CN109265444A

CN109265444A - 取代的三嗪类idh抑制剂的光学异构体及其应用

Info

Publication number: CN109265444A
Application number: CN201810787170.7A
Authority: CN
Inventors: 赵立文; 储刚; 张瑾; 程宏明; 陈程; 许成龙; 潘强; 李蕾蕾; 吴雅霜
Original assignee: Nanjing Sanhome Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Nanjing Sanhome Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2017-07-17
Filing date: 2018-07-16
Publication date: 2019-01-25
Anticipated expiration: 2038-07-16
Also published as: CN109265444B

Abstract

本发明属于医药化学领域，涉及一类取代的三嗪类IDH抑制剂的光学异构体及其应用，具体地，本发明提供式I或式II所示的光学异构体或其水合物、溶剂合物、结晶或药学上可接受的盐，它们的制备方法以及含有这些光学异构体或其水合物、溶剂合物、结晶或药学上可接受的盐的药物组合物和它们用于治疗以突变型异柠檬酸脱氢酶2的存在为特征的癌症的用途。本发明的化合物对IDH2具有好的抑制活性，非常有希望成为疗效更高、副作用更小的癌症治疗剂，

Description

取代的三嗪类IDH抑制剂的光学异构体及其应用

技术领域

本发明属于医药化学领域，具体涉及一类取代的三嗪类异柠檬酸脱氢酶抑制剂的光学异构体或其水合物、溶剂合物、结晶或药学上可接受的盐，它们的制备方法以及含有这些化合物的药物组合物和这些化合物或组合物用于治疗以突变型异柠檬酸脱氢酶2的存在为特征的癌症的用途。

背景技术

异柠檬酸脱氢酶(isocitrate dehydrogenase，IDH)是三羧酸循环的限速酶，其家族包括IDH1、IDH2和IDH3三个成员，借助NAD⁺(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，辅酶I)或NADP⁺(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸，辅酶II)作为辅助因子，催化异柠檬酸的氧化脱羧反应生成α-酮戊二酸(α-KG)，同时分别生成NADH(还原型辅酶I)或NADPH(还原型辅酶II)。IDH同工酶有以下三种形式：依赖NADP的胞质的IDH1和线粒体的IDH2，依赖NAD的线粒体IDH3。IDH1基因位于染色体2q33.3，定位于细胞质和过氧化物酶体中；IDH2基因位于染色体15q26.1，定位于细胞线粒体。

已经在多种癌症中鉴别出IDH2突变，所述癌症例如神经胶质瘤、多形性成胶质细胞瘤、急性髓性白血病(AML)等。IDH2的突变包括R140和R172等，这些突变发生在活性位点的关键残基处或附近(参见L.Dang等人,Nature,2009,462,739-44)。研究表明存在于癌细胞中的IDH2的突变导致所述酶具有催化α-酮戊二酸NAPH-依赖性还原为R(-)-2-羟基戊二酸(2-HG)的新的能力。已经在包含突变的肿瘤中检测到高水平的2-HG。例如，已经在患有含突变IDH的AML的患者的血浆中检测到高水平的2-HG(参见S.Gross等人,J.Exp.Med.,2010,207(2),339)。认为IDH2突变导致的高水平2-HG的产生促成癌症的形成和发展(参见L.Dang等人,Nature,2009,462,739-44)。因此，对突变型IDH2及其新生活性的抑制作为以突变型IDH2的存在为特征的癌症治疗进入药物研究人员视野。研制一种安全有效的IDH抑制剂成为治疗癌症的重要方式。

此外，大量文献数据表明，手性药物的光学异构体具有不同的药效学、药代动力学和毒理学性质。而本申请的发明人前期通过一系列药理研究表明，取代的三嗪类化合物作为异柠檬酸脱氢酶2抑制剂，具有良好的成药性，因此，合成作为异柠檬酸脱氢酶2抑制剂的取代的三嗪类化合物的光学异构体，并对它们进行生物活性、毒性和副作用的研究，对于该类化合物的成药性研究具有重要的指导意义，值得进行深入的开发。

发明内容

本发明的一个目的是提供式I或式II所示的具有异柠檬酸脱氢酶2抑制活性的光学异构体或其水合物、溶剂合物、结晶或药学上可接受的盐，

本发明的另一个目的是提供制备本发明的式I或式II所示的光学异构体或其水合物、溶剂合物、结晶或其药学上可接受的盐的方法。

本发明的再一个目的是提供包含本发明的式I或式II所示的光学异构体或其水合物、溶剂合物、结晶或其药学上可接受的盐和药学可接受的载体的组合物，以及包含本发明的式I或式II所示的光学异构体或其水合物、溶剂合物、结晶或其药学上可接受的盐和另一种或多种IDH2抑制剂的组合物。

本发明的还一个目的是提供本发明的式I或式II所示的光学异构体或其水合物、溶剂合物、结晶或其药学上可接受的盐治疗以突变型异柠檬酸脱氢酶2的存在为特征的癌症的方法，以及本发明的式I或式II所示的光学异构体或其水合物、溶剂合物、结晶或其药学上可接受的盐在制备用于治疗以突变型异柠檬酸脱氢酶2的存在为特征的癌症的药物中的应用。

