CN109310734A

CN109310734A - 骨关节炎的治疗或预防方法

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Publication number: CN109310734A
Application number: CN201780036627.4A
Authority: CN
Inventors: T·J·M·威尔汀; M·M·J·卡洛
Original assignee: Medical Center Of Maastricht University; Universiteit Maastricht
Current assignee: Medical Center Of Maastricht University; Universiteit Maastricht
Priority date: 2016-04-13
Filing date: 2017-03-31
Publication date: 2019-02-05
Anticipated expiration: 2037-03-31
Also published as: US11872264B2; DK3442558T3; US11141461B2; AU2017249629A1; CN109310734B; BR112018071214A2; EP3442558B1; US10617739B2; ZA201806806B; EA201892320A1; US20200261538A1; WO2017178251A1; EA037111B1; AU2017249629B2; EP3442558A1; ES2837003T3; CA3020630A1; US20190125837A1; US20220023386A1

Abstract

本发明属于医学领域，并且提供治疗、预防或改善骨关节炎的手段和方法。更具体地，本发明提供肽，其用于治疗、改善或预防骨关节炎，其中所述肽的长度在12和28个氨基酸之间，并且包含根据SEQ ID NO:16的氨基酸序列或其根据式2的变体，其中所述肽的氨基酸序列包含在SEQ ID NO:34或其根据式1的变体中。

Description

骨关节炎的治疗或预防方法

技术领域

本发明属于医学领域，并且提供治疗、预防或改善骨关节炎的手段和方法。

背景技术

骨关节炎(OA)是一种关节疾病，其由关节软骨和下方的骨的破坏引起，伴有包括滑液炎症的整体关节病理以及纤维化和半月板病理。最常见的症状是关节疼痛和僵硬。起初，症状可仅在运动后发生，但随时间推移会变得持续。其他症状可包括关节肿胀、运动范围减小，并且当背部受OA影响时，可存在手臂和腿部的无力或麻木。最常涉及的关节是在手指末端附近的，在拇指、颈、下背部、膝和髋的基部处的那些关节。身体一侧的关节通常比另一侧的那些关节更受影响。通常，问题持续多年。这可影响工作和正常的日常活动。与其他类型的关节炎不同，通常仅关节受影响。

原因包括先前的关节损伤、异常的关节或肢体发育、异常的关节排列和遗传因素。在超重、单腿长度不同、和工作导致高水平的关节应力的那些人群中风险较大。认为骨关节炎由对关节的机械应力和低度炎症过程引起。其随着软骨损失而发展，最终下方的骨会受到影响。还认为软骨下骨在疾病病因中发挥决定性作用。由于疼痛可以使得难以锻炼，可发生肌肉损失。诊断通常基于体征和症状，其中医学成像和其他试验偶尔用于支持或排除其他问题。与主要是炎性病症的类风湿性关节炎不同，关节通常不变热或变红。

治疗包括运动、减少关节应力的努力、互助小组(support group)、关节润滑和(局部)止痛药。减少关节应力的努力包括休息和使用拐杖。体重减轻可有助于超重的那些人群。止痛药可包括扑热息痛(对乙酰氨基酚)。如果这不起作用，则可以使用口服给予的NSAID例如萘普生，或可以使用局部给予的皮质激素(例如曲安奈德)，但这些药物伴有较大的副作用。如果使用阿片类药物，由于成瘾的风险而通常仅推荐短期。如果尽管有其他治疗，但疼痛或运动限制仍干扰正常生活，则关节置换手术可有所帮助。然而，人工关节仅持续有限的时间，并且全关节置换手术伴有严重的并发症如脊髓炎。对患有骨关节炎的大多数人而言，全关节置换后的预后良好。

OA是关节炎的最常见形式，截至2010年膝髋关节疾病影响了约3.8％的人群。在60岁以上的那些人中，约10％的男性和18％的女性受影响。这是约2％的老年人承受残疾的原因。在澳大利亚约190万人受影响，在美国约2700万人受影响。在45岁以前，其在男性中更常见，而在45岁以后，其在女性中更常见。随着人变老，其在两种性别中都变得更常见。

虽然OA是可引起总的软骨损失和对其他关节组织的形态学损伤的关节变性病，在OA发展的最早阶段发生更微细的生物化学变化。健康软骨的水含量通过压缩力驱除水和膨胀压吸入水来精细平衡，并由明显的渗透组织压力支持。胶原纤维施加压缩力，而吉布斯-唐南效应(Gibbs–Donnan effect)和软骨蛋白多糖产生倾向于吸入水的渗透压。

然而，在OA开始时，胶原基质变得更无序，并且存在软骨内蛋白多糖含量的减少。胶原纤维的分解导致水含量的净增加。此类增加发生是因为尽管存在蛋白多糖的总体损失(和因此减小的渗透拉力(osmotic pull))，但其被胶原蛋白的损失超过。在没有蛋白多糖的保护作用的情况下，软骨的胶原纤维可变得易于降解，从而加剧变性。还会发生滑膜(关节腔内衬(lining))和周围关节囊的炎症，尽管通常是轻微的(与类风湿性关节炎中发生的相比)。

表征OA的关节软骨和关节软骨细胞的改变类似于通过软骨骨化驱动骨骼发育的细胞发育过程。软骨骨化与OA进展之间的类比已被广泛认可。由生长板中的肥大软骨细胞分泌的很多软骨降解酶也是OA病症进展和恶化的核心。另外，发现控制生长板中的软骨细胞分化的公知途径(RUNX2、COL10A1、ALP)在OA关节软骨细胞中也是活跃的或失调的。

