CN109303065A - 一种去除微生物污染的液体及使用方法 - Google Patents

一种去除微生物污染的液体及使用方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种去除微生物污染的液体及其使用方法，所述液体中含有聚维酮碘、PEG 8000。本发明所提供的去除微生物污染的液体可以广谱杀灭真菌、细菌、病毒、支原体等微生物污染，而且对细胞没有明显毒害作用；再者，该液体制备简单，制作成本低廉，易于推广同时简便快捷地去除生物样本存放、细胞培养等引起的微生物污染问题。

Description

一种去除微生物污染的液体及使用方法
技术领域
本发明涉及生物化学领域，特别是涉及了一种去除微生物污染的液体及使用方法。
背景技术
聚维酮碘（PVP-I）是聚乙烯吡咯烷酮（PVP）与碘的复合物，不但保留了碘的强大的杀菌性能，无细菌和病毒的耐药性，而且克服了游离碘难溶于水、不稳定、对皮肤刺激性大和黄染等缺点。这种分子间的络合有效降低了碘的腐蚀性和刺激性。聚维酮碘溶液中碘以低毒性的络合碘存在，其中有80%-90%的络合碘可解聚成游离碘而发挥杀菌效力，是一种广谱的强力杀菌消毒剂，对革兰氏阴性、阳性菌、真菌和病毒具有广谱杀灭作用，适用于手术前洗手、手术术野及注射部位的清洗消毒，阴道粘膜冲洗，感染部位消毒以及医疗器械和环境消毒等。研究还发现，低浓度的PVP-I对细胞没有毒害作用。
微生物污染是细胞培养工作的大敌，其中以细菌污染最为常见也最难预防。如何尽早发现污染并成功挽救珍稀细胞系，是许多实验室遇到的难题。对于培养物发生细菌污染的处理，一向被认为应该弃之，但是对独一无二的、无可替代的细胞系还应尽力考虑去除污染和挽救，方法有抗生素除菌法、巨噬细胞吞噬法和动物接种除菌法，其中较常使用的是抗生素冲击法。但抗生素的作用主要是通过抑制细菌细胞壁的合成达到抑制细菌生长的效果，并不能直接杀死细菌，而且抗生素对培养细胞的形态和性状都有一定的影响。还可以往细胞中添加巨噬细胞吞噬细菌，但是巨噬细胞在体外没有其他免疫细胞和抗体等因素的参与下，其吞噬功能是有限的。动物体内接种除菌法是利用动物的免疫系统来消灭污染微生物的方法。但是动物体内接种法容易带入动物体内的病毒。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供了一种去除微生物污染的液体，从而简便快捷地去除生物样本存放、细胞培养等引起的微生物污染问题。
本发明所要解决的技术问题通过以下技术方案予以实现：
一种去除微生物污染的液体，所述液体中含有聚维酮碘、PEG 8000。
在本发明中，按质量百分比计，所述聚维酮碘的含量为0.01%-0.08%。
在本发明中，按质量百分比计，所述PEG 8000的含量为0.02%-0.1%。
在本发明中，所述液体的pH在6.0-8.0之间。
在本发明中，所述液体中还含有DMSO。按质量百分比计，所述DMSO的含量为3%-5%。
在本发明中，所述液体还含有碘酸根离子。
在本发明中，所述液体还含有硫酸镁。所述硫酸镁的浓度为15-25mM。
一种去除微生物污染的液体的使用方法，按照1份如任一上述去除微生物污染的液体兑2份水，使用于被污染的细胞中2小时-12小时。
本发明具有如下有益效果：本发明所提供的去除微生物污染的液体可以广谱杀灭真菌、细菌、病毒、支原体等微生物污染， 而且对细胞没有明显毒害作用；再者，该液体制备简单，制作成本低廉，易于推广同时简便快捷地去除生物样本存放、细胞培养等引起的微生物污染问题。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明， 均为自常规生化试剂商店购买得到的。
实施例1 去除SP2/0骨髓瘤细胞中的细菌污染
1.去除微生物污染的液体的配制：取聚维碘酮（阿拉丁试剂）、PEG 8000，加入超纯水溶解，调节PH至7.0，定容，用0.22μm滤膜过滤除菌、除杂质，备用。