针对上述目的，本发明提供以下技术方案：

第一方面，本发明提供式I或式II所示的光学异构体或其水合物、溶剂合物、结晶或其药学上可接受的盐：

在一些实施方案中，本发明的式I或II的化合物为基本上纯的异构体形式，异构体纯度为至少60％EE。在一个具体的实施方案中，本发明的式I或II的化合物的异构体纯度为至少90％EE。在另一个具体的实施方案中，本发明的式I或II的化合物的异构体纯度为至少98％EE。在一个优选的实施方案中，本发明的式I或II的化合物的异构体纯度为至少99％EE。异构体过量值提供的是主要异构体的百分量超过与其同时存在的次要异构体的百分量的定量测量，可容易地通过本领域所建立的和公知的适当方法进行测量，例如手性高压液相色谱法(HPLC)、手性气相色谱法(GC)、使用手性位移试剂的核磁共振(NMR)等。

在一些优选的实施方案中，本发明提供式I或式II的化合物的药学上可接受的盐，其中所述盐为所述化合物与酸形成的药学上可接受的盐，所述的酸为磷酸、硫酸、盐酸、氢溴酸、硝酸、柠檬酸、马来酸、羟基马来酸、丙酸、乙醇酸、硬脂酸、丙二酸、扁桃酸、琥珀酸、富马酸、乳酸、醋酸、三氟醋酸、谷氨酸、苹果酸、酒石酸、抗坏血酸、双羟萘酸、苯甲酸、苯乙酸、谷氨酸、水杨酸、草酸、反丁烯二酸、甲磺酸、对甲苯磺酸、苯磺酸、羟基乙磺酸等。

另一方面，本发明提供本发明的式I或式II所示的光学异构体或其水合物、溶剂合物、结晶或其药学上可接受的盐的制备方法，包括：

a)式(1)的化合物在二氯亚砜作用下与甲醇发生酯化反应，制得式(2)的化合物；

b)式(2)的化合物与式(3)的化合物在强碱的作用下反应，制得式(4)的化合物；

c)式(4)的化合物与五氯化磷反应制得式(5)的化合物；

d)式(5)的化合物与式(6)的化合物反应制得式(7)的化合物；

e)式(7)的化合物与式(8)的化合物或式(8)的盐经常规反应制得式(9)的化合物；

f)式I或式II的光学异构体可以通过对式9的外消旋混合物进行手性柱分离得到，

在一些实施方案中，本发明提供式I或式II的光学异构体的溶剂合物，优选为式I或式II的光学异构体的水、环己烷、石油醚、乙酸乙酯、乙酸异丙酯、丙酮、甲醇、乙醇、氯仿、苯、四氢呋喃、二氯甲烷、乙醚、异丙醚、异丙醇、正己烷、正庚烷、正丁烷、正戊烷、异戊烷或乙腈合物，进一步优选为水合物，更进一步优选为0.1-5水合物，再进一步优选为0.5-2水合物。

在一些实施方案中，本发明提供式I或式II的光学异构体的溶剂合物的制备方法，包括将式I或式II的光学异构体溶解在溶剂中，然后挥发，制得式I或式II的光学异构体的溶剂合物。在一些实施方案中，所述的溶剂选自水、环己烷、石油醚、乙酸乙酯、乙酸异丙酯、丙酮、甲醇、乙醇、氯仿、苯、四氢呋喃、二氯甲烷、乙醚、异丙醚、异丙醇、正己烷、正庚烷、正丁烷、正戊烷、异戊烷和乙腈中的一种或者多种。在一些优选的实施方案中，所述溶剂选自水、丙酮、氯仿、苯、四氢呋喃、石油醚、乙酸乙酯、乙酸异丙酯、正庚烷和乙腈中的一种或几种。

在一些实施方案中，本发明提供式I或式II的光学异构体的单晶的制备方法，包括将式I或式II的光学异构体溶解在溶剂中，挥发，制得式I或式II的光学异构体的单晶。在一些实施方案中，所述的溶剂选自水、环己烷、石油醚、乙酸乙酯、乙酸异丙酯、丙酮、甲醇、乙醇、氯仿、苯、四氢呋喃、二氯甲烷、乙醚、异丙醚、异丙醇、正己烷、正庚烷、正丁烷、正戊烷、异戊烷和乙腈中的一种或者多种。在一些优选的实施方案中，所述溶剂选自水、丙酮、氯仿、苯、四氢呋喃、石油醚、乙酸乙酯、乙酸异丙酯、正庚烷和乙腈中的一种或几种。

第三方面，本发明提供药物组合物，其包含本发明的式I或式II所示的光学异构体或其水合物、溶剂合物、结晶或其药学上可接受的盐和药学上可接受的载体。

在一些实施方案中，本发明提供药物组合物，其包含本发明的式I或式II所示的光学异构体或其水合物、溶剂合物、结晶或其药学上可接受的盐，还包含选自下列组成的一种或多种：IDH1抑制剂、IDH2抑制剂、PI3K抑制剂、酪氨酸蛋白酶抑制剂、EGFR抑制剂、VEGFR抑制剂、Bcr-Abl抑制剂、c-kit抑制剂、c-Met抑制剂、Raf抑制剂、MEK抑制剂、组蛋白去乙酰酶抑制剂、VEGF抗体、EGF抗体、HIV蛋白激酶抑制剂、HMG-CoA还原酶抑制剂等。