关节内的其他结构也会受影响。关节内的韧带变厚并纤维化，并且半月板可变得受损和磨损。到个人接受关节置换时，半月板可完全消失。新的骨生长物，称为"骨刺"或骨赘，可在关节的边缘形成，这可能是试图在没有半月板的情况下改善关节软骨表面的匹配度(congruence)。软骨下骨体积增加并且变得较不矿化(骨质疏松/骨质减少)。所有这些变化可引起上覆的软骨层的功能和机械支持的问题。骨关节炎关节中的疼痛已与增厚的滑膜和软骨下骨损害相关。

生物化学上，OA的特征在于合成细胞外基质(ECM)降解酶，例如聚集蛋白聚糖酶(aggrecanase)(含I型血小板结合蛋白基序的解聚蛋白样金属蛋白酶(disintegrin andmetalloproteinase with trombospondine motifs，ADAMTS))和基质金属蛋白酶(MMP)，导致软骨组织基质的主动破坏。已认识到软骨骨化和OA进展之间的类比，并且由生长板中的肥大软骨细胞分泌的很多软骨降解和矿化酶也关键性地参与OA。

尽管在理解疾病机理中取得了进展，但OA的已确立的和实验性的治疗主要是通过减轻疼痛和干扰软骨变性过程以推迟全关节置换的对症治疗。

发明内容

本发明涉及一种肽，其用于治疗、改善或预防骨关节炎，其中所述肽的长度在12和28个氨基酸之间，并且含有根据SEQ ID NO:16的氨基酸序列或其根据式2的变体，其中所述肽的氨基酸序列包含在SEQ ID NO:34或其根据式1的变体中。

式1：

X1 X2 X3 G Y X4 A X5 Y S E G X6 S X7 X8 X9 L X10 X11 X12M N A T X13HA

(SEQ ID NO:47)

其中

X1＝A或I或L或M或Y或V或E或H或K或Q或R，

X2＝P或Y或M，

X3＝E或R或H或K或N或P或Q或S或T或I或L或M或V，

X4＝A或E或Q或R或S，

X5＝Y或N或D，

X6＝E或A或Q，

X7＝A或D或E或H或K或S，

X8＝F或A或D或E或H或Q或R或S，

X9＝P或M，

X10＝N或A或D或S或T或E或Q或R或I或V，

X11＝S或A或D或E或H或K或N或P或Q或T，

X12＝Y或H或D或G或H或N或R或S或T或者其中

X13＝N或F或W或Y或H或K或R。

式2：

Y S E G X6 S X7 X8 X9 L X10 X11(SEQ ID NO:48)

其中

X6＝E或A或Q，

X7＝A或D或E或H或K或S，

X8＝F或A或D或E或H或Q或R或S，

X9＝P或M，

X10＝N或A或D或S或T或E或Q或R或I或V或者其中

X11＝S或A或D或E或H或K或N或P或Q或T。

具体实施方式

骨关节炎软骨细胞显示典型的表型，其特征在于软骨形成基因SOX9、COL2A1、ACAN和BAPX1/NKX3.2的降低的表达，以及肥大基因RUNX2、COL10A1、ALP，编码软骨基质降解酶的基因MMP13、ADAMTS5，和炎性基因COX-2和IL-6的增加的表达(图1)。我们在本文中示出，称为骨形态发生蛋白-7(BMP-7，也称为OP-1)的蛋白能够拯救(rescuing)OA表型(图1)。我们的和先前的解决BMP-7的疾病调节特性的研究显示，BMP-7降低MMP13在暴露于IL-1β的软骨细胞中的表达，刺激OA软骨细胞中蛋白多糖合成，抵消炎性细胞因子(例如IL-1β)，并在健康软骨细胞中诱导合成代谢反应。大鼠中BMP-7的关节内给药保护免受OA发展并延迟OA的进展。1期临床试验已在OA患者中完成，并且在BMP-7的关节内注射后没有报告严重的不良事件。与此一致，本文记载的数据揭示BMP-7主动抑制(OA)软骨细胞肥大表型(图1)。

尽管有这些有希望的结果，但关节内使用全长重组人BMP-7用于OA治疗可能有临床使用的风险。临床前试验显示，每周关节内BMP-7注射是获得相关结果所需要的。由于脓毒性关节炎和患者不适的风险，此类高频率的关节内注射对临床使用来说是不可接受的。尽管防止频繁的关节内注射的解决方案将包括将BMP-7包封于关节内释放系统中用于长期控释，但由于通常适用于现存控释系统的生产过程的变性条件，保留BMP-7的生物活性将构成巨大挑战。其中可能递送BMP-7的OA滑液是苛刻的水解和蛋白水解环境，预期其会引起给予的BMP-7的快速降解。最终，GMP级BMP-7的生产在技术上要求高，兼具高成本。

为了保证和实现临床使用BMP-7活性的高度有利的特征用于OA治疗，我们寻求与苛刻的OA滑液环境更好地相容并且可以潜在地加入长期释放用关节内分子释放系统的BMP-7分子模拟物。为了该原因，我们开始制备一组重叠的20聚体(mer)肽(表1)，其总计覆盖139个氨基酸的完整的成熟BMP-7多肽(表4)。该结果证实了先前的发现[20,21]，即没有肽模仿BMP-7拯救OA表型的潜力。更详细地，试验了示于表1的所有肽的基因ALP、MMP13、ADAMTS5、COL10A、COX-2、BAPX1NKX3.2和RUNX2的表达，并且发现它们促进促肥大、促矿化、促分解代谢和促炎症反应。这不出乎意料，因为已描述了来自BMP-2[20]和BMP-7[21,31]促矿化/促成骨的肽。

