CN109234370A - Mut基因突变检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种MUT基因突变检测试剂盒，所述检测试剂盒包含：12对MUT基因特异性扩增引物、7条MUT基因特异性探针和1条MUT基因野生序列封阻探针；所述12对MUT基因特异性扩增引物的序列分别如SEQ ID NO.1‑SEQ ID NO.24所示；所述7条MUT基因特异性探针的序列分别如SEQ ID NO.25‑SEQ ID NO.31所示；所述MUT基因野生序列封阻探针的序列如SEQ ID NO.32所示。该试剂盒能快速、准确、灵敏的检测MUT基因突变，并可将突变检测敏感度提高至0.01％。
Description
技术领域
本发明涉及基因突变检测技术领域，具体涉及一种MUT基因突变检测试剂盒。
背景技术
甲基丙二酸血症(methylmalonic academia，MMA)是先天有机酸代谢异常中最常见的病种，主要是由于甲基丙二酰辅酶A变位酶(mutaseapoenzyme，mut)自身缺陷或其辅酶钴胺素(Cobalamin，Cbl，VitB12)代谢缺陷所致。变位酶缺陷包括完全缺陷mut0型，部分缺陷mut-型。钴胺素代谢缺陷包括cblA、cblB、cblC、cblD、cblE、cblF、cblG和cblH 8种亚型，其中cblC、cblD和cblF可导致辅酶脱氧腺苷钴胺素和甲基钴胺素合成障碍，引起体内甲基丙二酸、同型半胱氨酸等代谢物异常蓄积，故称为甲基丙二酸血症伴同型半胱氨酸血症(简称合并型MMA)。临床表现为神经、肝脏、肾脏、骨髓等多脏器损伤，以cblC型最为常见，其编码基因为MMACHC，定位于染色体1p34.1，属于常染色体隐性遗传病。
单纯甲基丙二酸血症中编码甲基丙二酰辅酶A变位酶的基因命名为MUT，定位于6p21，含13个外显子，总长35kb。至今已发现170余种突变，多为无义突变、错义突变和剪接位点的突变，缺失和插入突变较少，且大部分影响了MCM两个主要结构域，即C-端腺苷钴胺素结合区和N-端底物CoA结合区。
目前对于基因突变的检测方法主要有测序法和ARMS-PCR方法，但这两种方法都存在其中一定缺陷，其中，测序法灵敏度较低约20％，且操作复杂，检测时间较长，假阴性率较高。ARMS-PCR方法能够达到1％的灵敏度，但是检测成本过高，限制了其临床的推广和应用。
发明内容
针对上述现有技术，本发明的目的是提供一种MUT基因突变检测试剂盒。该试剂盒能快速、准确、灵敏的检测MUT基因突变，并可将突变检测敏感度提高至0.01％。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明的第一方面，提供一种MUT基因突变检测试剂盒，所述检测试剂盒包含：12对MUT基因特异性扩增引物、7条MUT基因特异性探针和1条MUT基因野生序列封阻探针；
所述12对MUT基因特异性扩增引物的序列分别如SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.24所示；
所述7条MUT基因特异性探针的序列分别如SEQ ID NO.25-SEQ ID NO.31所示；
所述MUT基因野生序列封阻探针的序列如SEQ ID NO.32所示。
其中，12对MUT基因特异性扩增引物是用于选择性扩增MUT基因2、3、4、6、8、9、12这7个外显子上的突变序列，具体如下：
Ex2F1：5，-GGGCATCATCTAAACTATCTTC-3，；(SEQ ID NO.1)
Ex2R1：5，-TGAGTAGCTCCTATTTCCCAC-3，；(SEQ ID NO.2)
Ex2F2：5，-GAAGATATGCCCGTAGCTCCTA-3，；(SEQ ID NO.3)
Ex2R2：5，-GTAGCTCTCCCACATCATTAGC-3，；(SEQ ID NO.4)
Ex3F1：5，-ACTTTGTGCAACATATTCACCG-3，；(SEQ ID NO.5)
Ex3R1：5，-GAATGGAGCAAGGAATTGCA-3，；(SEQ ID NO.6)
Ex3F2：5，-ATCTGGCGAATGTAGTTATG-3，；(SEQ ID NO.7)
Ex3R2：5，-CATGTTCTGATAATTGAAGT-3，；(SEQ ID NO.8)