可以将本发明的式I或式II所示的光学异构体或其水合物、溶剂合物、结晶或其药学上可接受的盐与药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂混合制备成药物制剂，以适合于经口或胃肠外给药。给药方法包括，但不限于皮内、肌内、腹膜内、静脉内、皮下、鼻内和经口途径。所述制剂可以通过任何途径施用，例如通过输注或推注，通过经上皮或皮肤粘膜(例如口腔粘膜或直肠等)吸收的途径施用。给药可以是全身的或局部的。经口施用制剂的实例包括固体或液体剂型，具体而言，包括片剂、丸剂、粒剂、粉剂、胶囊剂、糖浆、乳剂、混悬剂等。所述制剂可通过本领域已知的方法制备，且包含药物制剂领域常规使用的载体、稀释剂或赋形剂。

根据本发明，在一些实施方案中，本发明提供式9的化合物或其水合物、溶剂合物、结晶或药学上可接受的盐，

其中所述式9的化合物或其水合物、溶剂合物、结晶或药学上可接受的盐富含式I的光学异构体或其水合物、溶剂合物、结晶或药学上可接受的盐。在一些实施方案中，本发明的式9的化合物或其水合物、溶剂合物、结晶或药学上可接受的盐含有基本上为纯的式I的光学异构体或其水合物、溶剂合物、结晶或药学上可接受的盐。在一个具体的实施方案中，本发明的式9的化合物或其水合物、溶剂合物、结晶或药学上可接受的盐含有大于60％的式I的光学异构体或其水合物、溶剂合物、结晶或药学上可接受的盐。在另一个具体的实施方案中，本发明的式9的化合物或其水合物、溶剂合物、结晶或药学上可接受的盐含有大于90％的式I的光学异构体或其水合物、溶剂合物、结晶或药学上可接受的盐。在另一个具体的实施方案中，本发明的式9的化合物或其水合物、溶剂合物、结晶或药学上可接受的盐含有大于98％的式I的光学异构体或其水合物、溶剂合物、结晶或药学上可接受的盐。在一个优选的实施方案中，本发明的式9的化合物或其水合物、溶剂合物、结晶或药学上可接受的盐含有大于99％的式I的光学异构体或其水合物、溶剂合物、结晶或药学上可接受的盐。

在一些实施方案中，本发明的式9的化合物为基本上纯的异构体形式，其基本上不含其它异构体。例如，在一个具体实施方案中，本发明的式9的化合物基本上不含式II的异构体。在另一个具体实施方案中，本发明的式9的化合物为纯的异构体形式。

第四方面，本发明提供本发明式I或式II所示的光学异构体或其水合物、溶剂合物、结晶或其药学上可接受的盐，式9所示的化合物或其水合物、溶剂合物、结晶或其药学上可接受的盐或包含它们的药物组合物在制备治疗癌症的药物中的用途，优选地，所述癌症为以突变型异柠檬酸脱氢酶2的存在为特征的癌症，例如用作具有2-HG新变体活性的突变IDH2存在为特征的癌症。本发明还提供式I或式II所示的光学异构体或其水合物、溶剂合物、结晶或其药学上可接受的盐，式9所示的化合物或其水合物、溶剂合物、结晶或其药学上可接受的盐或包含它们的药物组合物用作在残基140或172处具有突变，例如R140Q、R140G、R172K、R172M、R172S、R172G和R172W的IDH2的抑制剂的用途。在一些实施方案中，所述治疗是与具有2-HG新变体活性的突变IDH2相关的癌症。在另一些实施方案中，癌症与具有在残基R140或172处具有突变，例如R140Q、R140G、R172K、R172M、R172S、R172G和R172W的2-HG新变体活性的突变IDH2相关。本发明提供本发明式I或式II所示的光学异构体或其水合物、溶剂合物、结晶或其药学上可接受的盐，式9所示的化合物或其水合物、溶剂合物、结晶或其药学上可接受的盐或包含它们的药物组合物在制备治疗以突变型IDH2的存在为特征的癌症的药物中的用途，其中所述的癌症选自黑素瘤、乳头状甲状腺肿瘤、胆管癌、结肠癌、卵巢癌、肺癌、恶性淋巴肿瘤，肝、肾、膀胱、前列腺、乳腺和胰腺的癌和肉瘤，以及皮肤、结肠、甲状腺、肺和卵巢的原发和复发性实体瘤或者白血病等。在具体的实施方案中，待治疗的癌症是成胶质细胞瘤(神经胶质瘤)、骨髓增生异常综合征(MDS)、骨髓组织增殖性赘生物(MPN)、急性骨髓性白血病(AML)、肉瘤、黑色素瘤、非小细胞肺癌、软骨肉瘤、胆管癌或血管免疫母细胞性淋巴瘤。在更具体的实施方案中，待治疗的癌症是成胶质细胞瘤(神经胶质瘤)、骨髓增生异常综合征(MDS)、骨髓组织增殖性赘生物(MPN)、急性骨髓性白血病(AML)、黑色素瘤、软骨肉瘤、或血管免疫母细胞性非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)。

在一些实施方案中，本发明涉及一种治疗以突变型IDH2的存在为特征的癌症的方法，其包括给予所需患者治疗有效量的式I或式II所示的光学异构体或其水合物、溶剂合物、结晶或其药学上可接受的盐，式9所示的化合物或其水合物、溶剂合物、结晶或其药学上可接受的盐或包含它们的药物组合物，其中所述的癌症选自黑素瘤、乳头状甲状腺肿瘤、胆管癌、结肠癌、卵巢癌、肺癌、恶性淋巴肿瘤，肝、肾、膀胱、前列腺、乳腺和胰腺的癌和肉瘤，以及皮肤、结肠、甲状腺、肺和卵巢的原发和复发性实体瘤或者白血病等。

