CN109239355A - 禽流感病毒h9亚型抗体酶联免疫检测试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种禽流感病毒H9亚型抗体酶联免疫检测试剂盒。该试剂盒包括酶标板、阳性对照血清、阴性对照血清、酶标二抗、样品稀释液、20倍浓缩洗涤液、底物液A、底物液B、终止液，其中所述酶标板包被有禽流感病毒H9亚型HA蛋白抗原表位多肽组合物。该抗原表位多肽组合物为序列表中序列1所示的多肽、序列表中序列2所示的多肽或序列表中序列3所示的多肽中的一种或两种以上的任意组合。本发明采用间接法ELISA，使用化学合成抗原肽包被酶标板，抗原用量少、灵敏性和特异性高，可以高效地检测是否存在禽流感病毒H9亚型抗体。本发明试剂盒敏感性高、特异性好、且操作便捷，具有良好的市场前景。

Description

禽流感病毒H9亚型抗体酶联免疫检测试剂盒
技术领域
本发明属于生物检测技术领域，更具体地，本发明涉及一种禽流感病毒H9亚型抗体酶联免疫检测试剂盒。
背景技术
禽流感是由禽流感病毒(Avian influenzavirus，AIV)引起的禽类烈性传染病，被国际兽医局定为A类传染病，又称真性鸡瘟或欧洲鸡瘟。1878年首次在意大利暴发流行，当时称该病为“鸡瘟”，之后许多国家和地区都有该病报道，包括美国、英国、澳大利亚、爱尔兰、比利时、荷兰、法国、俄罗斯、加拿大、以色列、匈牙利、日本、中国(包括香港)等。H9N2亚型禽流感病毒最早于1966年从北美的火鸡体内分离得到，1994年开始在中国大陆的家禽中出现。
禽流感病毒是A型流感病毒，属于正黏病毒科流感病毒属，病毒粒径80～120nm，呈球形、杆状或长丝状，核酸是单链负股RNA，由8个片段组成，共编码8种结构蛋白(HA、NA、NP、M1、M2、PB1、PB2和PA)和2种非结构蛋白(NS1和NS2)。病毒粒子表面有2种重要的纤突，分别是血凝素(Hemagglutinin，HA)(棒状三聚体)和神经氨酸酶(Neuraminidase，NA)(蘑菇形四聚体)。HA为75kDa的糖蛋白，其在病毒吸附及穿膜过程中起关键作用。它刺激机体所产生的中和抗体可中和病毒的感染。根据表面抗原HA和NA的抗原性不同，可将A型流感分为若干亚型，目前已发现16种HA和9种NA亚型，具有宿主特异性，感染禽类并致病的是H5、H7和H9。
禽流感病毒根据致病力和毒力的不同可以分为高致病性禽流感病毒(highlypathogenic avian influenza virus，HPAIV)、低致病性禽流感病毒(low pathogenicavian influenza virus，LPAIV)和无致病性禽流感病毒三种。H9亚型属于低致病性禽流感病毒，在临床上多以低死亡率和轻度的呼吸道感染或产蛋率下降等临床症候群为特征，本身并不引起家禽的大规模死亡。抗原性和系统进化研究表明，在亚洲地区H9N2亚型禽流感基因在遗传进化上存在3个相对独立的进化分支，其代表株分别为A/quail/Hongkong/G1/97(G1group)、A/chicken/Hong Kong/G9/97(G9group)和A/duck/Hong Kong/Y439/97(Korea group)。虽然H9亚型不引起家禽的大量死亡，但是可引起鸡的免疫抑制，进而导致疫苗的免疫失败或其他病原的继发感染，是目前危害我国养殖业的主要病原之一，给我国养禽业造成极大的经济损失。
目前，我国对禽流感病毒的检测手段主要是用血凝抑制试验(HI)检测血凝素抗体，用琼脂免疫扩散试验(AGP)检测核蛋白抗体，此外还有病毒中和试验(VNT)、补体结合试验(CFT)、神经氨酸酶抑制试验和单辐射溶血试验、RT-PCR试验等。但这些大多依赖纯化病毒，生产成本较高，且存在感染人和容易扩散的风险，因此急需研制安全、高效、便捷的禽流感抗体检测方法。酶联免疫吸附试验技术(ELISA)创立于1971年，具有较高的敏感性，即可检测抗体又可检测抗原，且结果易于分析，在流感的控制、扑灭和检疫中用途很大，有研究表明ELISA的敏感性远高于HI试验和AGP试验，因此在ELISA基础上开发能够用于禽流感病毒抗体检测的试剂盒更能便捷有效地对大量血清抗体进行检测。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于检测禽流感病毒H9亚型抗体的间接ELISA检测试剂盒，该试剂盒利用禽流感病毒H9亚型HA蛋白抗原表位多肽作为包被抗原，建立了一种特异性、敏感性和重复性好的间接ELISA方法，用于检测鸡血清中是否含有禽流感病毒H9亚型抗体。