表4：成熟BMP-7的氨基酸序列，半胱氨酸和丝氨酸残基加下划线。

然而，令人惊讶的是，当我们用丝氨酸残基替代BMP-7中的半胱氨酸残基时，我们的数据揭示在BMP-7内存在高度限定的区域，所述区域确实含有具有所寻求的BMP-7模拟活性的肽。

来自该区域的肽在本文中进一步称为“区域A肽”。来自该区域的连续肽在OA关节软骨细胞中导致OA软骨细胞表型标记COL10A1、ALP、RUNX2、ADAMTS5、IL-6、MMP13和COX-2的显著降低的表达，以及软骨形成标记SOX9、ACAN、BAPX1/NKX3.2和COL2A1的增加的表达。

一方面，本发明因此涉及一种肽，其用于治疗、改善或预防骨关节炎，其中所述肽含有至少根据SEQ ID NO:16的12个连续氨基酸的氨基酸序列。这是从示于表2的结果推出的。

表2显示在根据本发明使用的几种肽的存在下几种基因的表达分析的结果。进一步的细节在实施例部分中提供。

我们的实验还揭示，该肽具有28个氨基酸左右的最大长度。这是从示于表2和3的实验推出的，其中显示该肽优选完全包含在序列APEGYAAYYSEGESAFPLNSYMNATNHA(SEQ IDNO:34)中。在NH₂末端或COOH末端延伸超过该氨基酸序列的各肽在如本文所用的分析中丧失其活性。表3还显示根据本发明使用的肽的一些实例。

当然，该描述不应解释得如此狭窄以至于在肽中不允许变化。本领域技术人员知道如下事实：即使当一个或多个，例如两个、三个、四个或甚至五个氨基酸改变时，肽的构象也是保守的，特别是当这些改变涉及保守氨基酸取代时。这些肽在本领域中称为同源肽。因此，如本文所用的术语“同源物”指的是保留其活性但在氨基酸序列方面不同的肽。同源物可以与根据SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:34的序列75％相同，或更多，例如77、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％相同。

如本文所用的，两个以上的氨基酸序列之间的同一性的程度等同于序列所共有的相同位置数的函数(即，％同一性＝相同位置数除以位置的总数×100)，排除两个序列的最佳比对所需要引入的空位(gap)、以及突出(overhang)。序列的比较和两个以上的序列之间的百分比同一性的测定可以使用本领域已知的标准方法实现。例如，常规用于该目的的免费软件为NCBI资源的“Align”工具

http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi？PAGE_TYPE＝BlastSearch&BLAST_SPE C＝blast2seq&LINK_LOC＝align2seq。

在优选的实施方案中，两个序列的比对在多肽的全长上进行。

如本文所用的，根据上下文，术语“可(may)”涵盖词语“可以(can)”，并且术语“可以是(may be)”涵盖词语“是(is或are)”。此外，词语“可”的存在旨在解释用于实施或实现本公开的选项，但不限于此。

我们得出结论，如本文所述的人BMP-7源肽能够模仿全长人BMP-7蛋白对OA软骨细胞表型的有利特性。

我们随即确定了BMP-7的OA表型抑制作用的位置和性质，而来自BMP-7中其他区域的肽显示无活性或促矿化/促肥大作用。候选肽的生物活性效力意外地高。独立于试验的浓度(试验了1000、100、10和1纳摩尔(nanomolar，nM))，几乎所有区域A肽在筛选中都诱导相似倍数改变的基因表达数量级差异，而对照肽(SEQ ID NO:49)则不会。

BMP-7具有独特的OA软骨细胞表型抑制作用(图1)。当使用约1nM的BMP-7浓度时，该作用是最明显的。高于1nM的BMP-7浓度(例如10nM或100nM)对软骨细胞表型具有相反或负面的作用，因此不利地引起增加的肥大水平、增加的矿化、增加的软骨分解基因表达和增加的炎性基因表达。不希望受理论约束，我们推测BMP-7结合了依赖于BMP-7浓度的双重活性。

与BMP-7多肽相比，独立于试验浓度(试验了1000、100、10和1nM)，根据SEQ ID NO:2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14和15的20聚体肽有效抑制OA软骨细胞表型。由此我们意外地识别了包含BMP-7的有利的OA表型抑制生物活性的区域，而来自BMP-7中其他区域的肽显示促矿化、促肥大、促分解代谢和促炎症作用。

在OA软骨细胞暴露于单独的肽24小时之后，当每秒将肽补充至OA软骨细胞培养物直至培养10天时，候选肽的OA表型抑制作用高度有效。令人惊讶地，如本文所公开的肽的OA表型抑制作用在单次初始48小时暴露后在培养中甚至持续长达8天。

纳摩尔范围浓度下的高度生物活性类似于全长成熟BMP-7，并且是治疗上重要的决定因素，这表明根据本发明使用的肽确实是用于OA治疗用途的强力的BMP-7模拟物。

除了肽对OA软骨细胞的作用以外，候选肽在软骨形成分化用体外模型中显示生物学上相似的作用。值得注意的是，8天的单次暴露，甚至在使软骨祖细胞(ATDC5)分化的持续肽暴露下更明显地，稳定地减少肥大和矿化标记的表达，而聚集蛋白聚糖表达(健康软骨细胞标记)和BAPX1/NKX3.2表达(抗肥大因子)甚至在持续暴露于根据本发明使用的肽的情况下进一步增加。