术语说明

除非有相反陈述，在说明书和权利要求书中使用的术语具有下述含义。

本发明“光学异构体”是指分子结构完全相同，物理化学性质相近，但旋光性不同的物质。在光学活性化合物的描述中，前缀D和L或R和S用于表示与分子的手性中心有关的绝对构型。前缀(+)和(-)或d和l用于指定化合物引起的平面偏振光的旋转方向。用(-)或l表示化合物是左旋的。前缀为(+)或d的化合物是右旋的。许多有机化合物以光学活性形式存在，即它们能使平面偏振光的平面旋转。对于给定的化学结构，不同的光学活性化合物被称为立体异构体，除了彼此互为镜像之外，它们是相同的。一个具体的立体异构体也可称作对映异构体，这些异构体的混合物被称为对映异构体混合物或外消旋混合物。

在本发明中，当特定异构体在混合物的组成中超过50％时，外消旋混合物“富含”该特定异构体。“基本上不含”是指当使用本领域技术人员常规使用的传统分析方法确定时，该化合物包括少于大约10％不需要的异构体，例如不需要的异构体的量可以少于10％，例如，9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或甚至更少。含有大约95％或更多的所需异构体的富含异构体的化合物在此被称为“基本上纯的”异构体。含有大约99％或更多的所需异构体的富含异构体的化合物在此被称为“纯的”立体异构体。任何富含异构体的化合物的纯度可以使用传统的分析方法来确认。

本发明“药物组合物”是指包含任何一种本文所述的化合物，包括对应的异构体、前药、溶剂化物、药学上可接受的盐或其化学的保护形式，和一种或多种药学上可接受载体的混合物。药用组合物的目的是促进化合物对生物体的给药。所述组合物通常用于制备治疗和/或预防由一种或多种激酶介导的疾病的药物。

本发明“药学上可接受的载体”是指对有机体不引起明显刺激性和不干扰所给予化合物的生物活性和性质的载体，包含所有的溶剂、稀释剂或其它赋形剂、分散剂、表面活性剂等渗剂、增稠剂或乳化剂、防腐剂、固体粘合剂、润滑剂等。除非任何常规载体介质与本发明化合物不相容。可以作为药学上可接受的载体的一些实例包括，但不限于糖类，如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，如玉米淀粉和马铃薯淀粉；纤维素及其衍生物，如羧甲基纤维素钠、以及纤维素和乙酸纤维素；麦芽、明胶等。

本发明“赋形剂”指加入到药用组合物中以进一步促进给予化合物的惰性物质。赋形剂可以包括碳酸钙、磷酸钙、多种糖类和多种类型的淀粉、纤维素衍生物、明胶、植物油、聚乙二醇。

本发明“治疗以突变型IDH2的存在为特征的癌症”是指可以使具有IDH2突变，例如在残基R140或172处具有突变的癌症得到改善，抑制癌症的生长、发展和/或转移，或降低患癌症的风险，主要向所需要的人或动物给予治疗和/或预防有效量的本发明的化合物以抑制、减慢或逆转受治疗者中癌症的生长、发展或扩散，使癌症得到改善，或降低患病风险，所述的肿瘤包括癌，例如包括膀胱癌、乳腺癌、肾癌、肝癌、肺癌(包括小细胞肺癌)、食道癌、胆囊癌、卵巢癌、胰腺癌、胃癌、宫颈癌、甲状腺癌、前列腺癌和皮肤癌(包括鳞状细胞癌)；淋巴系的造血肿瘤，例如包括白血病、急性淋巴细胞白血病、急性淋巴母细胞白血病、B细胞淋巴瘤、T-细胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、毛细胞淋巴瘤和伯基特淋巴瘤；间充质细胞来源的肿瘤，例如包括纤维肉瘤、横纹肌肉瘤；髓系的造血肿瘤，例如包括急慢性骨髓性白血病、骨髓增生异常综合征和前髓细胞白血病；中枢和周围神经系统肿瘤，例如包括星形细胞瘤、成神经细胞瘤、神经胶质瘤和神经鞘瘤；和其它肿瘤，例如包括黑素瘤、精原细胞瘤、畸胎癌、骨肉瘤、色性干皮病、角化棘皮瘤、甲状腺滤泡癌和卡波济氏肉瘤。

本发明“药学上可接受的盐”是指本发明所述的化合物与某些酸形成的药学上可接受的盐，这类盐用于哺乳动物体内时具有安全性和有效性，且具有应有的生物活性，所述的酸可选自无机酸例如磷酸、硫酸、盐酸、氢溴酸、硝酸，有机酸例如柠檬酸、马来酸、羟基马来酸、丙酸、乙醇酸、硬脂酸、丙二酸、扁桃酸、琥珀酸、富马酸、乳酸、醋酸、三氟醋酸、谷氨酸、苹果酸、酒石酸、抗坏血酸、双羟萘酸、苯甲酸、苯乙酸、谷氨酸、水杨酸、草酸、反丁烯二酸、甲磺酸、对甲苯磺酸、苯磺酸、羟基乙磺酸等。

本发明化合物中的“氢”、“碳”、“氧”包括其所有同位素。同位素应理解为包括具有相同原子数但具有不同质量数的那些原子，例如氢的同位素包括氕、氚和氘，碳的同位素包括¹²C、¹³C和¹⁴C，氧的同位素包括¹⁶O和¹⁸O等。

说明书附图

图1为(S)-4-(3-三氟甲基-3-羟基吡咯-1-基)-6-(6-(三氟甲基)吡啶-2-基)-N-(2-(三氟甲基)吡啶-4-基)-1,3,5-三嗪-2-胺的单晶衍射谱图。