为了达到上述目的，本发明首先筛选得到了性能优异的禽流感病毒H9亚型HA蛋白抗原表位多肽，为序列表中序列1所示的多肽、序列表中序列2或序列表中序列3所示的多肽。
更进一步的，本发明还提供一种性能优异的禽流感病毒H9亚型HA蛋白抗原表位多肽组合物，本发明提供的禽流感病毒H9亚型HA蛋白抗原表位多肽组合物，为序列表中序列1所示的多肽、序列表中序列2所示的多肽或序列表中序列3所示的多肽中的一种或两种以上的任意组合。当所述多肽为序列1、序列2和序列3所示的多肽中的两种时，两种多肽的质量比为(0.5～1.5)：(0.5～1.5)；优选的，它们的质量比为1：1；当所述多肽组合物由序列1所示的多肽、序列2所示的多肽和序列3所示的多肽组成时，它们的质量比为(0.5～1.5)：(0.5～1.5)：(0.5～1.5)；优选的，它们的质量比为1：1：1。
本发明的禽流感病毒H9亚型抗体酶联免疫检测试剂盒，包括酶联反应板、阳性对照血清、阴性对照血清和酶标二抗，其中，所述酶联反应板包被有禽流感病毒H9亚型HA蛋白抗原表位多肽组合物。
所述酶联反应板为可拆卸96孔酶标板；所述禽流感病毒H9亚型HA蛋白抗原表位多肽组合物中的多肽均为化学人工合成得到。
所述酶联反应板的最佳制备方法及条件是将所述禽流感病毒H9亚型HA蛋白抗原表位多肽组合物溶于pH 9.6的碳酸盐溶液，然后加到96孔聚苯乙烯酶联反应板，每孔150ng多肽，2～8℃下放置8～12小时，使多肽抗原与酶联反应板充分结合，然后按照300μl/孔加入含有10mg/ml牛血清白蛋白(BSA)pH7.4的PBS缓冲液，37℃封闭处理2～3小时，甩干后，待酶联反应板干燥后2～8℃密封保存。
所述阳性对照血清为所述禽流感病毒H9亚型灭活疫苗免疫后采集的鸡血清；所述阴性对照血清为无特定病原体(SPF)的鸡血清。此处，无特定病原体(SPF)的鸡血清是指是指机体内无特定的微生物和寄生虫的健康鸡，即没有感染过禽流感病毒H9亚型或者免疫该病原体疫苗的健康鸡血清。
所述酶标二抗为辣根过氧化物酶标记兔抗鸡IgY抗体。
所述试剂盒中还包括底物液A、底物液B和终止液，所述底物液A为含0.6mg/ml过氧化氢尿素的柠檬酸磷酸盐缓冲液，所述底物液B为0.2mg/ml的四甲基联苯胺溶液，使用时两者以1:1的比例混合；所述终止液为2mol/L的硫酸溶液。
所述试剂盒还包括样品稀释液和20倍浓缩洗涤液；样品稀释液为含有5mg/ml酪蛋白的0.01M、pH值为7.4的磷酸盐缓冲液；浓缩洗涤液为含有浓度为0.8％～1.2％(ml/ml)的Tween-20的0.01M，pH值为7.4的磷酸盐缓冲液。
本发明试剂盒的检测程序为：
1、平衡：将试剂盒从冷藏环境中取出，置室温平衡30min备用；液体试剂用前混匀。
2、配液：将浓缩洗涤液用蒸馏水或去离子水20倍稀释得到洗涤缓冲液；
3、设定：2个阴性对照孔和2个阳性对照孔，其余为待测样本孔。
4、待测标本预稀释：使用样品稀释液将待检样品血清、阴性对照血清、阳性对照血清按照1：20的比例稀释。
5、加样：各孔分别按预先设定加100μl稀释的待测样本。加样过程时间跨度应尽量短。
6、温育：震荡混匀，置37℃温箱中，反应30min。
7、洗板：弃去反应液，每孔加300μl稀释后的洗涤缓冲液，浸泡15s，甩弃洗液，连续洗板4次后拍干。
8、加酶：各孔加100μl辣根过氧化物酶标记兔抗鸡IgY抗体。
9、温育：置37℃温箱，反应30min。
10、洗板：弃去反应液，每孔加入稀释后的洗涤缓冲液300μl，浸泡15s，甩弃洗涤液，连续洗板4次后拍干。
11、显色每孔加入100μl底物工作液(将底物液A和底物液B等量混合即为底物工作液，现用现配)，震荡混匀，置37℃温箱中，避光反应15min。
