CN109234382A - 预判断脓毒症感染情况的荧光定量pcr检测试剂盒及其方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了预判断脓毒症感染情况的荧光定量PCR检测试剂盒及其方法，包括检测试剂盒，所述检测试剂盒的内部设有糖皮质激素、可溶性尿激酶型纤溶酶、聚合酶、血乳酸、白细胞介素、SYBR Green I荧光染料、Mg2+和ROX校正染料和复合菌门。本发明的方法所得到的组分诊断结果，较为准确，而且具有费用低，能对脓毒症感染进行系统型检测分析，使用的试剂盒原料成本较低，并且整个方法较为科学效率，值得推广。

Description

预判断脓毒症感染情况的荧光定量PCR检测试剂盒及其方法
技术领域
本发明涉及医疗鉴定技术领域，尤其是预判断脓毒症感染情况的荧光定量PCR检测试剂盒及其方法。
背景技术
脓毒症(sepsis)是指由感染引起的全身炎症反应综合征(systemicinflammatory response syndrome,SIRS)，临床上证实有细菌存在或有高度可疑感染灶。虽然脓毒症是由感染引起，但是一旦发生后，其发生发展遵循其自身的病理过程和规律，故从本质上讲脓毒症是机体对感染性因素的反应。脓毒症发生率高，全球每年有超过1800万严重脓毒症病例，美国每年有75万例脓毒症患者，并且这一数字还以每年1.5％～8.0％的速度上升。脓毒症的病情凶险，病死率高，全球每天约14,000人死于其并发症，美国每年约21.5万人死亡。据国外流行病学调查显示，脓毒症的病死率已经超过心肌梗死，成为重症监护病房内非心脏病人死亡的主要原因。近年来，尽管抗感染治疗和器官功能支持技术取得了长足的进步，脓毒症的病死率仍高达30％～70％。脓毒症治疗花费高，医疗资源消耗大，严重影响人类的生活质量，已经对人类健康造成巨大威胁。
但是，目前脓毒症原组分检测在我国的使用具有较大的局限性，国内并未出现科学的采集方法以及检测技术，给进一步的诊断和治疗增加了难度，针对以上，在这里我们提出预判断脓毒症感染情况的荧光定量PCR检测试剂盒及其方法。
发明内容
本发明针对背景技术中的不足，提供了预判断脓毒症感染情况的荧光定量PCR检测试剂盒及其方法。
本发明为解决上述技术不足，采用改性的技术方案，预判断脓毒症感染情况的荧光定量PCR检测试剂盒及其方法，包括检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒的内部设有糖皮质激素、可溶性尿激酶型纤溶酶、聚合酶、血乳酸、白细胞介素、SYBR Green I荧光染料、Mg2+和ROX校正染料和复合菌门。
还包括以下检测步骤，
S1，首先对人体的血液进行提取，然后将血液放入试剂盒中；
S2，将步骤S1中的血液进行测定；
S3，鉴定血液中不同组分；
S4，鉴定各个组织细胞炎症程度；
S5，显色综合结果分析
作为本发明的进一步优选方式，步骤S1中，提取方法包括，首先将病患的血液：在6mmol/L PBS中加入3.5％聚乙烯聚吡咯烷酮、2mmol/L乙二胺四乙酸二钠、10mmol/L乙二基二硫代氨基甲酸酯；然后进行离心加工，离心力设为8000g，时间控制为25min，再取上清，过0.2um滤膜，其次进行透析：将透析袋置于沸水中5min后冷却；将透析后的血液分装至清洁的6ml玻璃小瓶内，分别放入试剂盒中进行反应，控制35min。
作为本发明的进一步优选方式，步骤S3中，鉴定血液中不同组分包括；将步骤S1反应后的血液凝固，然后切取0.02mm膜1张，将膜置于100％甲醇中10s，充分浸透后膜变为半透明状，然后置入转印缓冲液中浸透，切取同样大小滤纸6张，将血液膜浸入100％甲醇中振摇5min，充分润湿后再使用，以丽春红S染色3min，用蒸馏水脱色，换液数次后，可检测蛋白条带转移效果，继续用蒸馏水脱色至染料基本脱尽，再用氨基黑10B染色3min，回收染料后以100％甲醇脱色，换液数次即可清楚显示血液的蛋白条带，置滤纸上自然干燥待分析。