图2为(S)-4-(3-三氟甲基-3-羟基吡咯-1-基)-6-(6-(三氟甲基)吡啶-2-基)-N-(2-(三氟甲基)吡啶-4-基)-1,3,5-三嗪-2-胺的三维分子结构图。

图3为人急性髓性白血病NOD/SCID动物模型中接种AM7577细胞后各组小鼠的存活期以及随时间进展各组小鼠的存活率，其中横坐标为细胞接种后的时间(天)，纵坐标为存活百分率(％)，包括对照组实施例3 15mg/kg和45mg/kg组及AG-221 15mg/kg和45mg/kg组

具体实施方式

下面代表性的实施例是为了更好地说明本发明，而非用于限制本发明的保护范围。以下实施例中使用的材料如无特殊说明均为商购获得。

实施例1 4-(3-三氟甲基-3-羟基吡咯-1-基)-6-(6-(三氟甲基)吡啶-2-基)-N-(2-(三氟甲基)吡啶-4-基)-1,3,5-三嗪-2-胺

步骤1 6-(三氟甲基)-吡啶甲酸甲酯的制备

将6-三氟甲基吡啶-2-甲酸(25g,130.8mmol)溶入300mL甲醇中，滴加氯化亚砜(23.3g,196.2mmol)，滴毕加热回流反应12h。反应液浓缩干，加入饱和碳酸氢钠溶液调节pH，乙酸乙酯萃取，无水硫酸钠干燥，浓缩得标题化合物。

步骤2 6-(6-(三氟甲基)吡啶-2-基)-1,3,5-三嗪-2,4-(1H,3H)-二酮的制备

将缩二脲(13g,126.3mmol)溶入300mL乙二醇二甲醚中，分批加入氢化钠(42g,1053mmol)，加热50℃搅拌1h。加入6-(三氟甲基)-吡啶甲酸甲酯(21.6g,105.3mmol)，加热85℃反应16h。反应液倒入水中，用浓盐酸调节pH，过滤，滤饼烘干，得标题化合物。

步骤3 2,4-二氯-6-(6-(三氟甲基)吡啶-2-基)-1,3,5-三嗪的制备

将6-(6-(三氟甲基)吡啶-2-基)-1,3,5-三嗪-2,4-(1H,3H)-二酮(35g,135.6mmol)溶入200mL三氯氧磷中，加入五氯化磷(100g,542.3mmol)，加热105℃反应12h。反应液倒入水中，二氯甲烷萃取，无水硫酸钠干燥，浓缩得标题化合物。

步骤4 4-氯-6-(6-(三氟甲基)吡啶-2-基)-N-(2-(三氟甲基)吡啶-4-基)-1,3,5-三嗪-2-胺的制备

将2,4-二氯-6-(6-(三氟甲基)吡啶-2-基)-1,3,5-三嗪(7g,23.72mmol)溶入50mL四氢呋喃中，加入2-(三氟甲基)-吡啶-4-胺(4.2g,26.1mmol)，碳酸钠(3.8g,35.6mmol)，加热回流72h。反应液过滤，滤液柱层析纯化得标题化合物。

步骤5 4-(3-三氟甲基-3-羟基吡咯-1-基)-6-(6-(三氟甲基)吡啶-2-基)-N-(2-(三氟甲基)吡啶-4-基)-1,3,5-三嗪-2-胺的制备

将4-氯-6-(6-(三氟甲基)吡啶-2-基)-N-(2-(三氟甲基)吡啶-4-基)-1,3,5-三嗪-2-胺(43mg,0.10mmol)溶入5mL四氢呋喃中，加入3-三氟甲基吡咯-3-醇(19mg，0.12mmol)，碳酸钠(16mg，0.15mmol)，加热回流16h。反应液过滤，滤液柱层析纯化得标题化合物。¹H NMR(500MHz,DMSO-d₆):δ10.81(s,1H),8.55-8.81(m,3H),8.27-8.32(m,1H),8.08-8.11(m,1H),7.81-8.00(m,1H),6.67(s,1H),3.73-4.11(m,4H),2.18-2.38(m,2H).ES:m/z540.2[M+H]⁺。

实施例2 (R)-4-(3-三氟甲基-3-羟基吡咯-1-基)-6-(6-(三氟甲基)吡啶-2-基)-N-(2-(三氟甲基)吡啶-4-基)-1,3,5-三嗪-2-胺

将实施例1中制得的产物4-(3-三氟甲基-3-羟基吡咯-1-基)-6-(6-(三氟甲基)吡啶-2-基)-N-(2-(三氟甲基)吡啶-4-基)-1,3,5-三嗪-2-胺(260mg)溶解在30mL甲醇中进行制备性分离，制备性分离方法为：仪器：MGⅡpreparative SFC(SFC-1)，制备柱：ChiralCelOD,250×30mm I.D.,5μm.，流动相：A：CO₂、B：异丙醇(0.1％NH₃H₂O)，梯度：B 30％，流速：60mL/min,，压力：100bar，柱温：38℃，检测波长：220nm。经制备性分离后，将先流出物经过40℃水浴真空旋干，得到标题化合物(115.4mg，保留时间为4.76min)，ee＝99.6％，¹H NMR(500MHz,DMSO-d₆):δ10.81(s,1H),8.55-8.81(m,3H),8.27-8.32(m,1H),8.08-8.11(m,1H),7.81-8.00(m,1H),6.67(s,1H),3.73-4.11(m,4H),2.18-2.38(m,2H),ES:m/z 540.2[M+H]⁺.