12、每孔加入显色终止液50μl，振荡混匀终止反应。
13、测定每孔的OD450nm值(加终止液的反应板应在15min内读取OD450nm值)。
检测结果的判定：
1、阴性对照OD450nm平均值应该≤0.15，否则无效。
2、阳性对照每个检测值应该在1.0～2.5之间，否则无效。
3、临界值的计算：临界值＝0.17×阳性对照OD450nm值平均值。
待检血清测定OD450nm值≥临界值者判为阳性；待检血清测定OD450nm值<临界值者判为阴性。
本发明的上述试剂盒，可用于检测禽流感病毒H9亚型抗体，以判断被检动物是否存在禽流感病毒H9亚型抗体。
本发明的积极效果在于：本发明采用生物信息学方法对禽流感病毒H9亚型HA蛋白的抗原表位进行精确分析，从HA蛋白上的主要抗原表位上筛选出适合ELISA检测用的肽段。该肽段集中了抗原表位，具有灵敏性高、特异性强的优点。
同时，采用先进的固相合成肽技术合成多肽抗原用于包被酶标反应板的制备。
另外，由于试剂盒中使用的包被抗原是化学合成多肽，不含杂蛋白，纯度高，并且通过筛选选择了效果优异的抗原表位序列，进一步提高了检测禽流感病毒H9亚型抗体的效率，以判断被检动物是否存在H9亚型抗体。
总之，本试剂盒采用化学合成HA蛋白主要抗原位点的抗原肽包被酶联反应板，抗原用量少、灵敏度高、特异性强，可以有效地检测禽流感病毒H9亚型抗体，以判断被检动物是否存在H9亚型抗体。实验结果表明，本发明的试剂盒重复性好，特异性强，灵敏度高。能满足不同层次人员的需要，具有广阔的市场前景和良好的经济、社会效益。
本发明所涉及的禽流感病毒H9亚型抗体酶联免疫检测试剂盒用于检测动物是否H9亚型抗体，有利于我国禽流感病毒防控体系的建立。
具体实施方式
下述实施例中的方法，如无特别说明，均为常规方法。
实施例1、禽流感病毒H9亚型抗体酶联免疫检测试剂盒包被抗原的制备
本试验采用生物信息学方法对禽流感病毒H9亚型HA蛋白的主要抗原表位进行精确分析，筛选出合适的肽段，用全自动多肽合成仪分别合成出3条肽，序列分别为序列表中序列1、序列2、序列3所示，制成纯度约80％的包被抗原。多肽合成方法可为常规方法，本发明使用如下方法合成本发明的3条多肽，作为本发明试剂盒的包被原。
本发明的包被抗原可使用Applied Biosystem全自动多肽合成仪(型号433A)制备。运用Merrifield固相合成法，采用的是Fmoc(9-fluorenylmethyloxycarbonyl，9-芴甲氧羰基)修饰的氨基酸，使用Rink Amide MBHA树脂做为固相载体。生产过程包括多肽抗原固相合成、多肽裂解和鉴定、抗原纯化、冷冻干燥以及保存五部分。以下分别进行说明：
一、包被抗原固相合成
1、合成试剂的准备
合成包被抗原氨基酸序列如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3所示。
依据包被抗原序列以及合成规模准备合适的Fmoc修饰的氨基酸(购自NOVA公司)，加入至相应的Cartridge中。同样按要求合成规模称树脂5g，放入反应腔，将上下盖子拧紧，贴标签，记录所合成肽的名称，批号，反应腔的TARE及所称树脂的重量。将反应腔装入合成仪。配制适量的合成试剂包括100％的NMP、3％的AIM(已酰咪唑)、35％的PIP(哌啶)、100％的MeOH(甲醇)等放置到相对应的试剂瓶中。
2、合成仪状态的检测
检查433A多肽合成仪器是否正常运行，开机后，运行Run Self Test程序，仪器自检各项指标是否正常。另外检查氮气是否充足，系统表压是否正常(433A正常表压10.2psi)。合成前应对仪器的性能有所了解，所以要对每种合成试剂的流速进行测定。433A合成仪：发送Flow Rate1-18到合成仪，选择Main Menu—Module Test—按Prer或next找Module A、ModuleD、ModuleI、ModuleI、Module A)—按Start—按more进行测量或观察，若流量不合适，则调节下阀门压力，直至达到要求(具体检测要求见下表1)。
表1多肽合成仪流速检测标准表
试剂 瓶号 Module 标准范围