总之，根据本发明使用的肽对肥大/矿化OA软骨细胞表型具有独特的抑制作用，抑制软骨ECM降解酶的表达，并且降低炎性OA软骨细胞表型，而同时支持对OA软骨细胞和健康软骨细胞的促软骨形成作用。与全长成熟BMP-7蛋白相反，肽可有利地用于治疗，这是因为它们通常对构象和酶促失活较不敏感。肽可进行生物化学上的微调(fine-tuned)以增加其稳定性和活性；功能化用于载体；更小并因此适合并入用于长期关节内释放的应用专用释放系统中。

可合成如上所述的肽的变体，该变体对滑液中的蛋白水解降解的降解更具抗性。此外，可制备更受构象限制的从而相比于其原始前导序列更具生物活性的变体。这在本领域技术人员能实现的范围内，并且既然区域A已识别为BMP-7的合成代谢活性的活性区域，那么就只需要常规技术。

这类变体可包括线性肽(linear peptide)、线性逆反肽(linear retro inversopeptide)、逆反肽、环肽、带单环的肽(mono-looped peptide)、和带双环的肽(two-loopedpeptides)。CLIPS技术使得可以常规生产这类肽(http://www.pepscan.com/therapeutics/clips-platform)。带双环的肽可含有两种相同的如本文所述的肽或两种不同的如本文所述的肽。

除了甘氨酸以外的所有α氨基酸可以以是彼此的镜像的称为L或D氨基酸的两种对映异构体或手性变体中的任一种存在。虽然L-氨基酸代表在核糖体的翻译期间发现于蛋白质中的所有氨基酸，在真核翻译的蛋白质中却很少发现D-氨基酸。由于核糖体对L-氨基酸是特异性的，D-肽很少天然存在于生物体中，并且因此不易消化或降解。

L-肽具有由L和D氨基酸构建的三种类似序列：D-对映异构体或反向肽(inverso-peptide)，其具有相同序列、但由D-氨基酸和镜像构象组成；逆向肽(retro-peptide)，其由L氨基酸的相同序列组成、但为倒序；和逆反肽或D-逆向-对映异构体肽，其由D-氨基酸以相反序列组成。虽然L-肽和其D-对映异构体是彼此的镜像结构，但L-逆向-肽是D-逆反肽的镜像。另一方面，L-肽和D-逆反肽共享相似的侧链排列，尽管它们的羧基和氨基指向相反的方向。对于不依赖于二级结构来结合的小肽来说，L-肽和其D-逆反肽可能与靶L-蛋白具有相似的结合亲合力。

当肽成环例如环肽时，它们可以更具活性。这类肽还可对蛋白水解降解更稳定和具抗性。

这类肽和多肽可在对多肽有害的环境例如水解或蛋白水解环境中更稳定。特别是对于治疗目的，使用更稳定的肽例如上述肽可为有利的。因此，本发明还涉及使用选自由线性肽、线性逆反肽、逆反肽、环肽、带单环的肽、和带双环的肽组成的组的肽。

使肽不易降解的方法是本领域已知的，例如包含一种或多种非天然氨基酸例如L-氨基酸的D-对映异构体，以及使逆反变体中肽骨架逆向取向。这些肽是非天然的，因此天然的蛋白酶不能将它们切割。

增加根据本发明使用的肽的生物活性的手段和方法是本领域已知的。这类技术的实例为肽的环化(cyclization)和成环(looping)，其提供了必需氨基酸残基的较受约束的构象背景。

专利申请US2006/0058231公开了具有改善的性质的BMP-7变体。该文献通过引用并入本文。US2006/0058231公开了BMP-7的一些氨基酸可以用其他氨基酸取代，而不影响BMP-7蛋白的功能。

作为上述氨基酸取代的结果，BMP-7的改善的性质包括：增加的表达产量、在不存在前结构域(pro-domain)的情况下表达、增加的溶解度、增加的稳定性、增加的特异性生物活性、改变的受体特异性、改变的受体结合亲合力、改变的共同受体特异性、改变的共同受体结合亲合力、增加的与头蛋白的结合、减少的与头蛋白的结合、和降低的免疫原性。

对于区域A氨基酸，这意为SEQ ID NO:34的1-3、6、8、13、15–17、19–21和26位处的氨基酸可以改变或取代，而不影响BMP-7的活性。在一些情况下，这些改变(氨基酸取代)甚至改善了BMP-7的活性。

因此，对应于SEQ ID NO:34的区域还可如式1所示来描述：

式1：

其中

X1＝A或I或L或M或Y或V或E或H或K或Q或R，

X2＝P或Y或M，

X3＝E或R或H或K或N或P或Q或S或T或I或L或M或V，

X4＝A或E或Q或R或S，

X5＝Y或N或D，

X6＝E或A或Q，

X7＝A或D或E或H或K或S，

X8＝F或A或D或E或H或Q或R或S，

X9＝P或M，

X10＝N或A或D或S或T或E或Q或R或I或V，

X11＝S或A或D或E或H或K或N或P或Q或T，

X12＝Y或H或D或G或H或N或R或S或T或者其中

X13＝N或F或W或Y或H或K或R。

上述根据式1的肽可以视为根据SEQ ID NO:34的肽的等同物或变体。在本发明的一个实施方案中，SEQ ID NO:34的变体包含选自由取代X1、X2、X3、X4、X5、X6、X7、X8、X9、X10、X11、X12和X13组成的组的12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸取代。