实施例3 (S)-4-(3-三氟甲基-3-羟基吡咯-1-基)-6-(6-(三氟甲基)吡啶-2-基)-N-(2-(三氟甲基)吡啶-4-基)-1,3,5-三嗪-2-胺

将实施例1中制得的产物4-(3-三氟甲基-3-羟基吡咯-1-基)-6-(6-(三氟甲基)吡啶-2-基)-N-(2-(三氟甲基)吡啶-4-基)-1,3,5-三嗪-2-胺(260mg)溶解在30mL甲醇中进行制备性分离，制备性分离方法为：仪器：MGⅡpreparative SFC(SFC-1)，制备柱：ChiralCelOD,250×30mm I.D.,5μm.，流动相：A：CO₂、B：异丙醇(0.1％NH₃H₂O)，梯度：B 30％，流速：60mL/min,，压力：100bar，柱温：38℃，检测波长：220nm。经制备性分离后，将后流出物经过40℃水浴真空旋干，得到标题化合物，并经单晶衍射图谱确定(135.0mg，保留时间为5.09min)，ee＝99.7％，¹H NMR(500MHz,DMSO-d₆):δ10.81(s,1H),8.55-8.81(m,3H),8.27-8.32(m,1H),8.08-8.11(m,1H),7.81-8.00(m,1H),6.67(s,1H),3.73-4.11(m,4H),2.18-2.38(m,2H),ES:m/z 540.2[M+H]⁺。

实施例4 (S)-4-(3-三氟甲基-3-羟基吡咯-1-基)-6-(6-(三氟甲基)吡啶-2-基)-N-(2-(三氟甲基)吡啶-4-基)-1,3,5-三嗪-2-胺的单晶的制备

将(S)-4-(3-三氟甲基-3-羟基吡咯-1-基)-6-(6-(三氟甲基)吡啶-2-基)-N-(2-(三氟甲基)吡啶-4-基)-1,3,5-三嗪-2-胺(5.5mg)置于3mL玻璃小瓶中，加入丙酮与正庚烷的混合溶剂(0.5mL，丙酮:正庚烷＝1:4,v/v)。适当超声后固体样品基本溶解，补充加入(S)-4-(3-三氟甲基-3-羟基吡咯-1-基)-6-(6-(三氟甲基)吡啶-2-基)-N-(2-(三氟甲基)吡啶-4-基)-1,3,5-三嗪-2-胺(6.9mg)，继续适当超声促进固体样品溶解。将上述体系于60℃加热半小时后，体系溶清。趁热将滤液过滤至一洁净3mL玻璃瓶(提前预热)中，加盖密封。将上述溶液体系置于60℃生化培养箱内进行缓慢降温实验，降温范围：60℃～5℃，降温速率：0.01℃/min，降温结束后得到棒状及块状晶体样品，其绝对构型通过测定块状晶体样品的单晶衍射图谱并进行解析确定。测得的单晶结构信息见表1，单晶衍射图谱见图1、2。

单晶结构解析表明，以上步骤中制得的块状晶体样品的不对称结构单元由4个(S)-4-(3-三氟甲基-3-羟基吡咯-1-基)-6-(6-(三氟甲基)吡啶-2-基)-N-(2-(三氟甲基)吡啶-4-基)-1,3,5-三嗪-2-胺分子，及2.5个溶剂水分子构成，即表明该晶体为水合物，如图1所示该晶体的不对称结构单元中存在3个水分子的位置，其中O1W的原子占有率为0.5(根据原子的Thermal parameters确定)，O2W及O3W的占有率为1.0，故该晶体的不对称结构单元中包含有2.5个水分子，推测该晶体为5/8水合物。另单晶结构确定了(S)-4-(3-三氟甲基-3-羟基吡咯-1-基)-6-(6-(三氟甲基)吡啶-2-基)-N-(2-(三氟甲基)吡啶-4-基)-1,3,5-三嗪-2-胺中手性中心的R/S绝对构型为(S)。

表1单晶结构信息表

实验例1 U87-MG(IDH2-R140Q)突变细胞皮下移植瘤体内药效评价

1.实验材料

1.1受试化合物：以上实施例制备的本发明的化合物，每个化合物用溶媒(2％无水乙醇:10％:88％生理盐水(v/v/v))配制为相应浓度溶液。

对照化合物为WO2013/102431中公开的化合物409(参见说明书第134页)，化学名为2-methyl-l-(4-(6-(trifluoromethyl)pyridin-2-yl)-6-(2-(trifluoromethyl)pyridin-4-ylamino)-1,3,5-triazin-2ylamino)propan-2-ol(AG-221)，参照WO2013/102431中描述的方法制备并通过氢谱和质谱鉴定。

1.2细胞：人胶质母细胞瘤细胞株U87-MG，购于美国典型培养物保藏中心(ATCC)；

过表达突变型IDH2(R140Q)的U87-MG细胞株[U87-MG(IDH2-R140Q)]，由南京金斯瑞生物科技有限公司使用常规的分子生物学技术构建，所述方法包括以下简要步骤：

(1)将野生型IDH2亚克隆入Lenti-Puro载体(购自GenScript’s MGC library，Slot:IRAU-112-d-10；IRAT-17-b-7)，通过点突变获得IDH2(R140Q)突变体，制备转染级携带有IDH2(R140Q)的重组慢病毒载体；

