件10，可以快速地变化液体11的温度。在此有必要指出，应用本发明描述的装置，主要通过在不同温度的金属块间移动管型组件来快速变化管型组件内液体的温度，但在某些情形下，也可以通过使管型组件10内的液体11静止地处于某一个金属块内部孔中，通过相应程序控制的加热和散热装置来改变金属块的温度来改变液体11温度。

附图说明

图1示意了本发明装置中的金属块、连接金属块的组件、管型组件和管型组件中的液体。

图2示意了金属块互相连接后形成的通孔，以及每个金属块上连接的控温加热装置。

图3示意了控温加热装置的内部组件和控制温度的原理。

图4示意了应用本发明装置进行热循环过程中的两个典型状态和互相转换的过程。

图5表示了应用本装置进行热循环实验中，管型组件处于不同位置时，液体温度的变化情况。

图6示意了本发明装置的一个特征性截面，以及通孔和管型组件外壁间的间隙。

图7比较了间隙不同的情况下，液体在变温实验中的温度变化曲线。

图8a-8d示意了四种不同的对较低温金属块进行增强散热的方式。

图9a-9b示意了进行增强散热对较低温金属块控制温度的影响。

图10示意了金属块上的导光孔，光可通过导光孔进出。

图11示意了组件中可以存在多个通孔，可供多个管型组件对其中液体变温。

图12示意了组件中可以存在多于2个金属块，以供管型组件在多于2个温度间进行热循环。

图13表示了用本装置进行qPCR实验，样品中是否含有特定DNA分子的两种不同荧光曲线。

图14表示了用本装置进行RT-qPCR实验，样品中是否含有特定RNA分子的两种不同荧光曲线。

图15表示了用本装置进行DNA定量实验，一系列不同浓度的标准样品和未知浓度样品对应的荧光曲线。

图16表示了根据图14中一系列不同浓度标准样品对应归一化荧光曲线的x轴位置和浓度对数的线性关系。

具体实施方式

实施例1:快速PCR扩增

在本例中使用了两段外径为6 mm，长度为5mm的圆柱形铜柱作为前文所述金属块100和金属块300。两段铜柱均在圆柱轴向圆心处加工通孔，通孔直径为0.600±0.005mm。在两个铜柱侧向各用螺纹固定有内部已预埋有温度探头和加热电阻的控温式加热器，用以控制两个铜柱的温度。两个铜柱小心摆放，使得铜柱上的通孔准直同心后，均用耐高温环氧胶水粘贴连接至尼龙固定柱（组件200）上，两个铜柱的间距约为2mm。

在本例中使用了一段拉制的硼硅酸盐玻璃毛细管作为管型组件10（在本例中称为毛细管组件）的主体结构。此段毛细管的外径为0.590±0.005mm，壁厚约为0.10mm，一端熔融封闭，另一端固定有便于液体加入其内部的聚丙烯液池。聚丙烯液池在运行时可固定在一个位于线性滑台上的滑块的孔中，使毛细管组件的主体部分可以在随着滑块的移动，在两个铜柱形成的中央通孔内往复移动。线性滑台上的滑块移动可以由控制程序控制。

在本例中，液体11为一种PCR反应液，目的在于将其中含有的少量双链DNA模板分子，通过PCR热循环扩增后，将PCR扩增产物在琼脂糖凝胶电泳中检出。此PCR反应液含有：0.5 U/μlKAPA2G Fast DNA Polymerase (KAPA BIOSYSTEMS)，1x KAPA2G Buffer (KAPABIOSYSTEMS)，2.5mM MgCl₂，1 μM正向引物，1 μM反向引物，200μM each dNTP，约10³个/μl双链DNA模板分子。正向引物的序列为：5’-TGGAGGTAGTAGAGCCTGAAGTC-3’，反向引物的序列为：5’-GGAGTCAGGCTGTTCAAGACAA-3’，模板分子和相应扩增产物的序列均为： 5’-TGGAGGT AGTAGAGCCTGAAGTCTTGCAGGACTCACTGGATAGATGTTATTCAACTCCTTCCAGTTGTCTTGAACAGCCTGAC TCC-3’，长度86bp。序列中的下划线部分为引物对应序列。