因此，对应于SEQ ID NO:16的区域因此还可如式2所示来描述：

式2：

其中

X6＝E或A或Q，

X7＝A或D或E或H或K或S，

X8＝F或A或D或E或H或Q或R或S，

X9＝P或M，

X10＝N或A或D或S或T或E或Q或R或I或V或者其中

X11＝S或A或D或E或H或K或N或P或Q或T。

上述根据式2的肽可以视为根据SEQ ID NO:16的肽的等同物或变体。在本发明的一个实施方案中，SEQ ID NO:16的变体包含选自由取代X6、X7、X8、X9、X10和X11组成的组的5、4、3、2或1个氨基酸取代。

式1和2中以粗体印刷的氨基酸表示根据SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:34(野生型序列)的肽中应优选不改变或取代的氨基酸。X1–X13位处的优选的氨基酸加下划线。这些表示相应位置处的野生型氨基酸。

附图说明

图1：BMP-7拯救OA相关软骨细胞表型。

骨关节炎软骨细胞显示典型的表型，其特征在于SOX9、COL2A1、ACAN和BAPX1/NKX3.2的降低的表达和RUNX2、COL10A1、ALP、MMP13、ADAMTS5、COX-2和IL-6mRNA的增加的表达(参见左图)。BMP-7(1nM)能够通过归一化上述基因的表达来拯救该OA相关软骨细胞表型(左图)。

在OA软骨细胞的BMP-7处理后，也归一化了细胞裂解物中的功能性ALP酶活性和培养基中的PGE2分泌(右图)。

相对于对照条件，通过RT-qPCR测定图示mRNA的表达(对于28S rRNA表达归一化)。图中，误差条表示平均值±SEM，相比于健康条件来计算统计学差异。*＝p<0.05。

图2-8：BMP-7源肽对原代人OA关节软骨细胞的作用。

对2次传代的OA人关节软骨细胞的经验证池(validated pool)(n＝18)，测定SEQID NO:2-15(具有1个氨基酸间隔的肽(19个氨基酸重叠))和SEQ ID NO:49的20聚体肽(10nM)对图示基因的表达的作用，并与全长重组BMP-7(1nM)比较。24小时后收获样品并通过RT-qPCR分析图示的基因(针对28S rRNA的表达并相对于对照条件(无肽暴露)来校正)。图中，x轴上的数字表示根据其SEQ ID NO:的单个肽，误差条表示中间值±SEM，相对于对照条件计算统计学差异(单向ANOVA和邦弗伦尼校正(bonferroni correction))。*＝p<0.05对于COL10A1、ALP、RUNX2、COX-2、MMP13和ADAMTS5来说低于对照条件，对于BAPX1/NKX3.2来说高于对照条件。随机肽是根据SEQ ID NO:49的具有氨基酸序列SFILKKVLYDRVNDSANIYS的肽。

图9：示出在对照肽、BMP-7和根据SEQ ID NO:16的肽的存在下，从OA患者分离的软骨细胞中COL2A1、Col10A1、COX-2和RUNX2的相对表达的图。

图10：示出在对照肽、BMP-7和根据SEQ ID NO:16的肽的存在下，来自OA患者的软骨外植体中的COL10A1和MMP13的相对表达的图。

实施例

实施例1：在OA滑液的存在下，BMP-7肽的OA软骨细胞表型抑制作用。

我们分析了在20％(v/v)OA滑液(SF)的存在下，来自区域A的候选肽对原代OA关节软骨细胞的OA表型抑制作用。从各自试验三次的三个单独的OA软骨细胞分离物(n＝3)合并数据。接种的2次传代的OA软骨细胞在不存在或存在OA滑液的情况下暴露于100nM肽，并在24小时后分析基因COL10A1、ALP、RUNX2、COL2A1、ACAN、SOX9、COX-2、IL-6、PGE、MMP13和ADAMTS5的mRNA表达(针对28S rRNA的表达并相对于对照条件(无肽暴露)来校正)。

通过EIA分析培养物上清液中的PGE2分泌，并通过内部开发的ALP活性用比色分析测定ALP酶活性。通过比色爱茜蓝分析测定GAG含量。

结果评分为+或–，其中+意为肽降低基因COL10A1、ALP、RUNX2、COX-2、IL-6、PGE、MMP13和ADAMTS5的活性或者增加COL2A1、ACAN和SOX9的活性。对于ALP活性，+意为降低的活性，对于GAG活性，+意为增加的活性。

实施例2：ATDC5细胞的软骨生成分化中BMP-7的肥大抑制作用。

在存在或不存在1nM来自区域A的肽的情况下，使用标准实验方案分化ATDC5细胞8天。在分化开始时和每次培养基更换时(多次)、或者仅在分化开始时而不在每次培养基更换时(单次)加入肽。在分化的第8天，收获样品，并通过RT-qPCR分析基因COL10A1、ALP、RUNX2、ACAN和BapX/Nkx3.2(针对b-激动蛋白的表达并相对于t＝0来校正)。

实施例3：OA的离体模型中OA抑制作用的评估。

根据本发明使用的肽还可在离体试验中研究：来自TKA(K&L等级2-3)的股骨踝的全厚度软骨活检切片(biopsies)(3mm穿孔(punches))可在手术后直接新鲜收获，每位患者随机分组，并如上所述进入离体培养。来自患者的活检切片可在24小时后暴露于0.1、1、10或100nM的所选的肽7、14或21天，并且可以每天用新鲜的肽更换培养基。

1nM的BMP-7可用作阳性对照，载体或随机肽可用作阴性对照。暴露后，可以处理软骨活检切片以解决主要的软骨质量确定参数。可测定每湿重的DNA含量和GAG含量。还可研究ALP酶活性。可分析培养基中的PGE2和GAG分泌。可以测定如本文所述的主要OA软骨细胞表型标记基因的基因表达。