(2)检测病毒的滴度；

(3)使用构建的重组慢病毒载体转导U87-MG宿主细胞，使用嘌呤霉素筛选稳定细胞，并通过qPCR和蛋白印迹确证IDH2(R140Q)的表达；

(4)通过有限稀释获得单克隆，并通过qPCR和蛋白印迹以及使用LC-MS检测2-羟基戊二酸(2-HG)含量来确认。

1.3试剂：MEM培养基，购自于美国Invitrogen公司；

胎牛血清(FBS)，购自于美国Invitrogen公司；

胰蛋白酶，购自于美国Invitrogen公司；

2-羟基戊二酸(D-α-Hydroxyglutaric acid disodium salt,2-HG)标准品，购自于Sigma公司，Cat.No.SLBD 8946V，纯度≥95％；

非那西汀标准品(内标/IS)：购自于Sigma公司，纯度≥98％；

乙腈/甲醇(色谱纯)购自Merck公司；

其余试剂均为市售分析纯。

1.4动物：

BALB/c nude mice，6-7周龄，雌性，18-22g，购自南京金莱畅公司。

1.5仪器：AB SCIEX API4500液质联用仪(LC-MS/MS)，配有日本岛津超高效液相色谱系统(LC-30A)、美国AB质谱系统(API4500)、电喷雾离子源及Analyst 1.6.2工作站；

Milli-Q超纯水机(Millipore Inc)；

TARGIN VX-II振荡器；

HITACHI CF16RXII台式高速冷冻离心机；

Thermo电动移液器。

2.实验方法

2.1动物接种：

扩增U87-MG(IDH2-R140Q)和U87-MG细胞(野生型)，将处于对数生长期的肿瘤细胞用于体内肿瘤接种。按2×10⁶细胞量/小鼠(细胞悬液体积与Matrigel体积比为1：0.8)，分别接种至每组3只小鼠身体右侧腰背部皮下。

2.2分组及给药：

无突变对照组使用U87-MG细胞株接种的裸鼠，化合物组和溶媒对照组使用U87-MG(IDH2-R140Q)接种的裸鼠。

各组分别灌胃给予相应浓度的化合物溶液，给药体积为100μL/10g体重，对照组均给予相同体积的空白溶媒。

给药10天后，处死小鼠，剥离肿瘤，匀浆，检测肿瘤中2-HG含量。

2.3 LC-MS/MS分析条件

2.3.1色谱条件

色谱柱：Shim-pack XR-ODS 30L*2.0；流动相：乙腈-0.2％氨水，5mM乙酸铵水溶液；柱温：30℃；流速：0.4mL/min；梯度洗脱条件如下表1：

表1色谱洗脱条件

保留时间：t R,2-HG≈0.21min；t R,IS≈1.41min。

2.3.2质谱条件

选用大气压电离离子源(APCI)，设定源参数分别为：喷雾电压(IonSprayVoltage/IS)-4500V，辅助气1(Ion Source Gas 1/GS 1，N2)55Arb，辅助气2(Ion SourceGas 2/GS 2，N2)55Arb，辅助气加热温度(Temperature/TEM)500℃，气帘气(Curtain Gas/CUR)25Arb，碰撞气(Collision Gas/CAD，N2)8Pa。

选用负离子模式(Negative)下多重离子反应监测(MRM)。2-HG的MRM参数为：母离子(Q 1Mass)为146.9Da，子离子(Q 3Mass)为129.0Da，去簇电压(DeclusteringPotential/DP)为-15.3V，碰撞电压(Collision Energy/CE)为-14.5eV。内标(IS)的MRM参数为：母离子(Q 1Mass)为178.0Da，子离子(Q 3Mass)为149.0Da，去簇电压(DeclusteringPotential/DP)为-51V，碰撞电压(Collision Energy/CE)为-17eV。

2.4数据处理

经LC-MS/MS测得每组中各只动物肿瘤匀浆液2-HG浓度，计算百分比(2-HG％)，计算公式如下，

2-HG％＝(给药组瘤内2-HG浓度-U87-MG对照组瘤内2-HG浓度)/(U87-MG(IDH2-R140Q)对照组瘤内2-HG浓度-U87-MG对照组瘤内2-HG浓度)×100％

本发明的化合物给药后小鼠肿瘤内2-HG的相对百分含量(均值)如表2所示。

表2给药10天后瘤内2-HG％

组别	剂量(mg/kg)	2-HG％
			U87-MG对照组		0
U87-MG(IDH2-R140Q)对照组		100
			AG-221	25	-4
AG-221	12.5	9
			AG-221	6.25	58
实施例2	6.25	31
			实施例3	6.25	-2

实验结果表明，在U87-MG(IDH2-R140Q)突变型细胞皮下移植瘤模型中，本发明的化合物具有非常好的抑制肿瘤内因IDH2突变导致的高水平2-HG的能力，实施例2和实施例3的化合物在低剂量抑制2-HG水平的能力显著优于目前处于临床阶段最好的IDH2抑制剂AG-221，尤其是实施例3的化合物以低剂量6.25mg/kg的剂量给药能够完全抑制2-HG至野生型对照组水平，而阳性化合物AG-221在高剂量25mg/kg才能达到相同的功效，两者剂量相差4倍。预计本发明的化合物具有好的抑制IDH2突变导致的促成肿瘤的生成和进展的作用。