在运行前，配制好上述PCR反应液约10 μl，然后取其中约0.5μl上述反应液至一个上述毛细管组件的聚丙烯液池中。将毛细管组件放入一个2 ml小管中，用手掌式离心机旋转约10 s后，含有样品的反应液完全离心至管底熔融端，形成约4 mm长的一段液柱。将毛细管组件的玻璃毛细管部分小心插入0.600mm的中心孔后，固定在线性滑台上滑块的固定孔中。调整滑块位置，使得液柱的位置完全在其中一个铜柱的内部。

控制程序按如下流程进行控制：

a. 分别控制两个铜柱上的加热器，使铜柱升温，并分别设置在约96℃（对应初始时液柱在其内部的铜柱，在此例中称为铜柱300）和约60 ℃（初始时液柱不在其内部的铜柱，在此例中称为铜柱100）。铜柱300需要约15 s从室温达到约96℃，铜柱100需要约6s从室温达到约60 ℃。此步骤约15 s完成。

b. 液体在铜柱300内停留1 s。

c. 将滑块向铜柱100方向移动约7 mm，此时液柱完全处于铜柱100的内部。此步骤约0.15 s完成。

d. 液体在铜柱100内停留1.5 s。

e. 将滑块向铜柱300方向移动约7 mm，此时液柱完全处于铜柱300的内部。此步骤约0.15 s完成。

f. 回到步骤b，并继续重复39次循环（总计40个循环）。

g. 铜柱100和铜柱300均停止加热，自然降温。

此流程总计耗时约127 s，对PCR反应液完成了40个96℃ – 60℃热循环。在运行结束后，通过琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行检测，确认了约90 bp的PCR产物条带，表明此装置可以有效进行PCR扩增。

实施例2：检测样品中特定序列DNA分子

在本例中使用了两段外径为5 mm，长度为16 mm的圆柱形铜柱作为前文所述金属块100和金属块300。两段铜柱均在圆柱轴向圆心处加工通孔，通孔直径为2.02±0.01 mm。在两个铜柱侧向各用螺纹固定有内部已预埋有温度探头和加热电阻的控温式加热器，用以控制两个铜柱的温度。两个铜柱小心摆放，使得铜柱上的通孔准直同心后，均用耐高温环氧胶水粘贴连接至尼龙固定柱（组件200）上，两个铜柱的间距约为2mm。在两个铜柱上各有一个直径约1.5 mm的导光孔，可以透过导光孔获取荧光信号。在本例中，选用了适合SYBR Green染料光谱的荧光检测装置。在装置中，使用了470 nm峰值的LED作为激发光源，470/25 nm的带通滤光片作为激发滤光片，525/20 nm的带通滤光片作为发射滤光片，以及一个CMOS相机作为荧光检测装置并积分得到荧光强度。在其中一个铜柱（本例下文中所述铜柱100）附近，有一个可以用程序控制开关的风扇，用于给此铜柱增强散热。

在本例中使用了一段石英玻璃管作为管型组件10（在本例中称为石英管组件）的主体结构。此段石英管的外径为2.00±0.01 mm，壁厚约为0.20 mm，一端熔融封闭，另一端固定方便液体加入其内部的聚丙烯液池。聚丙烯液池在运行时可固定在一个位于线性滑台上的滑块的孔中，使石英管组件的石英管熔融端可以在随着滑块的移动，在两个铜柱形成的中央通孔内往复移动。线性滑台上的滑块移动可以由控制程序控制。

在本例中，液体11的一部分为一种qPCR反应液，其目的在于与样品按比例混合后，检测样品中是否存在特定序列的DNA模板。此qPCR反应液含有：0.2 U/μlKAPA2G HotStartFast DNA Polymerase (KAPA BIOSYSTEMS)，1x KAPA2G Buffer (KAPA BIOSYSTEMS)，0.5xSYBR Green染料 (Invitrogen)，2.5mM MgCl₂，1 μM正向引物，1 μM反向引物，200μM eachdNTP。与反应液相混合的样品中可含有模板分子，也可不含有模板分子。正向引物、反向引物、扩增产物的序列与实施例1相同。