作为暴露于肽的结果的活检切片中的局部OA相关改变可以通过(免疫)组织化学分析(ALP、COL10A1、RUNX2、COL2A1、SOX9和COX-2的爱茜蓝和免疫染色)，从而进一步支持如本文所述的肽适用于OA的医学用途这一观点。

肽扩散和定位至软骨活检切片中可以在类似的设置中处理，所述设置中可使用肽的生物素化变体。培养后，可以处理这些活检切片用于组织化学。扩散至软骨活检切片中的肽可通过链霉抗生物素-Alexafluor 488介导的检测来荧光可视化。该方法还可有助于通过MALDI-IMS可视化肽的表型背景和定位，并且帮助将其与潜在的内源性BMP-7片段区分开。

实施例4：体内试验。

区域A的氨基酸序列在人和小鼠之间是100％同源的。为了进一步确定根据本发明使用的肽的体内活性，可在广泛接受的创伤后OA用模型、即DMM模型中试验代表性的肽。在12周龄C57BL/6小鼠中内侧半月板会不稳定。DMM诱导1周后，可如上所述通过每周两次的注射来关节内给予肽。剂量可基于关节内BMP-7研究，其中将250ng BMP-7每周注射至大鼠膝关节中(以100μl)显示有利的结果。由于可以在OA小鼠关节中注射10μl，每膝关节可以注射该体积下的等量的25ng肽。2.5和0.25ng肽的量还可在另外2组中试验，从而确定肽的药理学效力。盐水注射可用作对照。该实验的样品大小有利地为每组8只小鼠。可在肽处理开始后的连续时间点处死动物(2、4、8周)。膝关节可进行(免疫)组织化学分析和OARSI评分(番红(Safranin)-O；改良的Pritzker)。

实施例5：来自OA患者的分离的软骨细胞的处理

从OA患者分离的软骨细胞(n＝6)用BMP-7(1nM)或根据SEQ ID NO:16的12聚体肽(1nM)处理24h。促软骨形成(图9A)和肥大(图9B、9C和9D)基因表达通过qRT-PCR测定，并且对于28S rRNA水平归一化。这些结果证实我们先前的发现，即BMP-7或12聚体诱导促软骨形成基因如Col2a1的上调(A)，以及促肥大基因如COL10A1、COX-2和RUNX2的下调(B、C、D)。这些结果显示来自区域A肽的核心序列的模拟BMP-7的生物活性。

实施例6：软骨外植体的处理。

从OA患者的膝关节软骨的非病变区取4mm²软骨外植体(n＝5)，并且随机分配至不同的实验处理条件(每处理组4个外植体)。24h平衡期后，用BMP-7(1nM)或根据SEQ ID NO:16的12聚体肽(10nM)处理外植体24h。肥大基因表达通过qRT-PCR测定并对于28S rRNA水平归一化。在用BMP-7或12聚体处理后，我们观察到促肥大基因如Col10a1(图10A)和MMP13(图10B)的下调。这些结果与上述作用一致，并显示根据本发明的肽的模拟BMP-7的生物活性。

实施例7：软骨外植体的染色

将获自2位患者的软骨外植体在BMP-7(1nM)或10nM的BMP-7模拟肽GYAAYYSEGESAFPLNSYMN(SEQ ID NO:8)的存在下培养14天。作为细胞外基质(ECM)的重要组分的糖胺聚糖(GAG)用番红-O(红色)染色，其他组织用固绿(绿色/蓝色)复染。

与对照相比，两位患者都在BMP7和肽GYAAYYSEGESAFPLNSYMN(SEQ ID NO:8)处理的外植体中显示增加的番红-O强度。

这些结果与上述作用一致，并且显示根据本发明的肽的模拟BMP-7的生物活性。

实施例8：软骨外植体的处理。

3mm²的软骨外植体取自OA患者的膝软骨(n＝6)，并用BMP-7(1nM)、用10nM的肽GYAAYYSEGESAFPLNSYMN(SEQ ID NO:8)或乱序的无关对照肽(10nM)处理14天。通过ELISA测定促肥大因子前列腺素E2(PGE2)水平。

来自OA患者的滑液组织样品(n＝6)用BMP-7(1nM)、用10nM的肽GYAAYYSEGESAFPLNSYMN(SEQ ID NO:8)或乱序的无关对照肽(10nM)处理24h。通过ELISA测定PGE2水平

来自OA患者的霍法脂肪垫(Hoffa’s fat pad)组织样品(n＝6)用BMP-7(1nM)、用10nM的肽GYAAYYSEGESAFPLNSYMN(SEQ ID NO:8)或乱序的无关对照肽(10nM)处理24h。通过ELISA测定PGE2水平。

来自OA患者的半月板组织样品(n＝6)用BMP-7(1nM)、用10nM的肽GYAAYYSEGESAFPLNSYMN(SEQ ID NO:8)或乱序的无关对照肽(10nM)处理24h。通过ELISA测定PGE2水平。

这些结果清楚地显示，在BMP-7或肽GYAAYYSEGESAFPLNSYMN(SEQ ID NO:8)处理后，降低软骨和周围组织中的PGE2水平。用乱序肽处理不引起PGE2水平的降低。

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序列表

<110> 马斯特里赫特大学(Universiteit Maastricht)

马斯特里赫特大学医学中心(Academisch Ziekenhuis Maastricht)