35％Piperidine 1 A 1.0～1.2ml
3％AIM 4 D 1.0～1.2ml
100％MeOH 9 I 3.5～4.0ml
DIC 8 I 0.45～0.55g
100％NMP 10 A 2.6～2.8ml
3、包被抗原合成开始
在433A合成仪的程序中将要合成的氨基酸序列发送Std Fmoc 1.0Sol DIC90到合成仪上。File-New-Sequence-编辑合成肽的序列，保存。File-New-Run，检查Chemistry是否为Std Fmoc 1.0Sol DIC 90；Sequence是否为所存名字；设定Cycles；保存。最后发送到合成仪上。
Main Menu—Cycle Monitor—begin，开始运行。
4、包被抗原合成进行
Fmoc基团的脱除，Fmoc基团的芴环系的吸电子作用使9-H具有酸性，易被较弱碱除去，反应时用哌啶(PIP)进攻9-H，β消除形成二苯芴烯，很容易被二级环胺进攻形成稳定的加成物。Fmov基团的脱除后暴露出“－NH2”基团以进行合成反应。然后加入活化的下一个Fmoc基团保护的氨基酸和1-羟基苯并三唑(1-hydroxybenzotriazole，HOBT)至反应器内。
如上述的多肽序列，合成的时候是从C端开始至N端，依照特定的顺序，依次不断地重复合成步骤(合成仪按程序自动完成，具体循环步骤如下表2)。期间观察记录试剂用量及运行情况。
表2包被抗原合成循环步骤
5、包被抗原合成结束
包被抗原合成结束后合成仪将自动停止，并且肽树脂(肽现在还连接在树脂上)基本洗涤干净。然后从多肽合成仪上取下反应器，再用100％甲醇洗涤肽树脂3次后，在通风橱内吹干，然后将多肽树酯全部转移至棕色的聚乙烯瓶内，放入-20℃冰箱内，封口膜密封备用。
二、包被抗原的裂解及鉴定
1、多肽抗原的裂解
经上述反应所得到的多肽是与固相载体通过化学键结合在一起的，必须通过特定的有机强酸的酸解把多肽与固相载体分离。酸解的同时也除去了各个氨基酸官能团上的保护基。步骤如下：
从冰箱内取出合成的多肽树酯(指肽还连接在树脂上)，放入一只2L的圆底烧瓶内，在通风橱内向烧瓶中加入90ml三氟乙酸(Trifluoroacetic acid，TFA)、10ml的三丙基硅烷(TIS)和磁搅拌子，然后稳定地将烧瓶放置在磁力搅拌器上，室温下持续搅拌1h至反应完全。反应结束后，使用带冷阱的旋转蒸发仪持续蒸发30～120min除去粗产品中的TFA。然后用二甲基甲酰氨(DMF)多次清洗多肽抗原的粗品，最后将混合在一起的树脂用砂心漏斗过滤出来，既得到包被抗原。
2、包被抗原的鉴定
多肽抗原合成完毕后用基质辅助激光解吸飞试时间质谱法(MODAL-TOF)和反相高压液相色谱法(RP-HPLC)进行定性定量分析，用常见的氨基酸分析来鉴定所合成的肽。
3、包被抗原纯化
将环化后的多肽抗原使用循环式切向过滤膜包进行超滤(用PALL公司生产的Tangential Flow Device循环式切向过滤膜包以及与其配套的蠕动泵)，多肽抗原作为大分子不能通过一定孔径的滤膜，而前期合成过程以及后期环化反应形成或引进的小分子杂质则可以通过滤膜。然后再通过孔径为0.2μm过滤器除菌，将最后所得溶液分装到无菌塑料瓶内，贴上标签。标签上注明多肽的名称、编号、生产批号、浓度、生产日期、保存期限及保存条件，分装后，储存于-20℃或-40℃备用。
4、包被抗原冷冻干燥
为了便于长期保存和运输，需要将包被抗原进行冷冻干燥以得到固体状态的多肽。将预先冷冻好的包被抗原放置于Labconco的冷冻干燥机上进行干燥，得到固体状态的包被抗原。包装后贴上标签。标签上注明多肽的名称、编号、生产批号、浓度、生产日期、保存期限及保存条件。
实施例2、禽流感病毒H9亚型抗体酶联免疫检测试剂盒的制备
禽流感病毒H9亚型抗体酶联免疫检测试剂盒包括：
(1)包被有禽流感病毒H9亚型HA抗原的96孔可拆聚苯乙烯酶联反应板；2×96孔。
(2)阳性对照血清：是以禽流感病毒H9亚型灭活疫苗免疫后采集鸡血清，作为试剂盒的阳性对照血清(1管，1.5ml/管)。
(3)阴性对照血清：是无特定病原体(SPF)鸡血清，作为试剂盒的阴性对照血清(1管，1.5ml/管)。