实验例2 人急性髓性白血病NOD/SCID动物模型

1.实验材料

1.1受试化合物：实施例制备的本发明的化合物，每个化合物用溶媒(2％无水乙醇:10％:88％生理盐水(v/v/v))配制为相应浓度溶液。

1.2细胞：人急性髓性白血病细胞AM7577，由中美冠科生物技术(北京)有限公司提供；

1.3试剂：FITC anti-human CD45，货号304038，克隆号HI30，购自Biolegend；

1.4动物：

NOD/SCID小鼠，3-4周龄，雌性，购自北京华阜康生物科技股份有限公司；

1.5仪器：流式细胞仪FACSCalibur，BD；

2.实验方法

2.1动物接种：

每只小鼠按照100uL PBS中重悬2×10⁶个细胞的量通过尾静脉接种。

2.2分组及给药：

每周取动物眼眶血，标记人CD45，检测阳性百分比，当外周血CD45+细胞比例达到5％后分组。在接种后第40天外周血CD45+细胞比例达到5％。分组后，每日一次灌胃给药，给药时间为14天。分组及给药情况如表3所示。

表3

组别	动物数量	给药组	剂量(mg/kg)*
				1	8	vehicle	-
2	4	AG-221	45
				3	8	AG-221	15
4	8	实施例3	45
				5	8	实施例3	15

*注：动物的给药体积按照10μL/g体重进行调整。

2.3存活率和生存期的观察：

观察给药后动物的死亡率以及存活动物的生存期。给药14天后各组动物存活数量如表4所示。给药后各组动物的生存期如图3所示。

表4

组别	给药组	剂量(mg/kg)	动物数量	存活动物数
					1	vehicle	-	8	1
2	AG-221	45	4	3
					3	AG-221	15	8	6
4	实施例3	45	8	7
					5	实施例3	15	8	7

实验结果表明，给药14天后，对照组动物仅有1只存活，阳性化合物AG-221高剂量(45mg/kg)组4只动物中有3只存活，阳性化合物AG-221低剂量(15mg/kg)组8只动物中有6只存活，而本发明化合物的低高剂量组均有7只动物存活。从图3可以看出，与溶媒对照组相比，使用本发明的化合物治疗的小鼠生存期明显延长，且随着剂量的增加，例如实施例3的化合物45mg/kg剂量组，本发明的化合物的疗效明显优于阳性化合物AG-221，动物存活期显著增加。本发明化合物可显著提高荷瘤小鼠的生存率和生存期。

尽管以上已经对本发明作了详细描述，但是本领域技术人员理解，在不偏离本发明的精神和范围的前提下可以对本发明进行各种修改和改变。本发明的权利范围并不限于上文所作的详细描述，而应归属于权利要求书。

Claims

1.式I或式II所示的光学异构体或其水合物、溶剂合物、结晶或药学上可接受的盐：

2.根据权利要求1所述的光学异构体或其水合物、溶剂合物、结晶或药学上可接受的盐，其中所述式I或式II的光学异构体纯度为至少60％，优选90％，更优选99％。

3.一种如权利要求1或2所述的光学异构体或其水合物、溶剂合物、结晶或药学上可接受的盐的制备方法，其特征在于，式I或式II的光学异构体通过对式9的外消旋混合物进行手性柱分离得到：

4.一种如权利要求1或2所述的式I或式II的光学异构体的溶剂合物，优选为式I或式II的光学异构体的水、环己烷、石油醚、乙酸乙酯、乙酸异丙酯、丙酮、甲醇、乙醇、氯仿、苯、四氢呋喃、二氯甲烷、乙醚、异丙醚、异丙醇、正己烷、正庚烷、正丁烷、正戊烷、异戊烷或乙腈合物，进一步优选为水合物，更进一步优选为0.1-5水合物，再进一步优选为0.5-2水合物。

5.一种如权利要求1或2所述的式I或式II的光学异构体的单晶的制备方法，其特征在于将式I或式II的光学异构体溶解在溶剂中，然后挥发制得式I或式II的光学异构体的单晶。

6.一种式9所示的化合物或其水合物、溶剂合物、结晶或药学上可接受的盐，

其中所述式9的化合物或其水合物、溶剂合物、结晶或药学上可接受的盐富含如权利要求1所述的式I的光学异构体或其水合物、溶剂合物、结晶或药学上可接受的盐。

7.根据权利要求6所述的式9的化合物或其水合物、溶剂合物、结晶或药学上可接受的盐，其含有大于60％的式I的光学异构体或其水合物、溶剂合物、结晶或药学上可接受的盐；优选地，含有大于90％的式I的光学异构体或其水合物、溶剂合物、结晶或药学上可接受的盐；更优选地，含有大于99％的式I的光学异构体或其水合物、溶剂合物、结晶或药学上可接受的盐。

8.一种药物组合物，其包含权利要求1或2所述的光学异构体或其水合物、溶剂合物、结晶或药学上可接受的盐或者权利要求6或7所述的式9的化合物或其水合物、溶剂合物、结晶或药学上可接受的盐和药学上可接受的载体。

9.根据权利要求1或2所述的光学异构体或其水合物、溶剂合物、结晶或药学上可接受的盐或者根据权利要求6或7所述的式9的化合物或其水合物、溶剂合物、结晶或药学上可接受的盐在制备用于治疗癌症的药物中的用途，优选地，所述癌症为以突变型异柠檬酸脱氢酶2的存在为特征的癌症。

10.根据权利要求8所述的药物组合物在制备用于治疗癌症的药物中的用途，优选地，所述癌症为以突变型异柠檬酸脱氢酶2的存在为特征的癌症。