<120> 骨关节炎的治疗或预防方法

<130> 331 WO

<160> 49

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 33

<212> PRT

<213> 智人(homo sapiens)

<400> 1

Trp Ile Ile Ala Pro Glu Gly Tyr Ala Ala Tyr Tyr Ser Glu Gly Glu

1 5 10 15

Ser Ala Phe Pro Leu Asn Ser Tyr Met Asn Ala Thr Asn His Ala Ile

20 25 30

Val

<210> 2

<211> 20

<212> PRT

<213> 智人()

<400> 2

Trp Ile Ile Ala Pro Glu Gly Tyr Ala Ala Tyr Tyr Ser Glu Gly Glu

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20

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<400> 3

Ile Ile Ala Pro Glu Gly Tyr Ala Ala Tyr Tyr Ser Glu Gly Glu Ser

1 5 10 15

Ala Phe Pro Leu

20

<210> 4

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Ile Ala Pro Glu Gly Tyr Ala Ala Tyr Tyr Ser Glu Gly Glu Ser Ala

1 5 10 15

Phe Pro Leu Asn

20

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<400> 5

Ala Pro Glu Gly Tyr Ala Ala Tyr Tyr Ser Glu Gly Glu Ser Ala Phe

1 5 10 15

Pro Leu Asn Ser

20

<210> 6

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<400> 6

Pro Glu Gly Tyr Ala Ala Tyr Tyr Ser Glu Gly Glu Ser Ala Phe Pro

1 5 10 15

Leu Asn Ser Tyr

20

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<400> 7

Glu Gly Tyr Ala Ala Tyr Tyr Ser Glu Gly Glu Ser Ala Phe Pro Leu

1 5 10 15

Asn Ser Tyr Met

20

<210> 8

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<212> PRT

<213> 智人()

<400> 8

Gly Tyr Ala Ala Tyr Tyr Ser Glu Gly Glu Ser Ala Phe Pro Leu Asn

1 5 10 15

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20

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<400> 9

Tyr Ala Ala Tyr Tyr Ser Glu Gly Glu Ser Ala Phe Pro Leu Asn Ser

1 5 10 15

Tyr Met Asn Ala

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<400> 10

Ala Ala Tyr Tyr Ser Glu Gly Glu Ser Ala Phe Pro Leu Asn Ser Tyr

1 5 10 15

Met Asn Ala Thr

20

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Ala Tyr Tyr Ser Glu Gly Glu Ser Ala Phe Pro Leu Asn Ser Tyr Met

1 5 10 15

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Tyr Tyr Ser Glu Gly Glu Ser Ala Phe Pro Leu Asn Ser Tyr Met Asn

1 5 10 15

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20

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Tyr Ser Glu Gly Glu Ser Ala Phe Pro Leu Asn Ser Tyr Met Asn Ala

1 5 10 15

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20

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Ser Glu Gly Glu Ser Ala Phe Pro Leu Asn Ser Tyr Met Asn Ala Thr

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Glu Gly Glu Ser Ala Phe Pro Leu Asn Ser Tyr Met Asn Ala Thr Asn

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Tyr Ser Glu Gly Glu Ser Ala Phe Pro Leu Asn Ser

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Ala Pro Glu Gly Tyr Ala Ala Tyr Tyr Ser Glu Gly Glu Ser Ala Phe

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Tyr Ala Ala Tyr Tyr Ser Glu Gly Glu Ser Ala Phe Pro Leu Asn Ser

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Ala Ala Tyr Tyr Ser Glu Gly Glu Ser Ala Phe Pro Leu Asn Ser

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Tyr Ser Glu Gly Glu Ser Ala Phe Pro Leu Asn Ser Tyr Met Asn Ala

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Tyr Ser Glu Gly Glu Ser Ala Phe Pro Leu Asn Ser Tyr Met Asn Ala

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Tyr Ser Glu Gly Glu Ser Ala Phe Pro Leu Asn Ser Tyr Met Asn Ala

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Tyr Ser Glu Gly Glu Ser Ala Phe Pro Leu Asn Ser Tyr Met Asn Ala

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50 55 60

Tyr Tyr Ser Glu Gly Glu Ser Ala Phe Pro Leu Asn Ser Tyr Met Asn

65 70 75 80

Ala Thr Asn His Ala Ile Val Gln Thr Leu Val His Phe Ile Asn Pro

85 90 95

Glu Thr Val Pro Lys Pro Ser Ser Ala Pro Thr Gln Leu Asn Ala Ile

100 105 110

Ser Val Leu Tyr Phe Asp Asp Ser Ser Asn Val Ile Leu Lys Lys Tyr

115 120 125

Arg Asn Met Val Val Arg Ala Ser Gly Ser His

130 135

<210> 47

<211> 28

<212> PRT

<213> 智人()

<220>

<221> misc_特征

<222> (1)..(3)

<223> Xaa可以为任何天然存在的氨基酸

<220>

<221> misc_特征

<222> (6)..(6)

<223> Xaa可以为任何天然存在的氨基酸

<220>

<221> misc_特征

<222> (8)..(8)

<223> Xaa可以为任何天然存在的氨基酸

<220>

<221> misc_特征

<222> (13)..(13)

<223> Xaa可以为任何天然存在的氨基酸

<220>

<221> misc_特征

<222> (15)..(17)

<223> Xaa可以为任何天然存在的氨基酸

<220>

<221> misc_特征

<222> (19)..(21)

<223> Xaa可以为任何天然存在的氨基酸

<220>

<221> misc_特征

<222> (26)..(26)

<223> Xaa可以为任何天然存在的氨基酸

<220>

<221> UNSURE

<222> (1)..(1)

<223> The 'Xaa' at location 1 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.