(4)酶标二抗：是以辣根过氧化物酶标记兔抗鸡IgY(购自sigma公司，货号A9046)作为原液进行1:30000稀释后制得，2瓶(12ml/瓶)。
(5)样品稀释液：为含有5mg/ml酪蛋白的0.01M、pH值为7.4的磷酸盐缓冲液，1瓶(24ml/瓶)。
(6)底物液A：为含0.6mg/ml过氧化氢尿素的柠檬酸磷酸盐缓冲液(1瓶，12ml/瓶)
(7)底物液B：为0.2mg/ml的四甲基联苯胺(TMB)溶液(1瓶，12ml/瓶)。
(8)终止液：2mol/L的硫酸溶液(1瓶，12ml/瓶)。
(9)20倍浓缩洗涤液：为含有浓度为0.8％～1.2％(ml/ml)的Tween-20的0.01M，pH值为7.4的磷酸盐缓冲液(50ml/瓶，2瓶)。
根据需要，试剂盒中还可以有血清稀释板(2块，96孔/块)，用于血清样品的稀释。
其中，包被有禽流感病毒H9亚型HA抗原的96孔可拆聚苯乙烯酶联反应板的制备方法为：1.将实施例1制备的多肽抗原溶于pH 9.6的碳酸盐溶液，然后加到96孔聚苯乙烯酶联反应板，每孔150ng多肽组合物(其中序列表中序列1所示的多肽为50ng，序列表中序列2所示的多肽为50ng，序列表中序列3所示的多肽为50ng)，2～8℃下放置8～12小时，使多肽抗原与酶联反应板充分结合，然后按照300μl/孔加入含有10mg/ml牛血清白蛋白(BSA)pH7.4的PBS缓冲液，37℃封闭处理2～3小时，甩干后，待酶联反应板干燥后2～8℃密封保存。
实施例3、禽流感病毒H9亚型抗体酶联免疫检测试剂盒的敏感性试验
一、禽流感病毒H9亚型抗体酶联免疫检测试剂盒的使用方法
1、平衡：将试剂盒从冷藏环境中取出，置室温平衡30min备用；液体试剂用前混匀。
2、配液：将浓缩洗涤液用蒸馏水或去离子水20倍稀释得到洗涤缓冲液；
3、设定：2个阴性对照孔和2个阳性对照孔，其余为待测样本孔。
4、待测标本预稀释：使用样品稀释液将待检样品血清、阴性对照血清、阳性对照血清按照1：20的比例稀释。
5、加样：各孔分别按预先设定加100μl稀释的待测样本。加样过程时间跨度应尽量短。
6、温育：震荡混匀，置37℃温箱中，反应30min。
7、洗板：弃去反应液，每孔加300μl稀释后的洗涤缓冲液，浸泡15s，甩弃洗液，连续洗板4次后拍干。
8、加酶：各孔加100μl辣根过氧化物酶标记兔抗鸡IgY抗体。
9、温育：置37℃温箱，反应30min。
10、洗板：弃去反应液，每孔加入稀释后的洗涤缓冲液300μl，浸泡15s，甩弃洗涤液，连续洗板4次后拍干。
11、显色每孔加入100μl底物工作液(将底物液A和底物液B等量混合即为底物工作液，现用现配)，震荡混匀，置37℃温箱中，避光反应15min。
12、每孔加入显色终止液50μl，振荡混匀终止反应。
13、测定每孔的OD450nm值(加终止液的反应板应在15min内读取OD450nm值)。
检测结果的判定：
1、阴性对照OD450nm平均值应该≤0.15，否则无效。
2、阳性对照每个检测值应该在1.0～2.5之间，否则无效。
3、临界值的计算：临界值＝0.17×阳性对照OD450nm值平均值。
待检血清测定OD450nm值≥临界值者判为阳性；待检血清测定OD450nm值<临界值者判为阴性。
二、对已知阳性血清的敏感性试验
使用按照实施例2的方法制备的三批禽流感病毒H9亚型抗体酶联免疫检测试剂盒(批次ZM2018001、ZM2018002、ZM2018003)，以及单独使用序列1所示的多肽、序列2所示多肽或序列3所示的多肽替代实施例2中的多肽组合物制备的试剂盒(即序列1所示的多肽、序列2所示多肽和或系序列3所示的多肽替代实施例2中的多肽组合物，其他参数和方法均与实施例2试剂盒制备方法相同。制备得到的试剂盒均以其包被的多肽命名，以序列1、序列2或序列3表示)，分别依照上述禽流感病毒H9亚型抗体酶联免疫检测试剂盒使用方法对禽流感病毒H9亚型灭活疫苗(乾元浩生物股份有限公司南京生物药厂提供)免疫后鸡血清50份进行敏感性试验，实验结果见表3，本发明的禽流感病毒H9亚型抗体酶联免疫检测试剂盒共检测出49份，有1份未检出，结果表明本试剂盒对50份已知阳性血清的敏感性为98.0％。单独序列1制备试剂盒共检测出37份，表明该序列1对50份已知阳性血清的敏感性为74.0％；单独序列2制备试剂盒共检测出35份，表明该序列2对50份已知阳性血清的敏感性为70.0％；单独序列3制备试剂盒共检测出32份，表明该序列3对50份已知阳性血清的敏感性为64.0％。
