CN109265515A - 一种环肽化合物及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种具有式Ⅰ结构的环肽化合物及其制备方法与应用,
Description
技术领域
本发明涉及生物医药领域，具体涉及环肽化合物及其制备方法以及该化合物的医药用途。
背景技术
随着抗生素的滥用，超级细菌的出现，使得细菌感染是危害人类健康的主要疾病之一。研究和开发新的抗生素一直是医药领域的重要研究内容。近年来，天然产物逐渐成为人类研究有效活性成分的重要来源，在新药开发过程中，一方面具有良好活性的天然产物可以直接被用于临床；另一方面，以天然活性成分为先导化合物，通过有机合成、结构改造等方法寻找和开发新的高效低毒药物，是被实践证明最行之有效的开发新药的途径之一。
作为海洋生态系统中的重要组成，海洋微生物同样为长期适应生存产生各种各样的酶和许多新颖的活性化合物。研究表明，海洋微生物具有丰富的生物多样性，种类多达1亿种以上，但目前所研究和鉴别过的海洋微生物还不到海洋微生物总量的1％，这意味着海洋微生物为海洋药物的研究提供了一个近似无穷的资源。微生物在海洋中的分布非常广泛，在极端的环境中都有微生物存在，其中一部分与海洋动植物处于共附生、共栖、寄生或附生的微生物称为共附生微生物。很多文献报道中指出，许多以前认为是由植物和无脊椎动物产生的活性物质实际上是由与其共附生的微生物产生的。因此，海洋共附生微生物正受到越来越多研究者的重视，迄今为止已从海洋共附生微生物中发现了种类繁多并且具有活性显著的生物学活性物质。
由于微生物沉默基因簇的存在，大部分单体化合物在普通的培养条件下并不能表达产生，通过传统模式寻求结构新颖的抗菌活性成分的成功率越来越低，因此，如何有效的诱导沉默基因进行表达，产生新颖的活性单体已经成为研究的热点。
发明内容
本发明采用稀土元素共培养模式，对海洋来源的桔青霉(Penicillium citrinum)进行了共培养，诱导产生了一种具有抗菌活性的新型环肽化合物。
本发明的具体技术方案如下：
一种环肽化合物，具有式Ⅰ结构：
本发明还提供了上述环肽化合物制备方法，包括如下步骤：
1)采用稀土元素氯化钪共发酵的技术发酵培养海洋海绵共附生微生物，所述微生物为桔青霉Penicillium citrinum，优选的，氯化钪的浓度为0.01-1g/L，更优选为0.5g/L；
2)将步骤1)所得发酵液经有机溶剂萃取，得到初提物，优选有机溶剂为氯仿、乙酸乙酯中的一种或几种，更优选乙酸乙酯；
3)将步骤2)得到的初提物经过反相高效液相柱层析分离纯化，得到结构式为式Ⅰ的化合物。
优选的，先采用中低压反相高效液相柱层析，采用甲醇-水两相系统，30％-100％甲醇梯度洗脱，收集洗脱组分；进一步将得到的洗脱组分用反相高效液相色谱纯化，采用甲醇–水两相系统等度洗脱，洗脱条件：甲醇：水的体积比为52:48，得到结构式为式Ⅰ的化合物。
本发明的另一目的在于提供一种药物组合物，本发明所述的环肽化合物以及药学上可接受的载体。
本发明的另一目的是提供本发明环肽化合物式Ⅰ在制备抗菌药物，特别是抗细菌药物中的应用。
本发明通过实验证实，本发明的环肽化合物具有良好的抗菌活性，可以作为抗菌药物的活性成分。
在以本发明所述化合物为活性成分的药物中，需要的时候还可以加入一种或多种药学上可接受的载体。所述载体包括药学领域常规的稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体、润滑剂等，均可以按照药学领域的常规方法制备。
本发明利用微生物与稀土元素氯化钪共发酵，纯化技术，对海洋海绵共附生的真菌桔青霉(Penicillium citrinum)的次生代谢产物进行了系统分离，获得了一种新的环肽化合物，通过体外抗菌试验证实，这些化合物具有较好的抗菌活性，可以作为抗菌药物的活性成分，具有广泛的用途。
附图说明
图1为本发明所述化合物HPLC色谱图。
具体实施方式
实施例1、结构式为式Ⅰ化合物的制备
本发明采用稀土元素共培养条件下微生物发酵，提取，纯化等步骤，来制备本发明化合物。其中所采用的菌株为桔青霉(Penicillium citrinum)。此菌株于海洋海绵中分离得到，为海洋海绵的共附生微生物，放置于20％甘油水溶液中，于零下80℃冰箱内保存。所选用的培养基为改良后的土豆培养基。
土豆培养基的配制：称取200g去皮土豆，切块，放置于1000mL人工海水中煮沸30分子，过滤，用人工海水补齐至1000mL，加入0.35g硫酸镁，0.5g氯化钪，121℃下灭菌30分钟。配制固体培养基时在液体培养基中加入2％琼脂。其中将30.0g海盐溶解于1000ml自来水溶液中配置为人工海水。
细菌培养基的制备(LB培养基)：每1000mL液体培养基加入5.0g酵母提取物，10.0g蛋白胨，10.0g NaCl，加水溶解，调pH值至7.0。配制固体斜面培养基再在液体培养基中加入1.5％琼脂。
具体化合物的过程如下：
1)发酵以及萃取