在运行前，配制好上述qPCR反应液约18 μl，加入2 μl样品并混匀后，将其转移至一个上述毛细管组件的聚丙烯液池中，并在液池中加入约0.5 μl液体石蜡。用手掌式离心机旋转约10 s后，含有样品的反应液完全离心至管底熔融端，形成约12 mm长的一段液柱，液体石蜡覆盖在液柱的上表面，可避免反应液在运行过程中的挥发。将石英管组件的石英管熔融端小心插入2.02mm的中心孔后，固定在线性滑台上滑块的固定孔中。调整滑块位置，使得液柱的位置完全在其中一个铜柱的内部。

控制程序按如下流程进行控制：

a. 分别控制两个铜柱上的加热器，使铜柱升温，并分别设置在约103℃（对应初始时液柱在其内部的铜柱，在此例中称为铜柱300）和约56℃（初始时液柱不在其内部的铜柱，在此例中称为铜柱100）。铜柱300需要约30 s从室温达到约103℃，铜柱100需要约15 s从室温达到约56℃。此步骤约30 s完成。

b.液体在铜柱300内停留10 s，然后开启风扇。

c. 液体在铜柱300内停留4 s。

d. 将滑块向铜柱100方向移动约18 mm，此时液柱完全处于铜柱100的内部。此步骤约0.25 s完成。

e. 液体在铜柱100内停留6 s。

f. 开启LED，获取铜柱100内导光孔的荧光图像并计算孔内总强度，关闭LED。此步骤约0.2 s完成。

g. 将滑块向铜柱300方向移动约18 mm，此时液柱完全处于铜柱300的内部。此步骤约0.25 s完成。

h. 回到步骤c，并继续重复31次循环（总计32个循环）。

i. 铜柱100和铜柱300均停止加热，自然降温，关闭风扇。

此流程总计耗时约380 s，对qPCR反应液完成了32个热循环。图13中给出了在上述qPCR反应液体中加入约10⁴个DNA模板分子，和上述qPCR反应液未加入模板分子在此装置上运行的两条荧光强度曲线。从图中可以看出，加入DNA模板分子的反应液曲线呈常见qPCR扩增的S型曲线；而不含模板分子的反应液曲线几乎没有变化。

此例结果表明，此装置可以用于检测样品中是否存在特定序列的DNA模板分子。

实施例3：检测样品中特定序列RNA分子

在本例中的装置、管型组件均与实施例2中相同。

在本例中，液体11为一种RT-qPCR反应液，其目的在于与样品按比例混合后，检测样品中是否存在特定序列的RNA模板。此qPCR反应液含有：1x KAPA2G SYBR FAST One-StepqRT-PCR mix (KAPA BIOSYSTEMS)，1 μM正向引物，1 μM反向引物。与反应液相混合的样品中可含有模板分子，也可不含模板分子。正向引物的序列为：5’-AGGAATTGACGGAAGGGCACCA-3’，反向引物的序列为：5’-GTGCAGCCCCGGACATCTAAG-3’。此对引物扩增真核生物核糖体18S上约320-330bp的片段，可用于检测是否存在真核生物RNA。

在运行前，配制好上述反应液约19 μl，加入1 μl样品并混匀后，将其转移至一个上述毛细管组件的聚丙烯液池中，并在液池中加入约0.5 μl液体石蜡。用手掌式离心机旋转约10 s后，含有样品反应液完全离心至管底，形成约12 mm长的一段液柱，液体石蜡覆盖在液柱的上表面，可避免反应液在运行过程中的挥发。将石英管组件的石英管熔融端小心插入2.02mm的中心孔后，固定在线性滑台上滑块的固定孔中。稍调整滑块位置，使得液柱的位置完全在其中一个铜柱的内部。

在开始运行后，控制程序按如下流程进行控制：

a. 分别控制两个铜柱上的加热器，使铜柱升温，并分别设置在约50℃（对应初始时液柱在其内部的铜柱，在此例中称为铜柱100）和约103℃（初始时液柱不在其内部的铜柱，在此例中称为铜柱300）。铜柱100需要约5 s从室温达到约50℃，铜柱300需要约30 s从室温达到约103℃。此步骤约30 s完成。