表3禽流感病毒H9亚型抗体酶联免疫检测试剂盒的敏感性检测结果
试剂盒批号 检出率 敏感性
ZM2018001 49/50 98.0％
ZM2018002 49/50 98.0％
ZM2018003 49/50 98.0％
序列1 37/50 74.0％
序列2 35/50 70.0％
序列3 32/50 64.0％
三、最低检测限量试验
选取禽流感病毒H9亚型抗体阳性的鸡血清3份，进行倍比稀释1:20、1:40～1:320，使用实施例2制备的三批禽流感病毒H9亚型抗体酶联免疫检测试剂盒(批次ZM2018001、ZM2018002、ZM2018003)，以及如上所述的单独使用序列1所示的多肽、序列2所示的多肽或者序列3所示的多肽替代实施例2中多肽组合物制备的试剂盒(以序列1、序列2或序列3表示)，依照上述禽流感病毒H9亚型抗体酶联免疫检测试剂盒使用方法对倍比稀释鸡血清进行检测，结果表明，本发明试剂盒的可以检测到1:160倍稀释的阳性血清，其中，表4是其中一个批次试剂盒(表4中混合多肽)和三条单独序列制备试剂盒(表4中序列1、序列2或序列3)的实验结果。单独序列1或序列2或序列3制备试剂盒可以检测到1:80倍稀释的阳性血清。表4中，阳性对照：是以禽流感病毒H9亚型灭活疫苗免疫后采集鸡血清，作为试剂盒的阳性对照血清(1管，1.5ml/管)。阴性对照：是无特定病原体(SPF)鸡血清，作为试剂盒的阴性对照血清(1管，1.5ml/管)。临界值(Cut-off值)＝0.17×阳性对照OD450nm值平均值。
表4最低检测限量试验检测结果
实施例4、禽流感病毒H9亚型抗体酶联免疫检测试剂盒的特异性试验
使用实施例2中的三批试剂盒，以及如上所述的单独使用序列1所示的多肽、序列2所示的多肽和或者系序列3所示的多肽替代实施例2中多肽组合物制备的试剂盒(以序列1、序列2或序列3表示)，依照实施例3中所述的禽流感病毒H9亚型抗体酶联免疫检测试剂盒的使用方法对50份阴性血清(乾元浩生物股份有限公司南京生物药厂提供)、其他2份新城疫(ND)阳性血清、2份鸡马立克氏病(MD)阳性血清、2份鸡传染性支气管炎(IB)阳性血清、2份鸡传染性法氏囊(IBD)阳性血清均购自中国兽医药品监察所，分别进行检测。
试剂盒的特异性检测结果如下表(表5)显示，对50份阴性血清的检测结果显示，ZM2018001试剂盒的特异性为100.0％，ZM2018002试剂盒的特异性为100.0％，ZM2018003试剂盒的特异性为100.0％。对2份新城疫(ND)阳性血清、2份鸡马立克氏病(MD)阳性血清、2份鸡传染性支气管炎(IB)阳性血清、2份鸡传染性法氏囊(IBD)阳性血清的检测结果均显示为阴性，因此三个试剂盒对这8份相关病原阳性血清检测的特异性均为100％。单独使用序列1、或序列2或序列3制备的试剂盒对50份阳性血清和8份相关病原阳性血清检测的特异性均为100％。
表5禽流感病毒H9亚型抗体酶联免疫检测试剂盒特异性检测结果
实施例5、禽流感病毒H9亚型抗体酶联免疫检测试剂盒的符合率试验
目前禽流感病毒公认的检测方法是血凝抑制试验(HI)，因此用本试剂盒同HI试验进行符合率试验。
一、血凝抑制试验操作方法
1.1％鸡血红细胞悬液的制备
1)注射器吸取1mL阿氏液，抽取SPF鸡血液2～4mL，轻轻混匀，放入装有8mL左右阿氏液的离心管中再次混匀。
2)离心管中血样1800r/min转速离心8min，弃上清，沉淀再次加入阿氏液，轻混，1800r/min离心8min，移液器吸取上清弃掉，同时吸取红细胞沉淀上层的白细胞层，重复操作两次，加入20mL左右阿氏液轻轻混合成红细胞悬液。
3)取红细胞悬液，离心1800r/min 8min，弃去上清后，准确读取红细胞体积(mL)，加入9倍体积生理盐水，混合均匀。吸取1mL混合均匀的红细胞悬液，加入9mL生理盐水，混匀即为1％鸡血红细胞悬液。