将桔青霉接入2个250mL三角瓶(改良土豆培养基)中，作为种子液。于摇床上160rpm、28℃下振荡培养3天后，用无菌移液管吸取25mL的种子液，加入到20个1000mL摇瓶(装有500mL改良土豆培养基)中。振荡培养28天后，用等体积的乙酸乙酯萃取2次，萃取液减压浓缩至干，得到转化物残渣约6.0g。
2)反相中低压色谱柱纯化
将所得残渣溶于适量甲醇，加至装有120g反相硅胶(120埃，30–50目)的色谱柱，用甲醇-水系统梯度洗脱(30％-100％甲醇)，收集洗脱组分，抗菌活性的测试表明50％甲醇洗脱组分具有抗菌活性，对该洗脱组分进行进一步的分离纯化。
3)反相高效液相色谱纯化
用反相高效液相色谱分析、纯化步骤2)得到的活性洗脱组分。分析条件为：色谱柱Hedera C18 A-5μm，4.6mm I.D×250mm(江苏汉邦科技)，洗脱系统为甲醇–水等度洗脱，具体条件：甲醇–水(52:48，V/V)，流速为2.0mL/min。检测波长为220nm，柱温25℃，进样量20μL。得到结构式为式Ⅰ的次生代谢产物，HPLC色谱图如图1所示。
化合物Ⅰ，Cyclo(L-Tyrosine-L-Leusine-D-Proline)，无色胶状物质：(+)-ESIMSm/z 374[M+H]+；(+)-HRESIMS m/z 374.2087(calcd for C20H28N3O4,374.2080).
其1H-NMR及13C-NMR数据如表1所示。
表1.化合物Ⅰ的氢谱和碳谱数据(CD3OD)
Table 1.1H and 13C NMR data for compound 1 in MeOD-d4 a
a H and C NMR data were measured at 500and 125MHz,respectively.
以上结果表明，所得化合物结构正确。
实施例2本发明化合物Ⅰ的抗细菌活性
1)实验材料
仪器与试剂：CO2培养箱；酶标仪(Bio-TEKELx800)；LB培养基(上海生物工程有限公司)。
测试所用致病细菌株：Enterobacter cloacae(阴沟肠杆菌)，Escherichia coli(大肠杆菌)，Klebsiella aerogenes(克雷伯氏菌)，Pseudomonas aeroginosa(绿脓杆菌)，Salmonella typhimurium(鼠伤寒沙门氏菌)，Staphylococcus aureus(金黄色葡萄球菌)，购于中国医学科学院微生物研究所。
测试样品：桔青霉次生代谢产物Ⅰ，纯度在90％以上；同时，选取硫酸链霉素为阳性对照药物，各化合物均以DMSO溶解后稀释。
2)实验方法
配置LB培养液，121℃下灭菌25分钟备用，将配置稀释好的菌液加入96孔板中，每孔加入180μl，将化合物Ⅰ配置为一定浓度的DMSO溶液，以倍数关系逐级稀释加入含有菌液的微孔中，使其最终浓度依次为64,32,16,8,4,2,1,0.5,0.25，0.125，0.0625μg/ml，于37℃培养箱中培养24小时，用酶标仪于600nm处读取吸光度，其中采用硫酸链霉素为阳性对照，180μl空白培养基与20μl的DMSO混合溶液为空白对照。实验重复3次。计算各受试样品对人类致病菌的最小抑制浓度(MIC值)。
3)实验结果，结果如表2所示。
表2.测试样品体外抗细菌活性筛选结果
结果表明，本发明的化合物Ⅰ具有良好的光谱抗细菌活性，可以作为抗细菌药物的活性成分。
Claims (9)
1.一种环肽化合物，其特征在于具有式Ⅰ结构：
2.如权利要求1所述环肽化合物的制备方法，其特征在于包括如下步骤：
1)采用稀土元素氯化钪共发酵的技术发酵培养海洋海绵共附生微生物，所述微生物为桔青霉Penicillium citrinum；
2)将步骤1)所得发酵液经有机溶剂萃取，得到初提物；
3)将步骤2)得到的初提物经过反相高效液相柱层析分离纯化，得到结构式为式I的化合物。
3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于所述步骤2)有机溶剂选自氯仿、乙酸乙酯中的一种或几种。
4.如权利要求2所述的制备方法，其特征在所述步骤3)先采用中低压反相高效液相柱层析，采用甲醇-水两相系统，30％-100％甲醇梯度洗脱，收集洗脱组分；进一步将得到的洗脱组分用反相高效液相色谱纯化，采用甲醇–水两相系统等度洗脱，洗脱条件：甲醇：水的体积比为52:48，得到结构式为式I的化合物。
5.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于所述步骤1)氯化钪的浓度为0.01-1g/L。
6.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于所述步骤1)氯化钪的浓度为0.5g/L。
7.一种药物组合物，其特征在于含有权利要求1所述的环肽化合物以及药学上可接受的载体。
8.如权利要求1所述的环肽化合物在制备抗菌药物中的应用。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于所述的环肽化合物在制备抗细菌药物中的应用。
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