2.往被污染的SP2/0骨髓瘤细胞中加入1/2体积的上述液体，置于5%二氧化碳细胞培养箱中37℃作用2小时；去除上清，加入1640培养基洗涤细胞一次；去掉液体，加入完全培养基继续培养细胞即可。
3.表1为单独采用聚维酮碘作为杀菌剂作用于受污染的SP2/0细胞的实效效果。当聚维酮碘浓度为0.03%(特别说明：本发明中涉及所有百分数如无特别说明，则均为质量百分比)时，杀菌效果适中，而且细胞活性最佳。
表1聚维酮碘浓度对于杀菌及细胞的影响
聚维酮碘浓度（%） 杀菌效果 细胞活性
0.005 - ++
0.01 + ++
0.03 ++ +++
0.05 ++ ++
0.08 +++ +
“-”代表无效；“+”代表有效，“+”越多代表效果越明显。
4.在0.03%的聚维酮碘中添加PEG 8000，评估杀菌效果，结果如表2所示。可见0.14%以下的PEG 8000对于细胞活性没有明显影响，但是添加PEG 8000浓度在0.06%-0.1%时，杀菌效果具有明显提升。
表2 PEG 8000浓度对于杀菌及细胞的影响
PEG 8000浓度（%） 杀菌效果 细胞活性
0 ++ +++
0.02 ++ +++
0.06 +++ +++
0.1 +++ +++
0.14 + +++
实施例2 293T细胞真菌污染的去除
1.去除微生物污染的液体的配制：取聚维碘酮、PEG 8000，加出超纯水溶解，调节pH至8.0，添加不同体积的DMSO（二甲基亚砜），定容，用0.22μm滤膜过滤除菌、除杂质；备用。
2.往被污染的293T细胞中加入1/2体积的上述液体，置于5%二氧化碳细胞培养箱中37℃作用12小时；去除上清，加入PBS（磷酸盐缓冲液，pH=7.4）洗涤细胞一次；去掉液体，加入完全培养基继续培养细胞即可。
3.实验结果如表3所示，添加DMSO（3%-5%）可以提高杀菌效果。但是继续增大DMSO的浓度，细胞的活性受到抑制。
表3添加DMSO杀灭真菌效果评价
DMSO浓度（% ,V/V） 杀菌效果 细胞活性
0 ++ ++
1 ++ +++
3 +++ +++
5 +++ ++
7 + -
实施例3 小鼠原代成纤维细胞支原体污染的去除
1.去除微生物污染的液体的配制：取聚维碘酮、PEG 8000，加出超纯水溶解，调节PH至7.0，添加硫酸镁，溶解定容，用0.22μm滤膜过滤除菌、除杂质。备用。
2.往被污染的小鼠原代成纤维细胞中加入1/2体积的上述液体，置于5%二氧化碳细胞培养箱中37℃作用5小时；去除上清，加入PBS（磷酸盐缓冲液，pH7.4）洗涤细胞一次；去掉液体，加入完全培养基继续培养细胞即可。
3.实验结果如表4所示，添加硫酸镁浓度在15mM-25mM（mM表示毫摩尔每升）可以提高杀菌效果。
表4添加硫酸镁杀灭真菌效果评价
硫酸镁浓度（mM） 杀菌效果 细胞活性
0 ++ ++
5 ++ +++
15 +++ +++
25 +++ +++
50 ++ +++
实施例4 PH对于杀菌效果的影响
PH是影响聚维酮碘杀菌效果的重要因素，一般情况下，pH在4.0左右聚维酮碘具有良好的杀菌效果，而碱性范围内杀菌效果大幅度降低。但本发明人发现，添加了PEG 8000的聚维酮碘溶液的最佳杀菌pH在6.0-8.0范围内。不同pH值的去除微生物污染的液体（0.03%聚维酮碘、0.06%PEG 8000）添加到预先添加了大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、酵母菌、支原体的完全培养基中，按照每毫升完全培养基添加0.5毫升去除微生物污染的液体，混匀，置于37℃作用2h；取作用完毕后的液体，用生理盐水稀释，取稀释后的液体进行生化培养检测。从评价结果（表5）来看，pH在6.0以上时杀菌效果较佳，7.0-8.0范围最佳。
表5 不同pH的去除微生物污染的液体的杀菌效果
pH 大肠杆菌 金黄色葡萄球菌 酵母菌 支原体
3.0 76% 76% 48% 35%
4.0 88% 80% 75% 69%
5.0 87% 88% 94% 82%