2.血清样品的准备分别在免疫后第21d、28d、35d，翅静脉采血2mL，室温静置1h析出血清，将血清分装于标记好的EP管中备用。
3.血凝效价测定
1)在96孔微量反应板的1～12孔均加入25μL灭菌生理盐水；
2)吸取25μL抗原悬液加入第1孔中，充分混匀。
3)从第1孔中吸出25μL混合悬液加入到第2孔中，混匀后从第二孔中同样吸取25μL悬液加入到第三孔中，如此重复直到第11孔，从第11孔中吸出25μL悬液弃去。
4)每孔再加入25μL生理盐水。
5)每孔均加入25μL体积比为1％的鸡血红细胞溶液(用前充分摇匀)。
6)振荡均匀，37℃温箱中静置15～30min，待对照孔红细胞已沉淀孔底即可观察结果。
7)结果判定将板倾斜，观察血凝板，根据表6判断结果。
表6血凝实验结果判断标准
能使红细胞100％凝集(++++)的抗原最高稀释度为该抗原的血凝效价，即1个血凝单位。同时，对照孔应完全不凝集(-)否则此次检验无效。
4.血凝抑制试验
1)根据血凝实验的结果，配制4单位的病毒悬液。
2)在96孔微量反应板的1～11孔加入25μL生理盐水，第12孔加入50μL生理盐水。
3)吸取25μL血清加入第1孔内，混匀，吸取25μL混合液加入第二孔中混匀，依次倍比稀释至第10孔，从第10孔中吸取25μL弃去。
4)1～11孔均加入25μL 4单位的病毒悬液，室温静置30min。
5)每孔加入25μL体积比为1％的鸡血红细胞悬液，轻轻混匀，室温静置约40min，对照红细胞将全部呈纽扣状沉于孔底。
6)结果判定：以完全抑制4单位病毒的血清最高稀释倍数作为HI滴度。
二、符合率试验结果：
利用实施例2制备的禽流感病毒H9亚型抗体酶联免疫检测试剂盒(混合多肽)、如上所述单独序列1或序列2或序列3制备的试剂盒和HI试验对170份临床血清和50份免疫鸡阳性血清进行检测。
禽流感病毒H9亚型抗体酶联免疫检测试剂盒对220份血清的检测结果见表7，本发明试剂盒的敏感性为93.7％，而HI试验的敏感性为90.5％，在220份鸡血清中，两种方法检测结果一致的为211份，因此，本发明试剂盒和HI试验的符合率为95.9％，本发明试剂盒具有较高的敏感性。且本试剂盒与HI试验方法相比，操作简便、快速、敏感性和特异性高，结果判定直观。
序列1制备试剂盒对220份血清的检测结果见表8，序列1制备试剂盒的敏感性为78.2％，在220份鸡血清中，两种方法检测结果一致的为171份，因此，序列1试剂盒和HI试验的符合率为77.7％。
序列2制备试剂盒对220份血清的检测结果见表9，序列2制备试剂盒的敏感性为75.5％，在220份鸡血清中，两种方法检测结果一致的为177份，因此，序列2试剂盒和HI试验的符合率为80.5％。
序列3制备试剂盒对220份血清的检测结果见表10，序列3制备试剂盒的敏感性为70.5％，在220份鸡血清中，两种方法检测结果一致的为166份，因此，序列3试剂盒和HI试验的符合率为75.5％。
表7本试剂盒及HI试验法对220份血清的检测结果
表8序列1与HI试验法对220份血清的检测结果
表9序列2及HI试验法对220份血清的检测结果
表10序列3及HI试验法对220份血清的检测结果
序列表
<110> 中牧实业股份有限公司
<120> 禽流感病毒H9亚型抗体酶联免疫检测试剂盒
<130> WHOI180055
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 36
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<400> 1
Thr Ile Trp Asn Val Ser Tyr Asn Gly Thr Ser Thr Ala Cys Ser Gly
1 5 10 15
Ser Phe Tyr Lys Ser Met Arg Trp Leu Thr Arg Lys Asn Gly Asn Tyr
20 25 30
Pro Ile Gln Asp
35
<210> 2
<211> 36
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<400> 2