作为本发明的进一步优选方式，步骤S4中，测定方法步骤包括如下，先用去离子水溶解BSA，配制6个不同浓度的BSA溶液——0.65、0.54、0.43、0.32、0.11、0.05mg/ml作为标准浓度；向每瓶中加入20ml稀释染色剂，然后其放入步骤S1中试剂盒中，将充分振荡混匀后在室温下反应5min，用分光光度计读取595nm下的吸光度值A595nm，以各浓度BSA的吸光度值A595nm绘制标准曲线，通过线性拟合求出线性方程，代入样品吸光度值即可算出血液中的炎症程度。
作为本发明的进一步优选方式，步骤S5中，首先需要配制ECL显色液：分别取等体积的步骤S1中溶液A和B混匀后使用；然后用镊子将血液膜取出，沥干洗液但勿使膜完全干燥，用微量加样器将新鲜配制的ECL显色液滴于膜上待显色区域，孵育1min后准备曝光，将杂交膜贴于曝光板上，放在暗室内，连续曝光一段时间，如数秒到数分钟，获取图像，分析结果。
作为本发明的进一步优选方式，所述复合菌门包括拟杆菌门、厚壁菌门、变形菌门和放线菌门。
本发明所达到的有益效果是：本发明的方法所得到的组分诊断结果，较为准确，而且具有费用低，能对脓毒症感染进行系统型检测分析，使用的试剂盒原料成本较低，并且整个方法较为科学效率，值得推广。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明提供一种技术方案：预判断脓毒症感染情况的荧光定量PCR检测试剂盒及其方法，包括检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒的内部设有糖皮质激素、可溶性尿激酶型纤溶酶、聚合酶、血乳酸、白细胞介素、SYBR Green I荧光染料、Mg2+和ROX校正染料和复合菌门。
还包括以下检测步骤，
S1，首先对人体的血液进行提取，然后将血液放入试剂盒中；
S2，将步骤S1中的血液进行测定；
S3，鉴定血液中不同组分；
S4，鉴定各个组织细胞炎症程度；
S5，显色综合结果分析
步骤S1中，提取方法包括，首先将病患的血液：在6mmol/L PBS中加入3.5％聚乙烯聚吡咯烷酮、2mmol/L乙二胺四乙酸二钠、10mmol/L乙二基二硫代氨基甲酸酯；然后进行离心加工，离心力设为8000g，时间控制为25min，再取上清，过0.2um滤膜，其次进行透析：将透析袋置于沸水中5min后冷却；将透析后的血液分装至清洁的6ml玻璃小瓶内，分别放入试剂盒中进行反应，控制35min。
步骤S3中，鉴定血液中不同组分包括；将步骤S1反应后的血液凝固，然后切取0.02mm膜1张，将膜置于100％甲醇中10s，充分浸透后膜变为半透明状，然后置入转印缓冲液中浸透，切取同样大小滤纸6张，将血液膜浸入100％甲醇中振摇5min，充分润湿后再使用，以丽春红S染色3min，用蒸馏水脱色，换液数次后，可检测蛋白条带转移效果，继续用蒸馏水脱色至染料基本脱尽，再用氨基黑10B染色3min，回收染料后以100％甲醇脱色，换液数次即可清楚显示血液的蛋白条带，置滤纸上自然干燥待分析。
步骤S4中，测定方法步骤包括如下，先用去离子水溶解BSA，配制6个不同浓度的BSA溶液——0.65、0.54、0.43、0.32、0.11、0.05mg/ml作为标准浓度；向每瓶中加入20ml稀释染色剂，然后其放入步骤S1中试剂盒中，将充分振荡混匀后在室温下反应5min，用分光光度计读取595nm下的吸光度值A595nm，以各浓度BSA的吸光度值A595nm绘制标准曲线，通过线性拟合求出线性方程，代入样品吸光度值即可算出血液中的炎症程度。
步骤S5中，首先需要配制ECL显色液：分别取等体积的步骤S1中溶液A和B混匀后使用；然后用镊子将血液膜取出，沥干洗液但勿使膜完全干燥，用微量加样器将新鲜配制的ECL显色液滴于膜上待显色区域，孵育1min后准备曝光，将杂交膜贴于曝光板上，放在暗室内，连续曝光一段时间，如数秒到数分钟，获取图像，分析结果。