6.0 100% 90% 100% 93%
7.0 100% 100% 100% 100%
8.0 100% 100% 100% 100%
9.0 98% 99% 92% 96%
实施例5保质期的确定
聚维酮碘随着时间的推移，效能会逐渐降低，添加碘酸根离子有利于延长其的保质期。本发明同样比较了不同浓度下的碘酸根离子的浓度。通过比较，本发明所述去除微生物污染的液体中碘酸根离子浓度在10mM以上时， 该液体保质期可达一年以上，但是碘酸根离子浓度超过80mM时，对细胞活性会产生不利影响。
实施例6 作用温度对于杀菌效果的影响
温度将会影响聚维酮碘中碘的释放，进而影响到杀菌效果。本发明人往被细菌污染的贴壁细胞（SP2/0）中添加去除微生物污染的液体（0.03%聚维酮碘、0.06%PEG 8000），按照每毫升完全培养基添加0.5毫升去除微生物污染的液体进行添加，混匀，置于不同温度下作用2h；吸掉上清，用1640培养基洗涤微孔两次，加入完全培养基，置于37℃ 5%二氧化碳培养箱中培养，观察细胞生长及污染情况。从评价结果（表6）来看，低温有助于杀灭细菌，随着温度的升高，杀菌效果降低。
表6温度对于杀菌效果的影响
作用温度（℃） 杀菌效果 细胞活性
0 +++ +++
5 +++ +++
15 +++ +++
25 ++ +++
35 ++ +++
40 ++ +
实施例7 PEG分子量对于杀菌效果的影响
PEG对细胞有一定毒性，如何在保证细胞活性的前提下，有效杀菌将会影响聚维酮碘中碘的释放，进而影响到杀菌效果。本发明往被细菌污染的贴壁细胞（SP2/0）中添加去除微生物污染的液体（0.03%聚维酮碘、0.06%PEG），按照每毫升完全培养基添加0.5毫升去除微生物污染的液体进行添加，混匀，置于15℃下作用2h；吸掉上清，用1640培养基洗涤微孔两次，加入完全培养基，置于37℃ 5%二氧化碳培养箱中培养，观察细胞生长及污染情况。从评价结果（表7）来看，低分子量的PEG杀菌效果更佳，但是对于细胞的杀伤也会增加。PEG分子量为8000时，综合效果最佳。
表7温度对于杀菌效果的影响
PEG分子量 杀菌效果 细胞活性
1500 +++ -
4000 ++ +
6000 +++ +
8000 +++ +++
10000 ++ ++
20000 ++ +
以上所述实施例仅表达了本发明的实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制，但凡采用等同替换或等效变换的形式所获得的技术方案，均应落在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种去除微生物污染的液体，其特征在于，所述液体中含有聚维酮碘、PEG 8000。
2.根据权利要求1所述的去除微生物污染的液体，其特征在于，按质量百分比计，所述聚维酮碘的含量为0.01%-0.08%。
3.根据权利要求2所述的去除微生物污染的液体，其特征在于，按质量百分比计，所述PEG 8000的含量为0.02%-0.1%。
4.根据权利要求3所述的去除微生物污染的液体，其特征在于，所述液体的pH在6.0-8.0之间。
5.根据权利要求3或4所述的去除微生物的污染的液体，其特征在于，所述液体中还含有DMSO。
6.根据权利要求5所述的去除微生物的污染的液体，其特征在于，按质量百分比计，所述DMSO的含量为3%-5%。
7.根据权利要求1所述的去除微生物污染的液体，其特征在于，所述液体还含有碘酸根离子。
8.根据权利要求3或4所述的去除微生物污染的液体，其特征在于，所述液体还含有硫酸镁。
9.根据权利要求1所述的去除微生物污染的液体，其特征在于，所述硫酸镁的浓度为15-25mM。
10.一种去除微生物污染的液体的使用方法，其特征在于，按照1份如权利要求1至9任一所述去除微生物污染的液体兑2份水，使用于被污染的细胞中2小时-12小时。
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