Gln Gly Lys Asn Ile Leu Phe Met Trp Gly Ile Asn His Pro Pro Thr
1 5 10 15
Asp Thr Thr Gln Arg Glu Leu Tyr Thr Arg Ile Asp Thr Thr Thr Ser
20 25 30
Val Ala Thr Glu
35
<210> 3
<211> 32
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<400> 3
Glu Ile Asn Arg Val Phe Lys Pro Leu Ile Gly Pro Arg Pro Leu Val
1 5 10 15
Asn Gly Leu Met Gly Arg Ile Asp Tyr Tyr Trp Ser Val Leu Lys Pro
20 25 30

Claims (10)

1.禽流感病毒H9亚型HA蛋白抗原表位多肽组合物，为序列表中序列1所示的多肽、序列表中序列2所示的多肽或序列表中序列3所示的多肽中的一种或两种以上的任意组合。
2.根据权利要求1所述禽流感病毒H9亚型HA蛋白抗原表位多肽组合物，其特征在于：当所述多肽为序列1、序列2和序列3所示的多肽中的两种时，两种多肽的质量比为(0.5～1.5)：(0.5～1.5)；优选的，它们的质量比为1：1；当所述多肽组合物由序列1所示的多肽、序列2所示的多肽和序列3所示的多肽组成时，它们的质量比为(0.5～1.5)：(0.5～1.5)：(0.5～1.5)；优选的，它们的质量比为1：1：1。
3.一种禽流感病毒H9亚型抗体酶联免疫检测试剂盒，包括酶联反应板、阳性对照血清、阴性对照血清、酶标二抗，其中所述酶联反应板包被有权利要求1或2所述的禽流感病毒H9亚型HA蛋白抗原表位多肽组合物。
4.根据权利要求3所述的酶联免疫检测试剂盒，其特征在于：所述酶联反应板为可拆卸96孔酶标板；所述禽流感病毒H9亚型HA蛋白抗原表位多肽组合物中各个多肽为化学人工合成得到。
5.根据权利要求3所述的酶联免疫检测试剂盒，其特征在于：所述酶联反应板的获得方法是将权利要求1或2所述禽流感病毒H9亚型HA蛋白抗原表位多肽组合物溶于100μl的pH9.6的碳酸盐溶液，然后加到96孔聚苯乙烯酶联反应板，每孔150ng禽流感病毒H9亚型HA蛋白抗原表位多肽组合物，2～8℃下放置8～12小时，使禽流感病毒H9亚型HA蛋白抗原表位多肽组合物与酶联反应板充分结合，然后按照300μl/孔加入含有0.01g/ml牛血清白蛋白pH7.4的PBS缓冲液，37℃封闭处理2～3小时，甩干后，待酶联反应板干燥后2～8℃密封保存。
6.根据权利要求3所述的酶联免疫检测试剂盒，其特征在于：
所述阳性对照血清为所述禽流感病毒H9亚型灭活疫苗免疫后采集的鸡血清；所述阴性对照血清为无特定病原体的鸡血清。
7.根据权利要求3所述的酶联免疫检测试剂盒，其特征在于：所述酶标二抗为辣根过氧化物酶标记兔抗鸡IgY抗体。
8.根据权利要求3所述的酶联免疫检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括底物液A、底物液B和终止液；所述底物液A为含0.6mg/ml过氧化氢尿素的柠檬酸磷酸盐缓冲液，所述底物液B为0.2mg/ml的四甲基联苯胺溶液，使用时两者以1:1的比例混合；所述终止液为2mol/L的硫酸溶液。
9.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括样品稀释液和20倍浓缩洗涤液；样品稀释液为含有5mg/ml酪蛋白的0.01M、pH值为7.4的磷酸盐缓冲液；20倍浓缩洗涤液为含有体积百分浓度为0.8％～1.2％的Tween-20的0.01M，pH值为7.4的磷酸盐缓冲液。
10.禽流感病毒H9亚型HA蛋白抗原表位多肽，为序列表中序列1所示的多肽、序列表中序列2所示的多肽或序列表中序列3所示的多肽。
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