<220>

<221> UNSURE

<222> (2)..(2)

<223> The 'Xaa' at location 2 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.

<220>

<221> UNSURE

<222> (3)..(3)

<223> The 'Xaa' at location 3 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.

<220>

<221> UNSURE

<222> (6)..(6)

<223> The 'Xaa' at location 6 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.

<220>

<221> UNSURE

<222> (8)..(8)

<223> The 'Xaa' at location 8 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.

<220>

<221> UNSURE

<222> (13)..(13)

<223> The 'Xaa' at location 13 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.

<220>

<221> UNSURE

<222> (15)..(15)

<223> The 'Xaa' at location 15 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.

<220>

<221> UNSURE

<222> (16)..(16)

<223> The 'Xaa' at location 16 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.

<220>

<221> UNSURE

<222> (17)..(17)

<223> The 'Xaa' at location 17 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.

<220>

<221> UNSURE

<222> (19)..(19)

<223> The 'Xaa' at location 19 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.

<220>

<221> UNSURE

<222> (20)..(20)

<223> The 'Xaa' at location 20 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.

<220>

<221> UNSURE

<222> (21)..(21)

<223> The 'Xaa' at location 21 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.

<220>

<221> UNSURE

<222> (26)..(26)

<223> The 'Xaa' at location 26 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.

<400> 47

Xaa Xaa Xaa Gly Tyr Xaa Ala Xaa Tyr Ser Glu Gly Xaa Ser Xaa Xaa

1 5 10 15

Xaa Leu Xaa Xaa Xaa Met Asn Ala Thr Xaa His Ala

20 25

<210> 48

<211> 12

<212> PRT

<213> 智人()

<220>

<221> misc_特征

<222> (5)..(5)

<223> Xaa可以为任何天然存在的氨基酸

<220>

<221> misc_特征

<222> (7)..(9)

<223> Xaa可以为任何天然存在的氨基酸

<220>

<221> misc_特征

<222> (11)..(12)

<223> Xaa可以为任何天然存在的氨基酸

<220>

<221> UNSURE

<222> (5)..(5)

<223> The 'Xaa' at location 5 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.

<220>

<221> UNSURE

<222> (7)..(7)

<223> The 'Xaa' at location 7 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.

<220>

<221> UNSURE

<222> (8)..(8)

<223> The 'Xaa' at location 8 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.

<220>

<221> UNSURE

<222> (9)..(9)

<223> The 'Xaa' at location 9 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.

<220>

<221> UNSURE

<222> (11)..(11)

<223> The 'Xaa' at location 11 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.

<220>

<221> UNSURE

<222> (12)..(12)

<223> The 'Xaa' at location 12 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.

<400> 48

Tyr Ser Glu Gly Xaa Ser Xaa Xaa Xaa Leu Xaa Xaa

1 5 10

<210> 49

<211> 20

<212> PRT

<213> 智人()

<400> 49

Ser Phe Ile Leu Lys Lys Val Leu Tyr Asp Arg Val Asn Asp Ser Ala

1 5 10 15

Asn Ile Tyr Ser

20

Claims

1.一种肽，其用于治疗、改善或预防骨关节炎，其中所述肽的长度在12和28个氨基酸之间，并且包含根据SEQ ID NO:16的氨基酸序列或其根据式2的变体，其中所述肽的氨基酸序列包含在SEQ ID NO:34或其根据式1的变体中，其中式1为：

X1 X2 X3 G Y X4 A X5 Y S E G X6 S X7 X8 X9 L X10 X11 X12 M N A T X13 H A(SEQ ID NO:47)

其中

X1＝A或I或L或M或Y或V或E或H或K或Q或R，

X2＝P或Y或M，

X3＝E或R或H或K或N或P或Q或S或T或I或L或M或V，

X4＝A或E或Q或R或S，

X5＝Y或N或D，

X6＝E或A或Q，

X7＝A或D或E或H或K或S，

X8＝F或A或D或E或H或Q或R或S，

X9＝P或M，

X10＝N或A或D或S或T或E或Q或R或I或V，

X11＝S或A或D或E或H或K或N或P或Q或T，

X12＝Y或H或D或G或H或N或R或S或T或者其中

X13＝N或F或W或Y或H或K或R；

和其中式2为：

Y S E G X6 S X7 X8 X9 L X10 X11(SEQ ID NO:48)

其中

X6＝E或A或Q，

X7＝A或D或E或H或K或S，

X8＝F或A或D或E或H或Q或R或S，

X9＝P或M，

X10＝N或A或D或S或T或E或Q或R或I或V或者其中

X11＝S或A或D或E或H或K或N或P或Q或T。

2.根据权利要求1所述的肽，其中SEQ ID NO:34的所述变体包含选自由取代X1、X2、X3、X4、X5、X6、X7、X8、X9、X10、X11、X12和X13组成的组的12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸取代。

3.根据权利要求1或2所述的肽，其中SEQ ID NO:16的所述变体包含选自由取代X6、X7、X8、X9、X10和X11组成的组的5、4、3、2或1个氨基酸取代。

4.根据权利要求1-3任一项所述的肽，其中所述肽包含根据SEQ ID NO:16的氨基酸序列。

5.根据权利要求1-4任一项所述的肽，其中所述肽的氨基酸序列完全包含在SEQ IDNO:34中。

6.根据权利要求1-5任一项所述的肽，其中所述肽选自由线性肽、线性逆反肽、逆反肽、环肽、带单环的肽、和带双环的肽组成的组。