b. 液体在铜柱100内停留30 s。

c. 将铜柱100的温度升至58℃，此步骤约1 s完成。

d. 将滑块向铜柱300方向移动约18 mm，液体在铜柱300内停留10 s，然后开启风扇。

e. 液体在铜柱300内停留4 s。

f. 将滑块向铜柱100方向移动约18 mm，此时液柱完全处于铜柱100的内部。此步骤约0.25 s完成。

g. 液体在铜柱100内停留6 s。

h. 开启LED，获取铜柱100内导光孔的荧光图像并计算孔内总强度，关闭LED。此步骤约0.2 s完成。

i. 将滑块向铜柱300方向移动约18 mm，此时液柱完全处于铜柱300的内部。此步骤约0.25 s完成。

j. 回到步骤e，并继续重复29次循环（总计30个循环）。

k. 铜柱100和铜柱300均停止加热，自然降温，关闭风扇。

此流程总计耗时约400 s，对RT-qPCR反应液完成了逆转录和30个热循环。图14中给出了在上述qPCR反应液体中加入约10 ng 由HeLa细胞中提取的RNA，和上述qPCR反应液未加入模板RNA在此装置上运行的两条荧光强度曲线。从图中可以看出，加入RNA模板的反应液曲线呈常见qPCR扩增的S型曲线；而不含模板分子的反应液曲线在30个循环后几乎没有变化。

此例结果表明，此装置可以用于检测样品中是否存在特定序列的RNA模板分子。

实施例4：对某待测样品中的特定序列的DNA定量

在本例中的装置、管型组件均与实施例2中相同。管型组件在本例中称为石英管组件。

在本例中，液体11是一种qPCR反应液，其目的在于与样品混合后，对其中特定特征序列的DNA进行定量。此qPCR反应液含有：1x KAPA SYBR FAST qPCR mix (KAPABIOSYSTEMS)，1 μM正向引物，1 μM反向引物。正向引物、反向引物、扩增产物的序列与实施例1相同。

在定量中使用了5个标准样品和一份待测样品，均由一份已知模板DNA浓度的样品逐次稀释得到。标准样品和待测样品中含有模板DNA浓度如下表所示：

样品名称	模板DNA分子浓度
		标准样品1	1.0*10<sup>5</sup> / μl
标准样品2	2.5*10<sup>4</sup> / μl
		标准样品3	6.2*10<sup>3</sup> / μl
标准样品4	1.6*10<sup>3</sup> / μl
		标准样品5	3.9*10<sup>2</sup> / μl
待测样品	待测

在运行前，配制好约120 μl的上述qPCR反应液。取6个1.5 ml小管，每个管中各加入18μl的上述qPCR反应液。将1.5 ml小管按上述样品名称编号后，加入对应样品2 μl。将各管中的液体混匀后，转移至6个对应编号的石英管组件中，并各自加入0.5 μl液体石蜡。之后将石英管组件离心，液体在管底形成约12 mm长的一段液柱。

对于每个石英管组件，均各自放入装置中，并按如下程序对装置进行控制：

a. 分别控制两个铜柱上的加热器，使铜柱升温，并分别设置在约103℃（对应初始时液柱在其内部的铜柱，在此例中称为铜柱300）和约56℃（初始时液柱不在其内部的铜柱，在此例中称为铜柱100）。铜柱300需要约10-30 s从初始状态达到约103 ℃，铜柱100需要约5-10s从室温达到约56℃。此步骤约10-30 s完成。

b. 液体在铜柱300内停留10 s，然后开启风扇。

c. 液体在铜柱300内停留4 s。

e. 液体在铜柱100内停留6 s。

h. 回到步骤c，并继续重复39次循环（总计40个循环）。

i.铜柱100和铜柱300均停止加热，自然降温，关闭风扇。

此流程每次运行耗时约460-480 s。

图15表示了将每个样品在40个循环中，该样品采集的荧光值最低点和最高点分别归一化后的6条荧光强度曲线。图中y轴0代表该曲线荧光最低值，1代表该曲线荧光强度最高值。在图中y=0.2处可以画一条阈值线（图中用虚线表示）。在下表中列出阈值与各条曲线交点的x坐标。.