所述复合菌门包括拟杆菌门、厚壁菌门、变形菌门和放线菌门。
本发明判断方法表格如下：表1
传统判断方法表格如下：表1
。
综上本发明的方法所得到的组分诊断结果，较为准确，而且具有费用低，能对脓毒症感染进行系统型检测分析，使用的试剂盒原料成本较低，并且整个方法较为科学效率，值得推广。
以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点,对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。

Claims (7)

1.预判断脓毒症感染情况的荧光定量PCR检测试剂盒及其方法，包括检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒的内部设有糖皮质激素、可溶性尿激酶型纤溶酶、聚合酶、血乳酸、白细胞介素、SYBR Green I荧光染料、Mg2+和ROX校正染料和复合菌门。
2.根据权利要求1所述的预判断脓毒症感染情况的荧光定量PCR检测试剂盒及其方法，其特征在于，还包括以下检测步骤，
S1，首先对人体的血液进行提取，然后将血液放入试剂盒中；
S2，将步骤S1中的血液进行测定；
S3，鉴定血液中不同组分；
S4，鉴定各个组织细胞炎症程度；
S5，显色综合结果分析。
3.根据权利要求1所述的预判断脓毒症感染情况的荧光定量PCR检测试剂盒及其方法，其特征在于，步骤S1中，提取方法包括，首先将病患的血液：在6mmol/L PBS中加入3.5％聚乙烯聚吡咯烷酮、2mmol/L乙二胺四乙酸二钠、10mmol/L乙二基二硫代氨基甲酸酯；然后进行离心加工，离心力设为8000g，时间控制为25min，再取上清，过0.2um滤膜，其次进行透析：将透析袋置于沸水中5min后冷却；将透析后的血液分装至清洁的6ml玻璃小瓶内，分别放入试剂盒中进行反应，控制35min。
4.根据权利要求1所述的预判断脓毒症感染情况的荧光定量PCR检测试剂盒及其方法，其特征在于，步骤S3中，鉴定血液中不同组分包括；将步骤S1反应后的血液凝固，然后切取0.02mm膜1张，将膜置于100％甲醇中10s，充分浸透后膜变为半透明状，然后置入转印缓冲液中浸透，切取同样大小滤纸6张，将血液膜浸入100％甲醇中振摇5min，充分润湿后再使用，以丽春红S染色3min，用蒸馏水脱色，换液数次后，可检测蛋白条带转移效果，继续用蒸馏水脱色至染料基本脱尽，再用氨基黑10B染色3min，回收染料后以100％甲醇脱色，换液数次即可清楚显示血液的蛋白条带，置滤纸上自然干燥待分析。
5.根据权利要求1所述的预判断脓毒症感染情况的荧光定量PCR检测试剂盒及其方法，其特征在于，步骤S4中，测定方法步骤包括如下，先用去离子水溶解BSA，配制6个不同浓度的BSA溶液——0.65、0.54、0.43、0.32、0.11、0.05mg/ml作为标准浓度；向每瓶中加入20ml稀释染色剂，然后其放入步骤S1中试剂盒中，将充分振荡混匀后在室温下反应5min，用分光光度计读取595nm下的吸光度值A595nm，以各浓度BSA的吸光度值A595nm绘制标准曲线，通过线性拟合求出线性方程，代入样品吸光度值即可算出血液中的炎症程度。
6.根据权利要求1所述的预判断脓毒症感染情况的荧光定量PCR检测试剂盒及其方法，其特征在于，步骤S5中，首先需要配制ECL显色液：分别取等体积的步骤S1中溶液A和B混匀后使用；然后用镊子将血液膜取出，沥干洗液但勿使膜完全干燥，用微量加样器将新鲜配制的ECL显色液滴于膜上待显色区域，孵育1min后准备曝光，将杂交膜贴于曝光板上，放在暗室内，连续曝光一段时间，如数秒到数分钟，获取图像，分析结果。
7.根据权利要求1所述的预判断脓毒症感染情况的荧光定量PCR检测试剂盒及其方法，其特征在于，所述复合菌门包括拟杆菌门、厚壁菌门、变形菌门和放线菌门。
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