	阈值与曲线交点x坐标
		标准样品1	18.31
标准样品2	21.19
		标准样品3	23.18
标准样品4	25.84
		标准样品5	28.05
待测样品	23.19

图16中表示此次实验中，标准样品中DNA模板浓度的对数与各条曲线的x轴坐标呈线性关系，并可以通过线性拟合给出具体公式。对于未知样品，可以依照此线性关系换算成浓度。在本例中，根据待测样品阈值与对应曲线交点x轴坐标，根据直线拟合公式求算出未知样品对应浓度为6.7*10³ / μl。

此例表明，应用此装置可以对样品中特定DNA浓度进行定量。

Claims

1.一种用于进行热循环的装置，其组件包括： N个金属块（），每个金属块上连接有对应的控温加热装置； M个连接组件，，每个连接组件位于相邻两个金属块之间，用于连接上述N个金属块；每个金属块和每个连接组件的内部包含有1个或数个通孔，使得所有N个金属块和M个连接组件上对应的通孔同心且准直，构成1个或数个互相平行的通孔；管型组件，其上包含1个或数个空心、单端封闭、可盛装液体的柱形管，并部分或完全插入由上述金属块和连接组件形成的1个或数个通孔中，在通孔中轴向一维移动，形成与通孔轴向平行的移动路径；液体，位于管型组件柱形管的底部，随管型组件的移动路径在N个金属块之间移动。

2.根据权利要求1所述的装置，每个金属块都存在与其相对应的位置区间，使得管型组件位于第i个位置区间内时（），液体位于第i个金属块的内部。

3.根据权利要求1所述的装置，所述的管型组件插入对应的通孔后，管型组件外壁与金属块内壁之间的间隙小于或等于0.1 mm，优选小于或等于0.05mm。

4.根据权利要求1所述的装置，其特征在于，连接组件的整体或部分由低导热系数的材料组成，其导热系数不高于5W/(m*K)，例如塑料、橡胶、玻璃、陶瓷中的一种或几种。

5.根据权利要求1所述的装置，所述柱形管的未封闭端连接有附加部分，该附加部分可以引导液体加入柱形管中，或从连接附加装置的一端封闭柱形管，或使管型组件固定在移动装置上。

6.根据权利要求1所述的装置，所述的金属块和控温加热装置通过螺纹、焊接、胶粘中的一种或数种组合的方式连接。

7.根据权利要求1所述的装置，所述的控温加热装置包括用于对控温加热装置加热的加热元件；和用于读取控温加热装置的温度的温度探头。

8.根据权利要求7所述的装置，所述的加热元件和温度探头通过螺纹、焊接、胶粘中的一种或数种组合的方式连接于控温加热装置的表面或内部。

9.根据权利要求1所述的装置，其中N个金属块中温度较低的金属块上有增强散热组件。

10.根据权利要求9所述的装置，所述增强散热组件为位于金属块上用于增加金属块表面积的一个或多个槽、孔、柱，或为位于金属块附近用于增强空气流动的组件，或为位于金属块内部的流道，流道中通过温度较低的流体，或为与金属块接触的低温物体。

11.根据权利要求1所述的装置，金属块中包含用于传导从金属块外部射入金属块内部和从金属块内部射出金属块外部的光线的导光孔。

12.根据权利要求11所述的装置，所述导光孔在每个金属块中的数量为1个或者多个。

13.一种对液体实现变温的方法，其特征在于，使用权利要求1-12任一项所述的装置进行变温，每个金属块由控温加热装置固定在设定温度，N个金属块固定在至少两个不同温度上，管型组件在通孔中轴向一维移动，形成与通孔轴向平行的移动路径，通过在不同温度的金属块间移动管型组件，来快速变化管型组件内液体的温度，管型组件从第i₁个位置区间沿移动路径移动到第i₂个位置区间（i₁，i₂ ，且i₁ i₂）并在第i₂个位置区间停留一段时间；液体的温度在此段时间内接近或达到第i₂个金属块的温度。

14.根据权利要求13所述的方法，其特征在于，管型组件在不同位置区间循环往复移动以进行多个变温循环。

15.根据权利要求13所述的方法，其特征在于，通过负反馈方式控制加热元件的加热功率来控制可控温加热装置的温度。

16.根据权利要求13所述的方法，其特征在于，透过导光孔向液体发出包含一种或多种特定波段的激发光，用于激发液体中包含的特定荧光分子，液体中包含的特定荧光分子发出特定光谱的发射光，发射光透过一个或者多个导光孔后被检测到。

17.权利要求1－12任一项所述的装置或权利要求13－16任一项所述的方法，扩增PCR反应液中模板分子，检测样品中是否存在特定序列DNA、RNA分子，检测样品中特定序列核酸浓度中的应用。