Ex4F1：5，-TCCATGAAAATTATTGCTGAGA-3，；(SEQ ID NO.9)
Ex4R1：5，-ATCTGTTGCCCAGATTCCTGC-3，；(SEQ ID NO.10)
Ex4F2：5，-CATGCTATCCTCCGGATGCAG-3，；(SEQ ID NO.11)
Ex4R2：5，-GTAGTAGCTGTCGTTTAACTC-3，；(SEQ ID NO.12)
Ex4F3：5，-CTAATTTTATGGTAGCTCCGC-3，；(SEQ ID NO.13)
Ex4R3：5，-GCATCTATTTCGCTGCCAGAT-3，；(SEQ ID NO.14)
Ex6F1：5，-GATGCAGATGTAGGACCTAA-3，；(SEQ ID NO.15)
Ex6R1：5，-CATGCTATAACTGGTTATTGTT-3，；(SEQ ID NO.16)
Ex8F1：5，-GCTCTCCCACTATATAGTCTATA-3，；(SEQ ID NO.17)
Ex8R1：5，-GAATTTAGCTCCTTATCTGAG-3，；(SEQ ID NO.18)
Ex9F1：5，-CAACATGCTAGATGCAGTTGTG-3，；(SEQ ID NO.19)
Ex9R1：5，-GTTCTGTCGTTACTTGAATAC-3，；(SEQ ID NO.20)
Ex12F1：5，-TCCCTCAAGATAATCATCTA-3，；(SEQ ID NO.21)
Ex12R1：5，-GTTGCTATTGACACAGCAAAG-3，；(SEQ ID NO.22)
Ex12F2：5，-CCTTGAATGTAGTGAAGTCCA-3，；(SEQ ID NO.23)
Ex12R2：5，-GAATGTTTCCGAAATTCACAG-3，。(SEQ ID NO.24)
上述引物的Tm值在48-60℃，低于PCR反应复性温度5-17℃，以提高突变检测的特异性。
MUT基因特异性探针的5，端标记荧光基团，3，端标记荧光淬灭基团，本发明针对MUT基因2、3、4、6、8、9、12这7个外显子设计了7条探针，用于对MUT基因这7个外显子上的基因突变进行检测，7条MUT基因特异性探针的序列具体如下：
Ep2：5，-GTCGTCAGTTGTGAGACACTGG-3，；(SEQ ID NO.25)
Ep3：5，-ACATGCTAAGAACAAGGTGT-3，；(SEQ ID NO.26)
Ep4：5，-TACAACATGCTATAGTGAAGTAGACA-3，；(SEQ ID NO.27)
Ep6：5，-CATCGTGGCTATTCCTCCAGAATA-3，；(SEQ ID NO.28)
Ep8：5，-ATGTAGGAATGTTGTGAAGCTGTC-3，；(SEQ ID NO.29)
Ep9：5，-GAATGGCTATGGTTCGAACGAAATTC-3，；(SEQ ID NO.30)
Ep12：5，-CAAGGTTATAGTAACGCAAAGGT-3，；(SEQ ID NO.31)
MUT基因野生序列封阻探针是用于封阻野生型MUT基因模板，从而进一步提高突变模板选择性放大的特异性。本发明所设计的MUT基因野生序列封阻探针，其序列部分与MUT基因突变热点野生型序列互补，3，端修饰磷酸基团，以阻断其3，端延伸功能，其具体序列如下：
Bp：5，-CTTCCACGCTTTAAGATTTCCCA-PO4-3，；(SEQ ID NO.32)
本发明的所述试剂盒中还包含有：PCR反应液、阳性参比品和阴性参比品。
作为优选，每10μL的PCR反应液中含有：DNA聚合酶0.25-1U、dNTPs0.5-1.5mM、UNG酶0.5-1.0U、MgCl21-4mM。
更优选的，每10μL的PCR反应液中含有：DNA聚合酶0.5U、dNTPs 1.0mM、UNG酶0.6U、MgCl23mM。
作为优选，所述阳性参比品为MUT基因突变阳性序列，可以为纯化PCR产物或者嵌入MUT基因突变阳性序列的人工质粒。
作为优选，所述阴性参比品为野生型MUT基因序列，可以为纯化PCR产物或者嵌入野生型MUT基因序列的人工质粒。
作为优选，所述12对MUT基因特异性扩增引物分装或混装在一起；更优选的，所述12对MUT基因特异性扩增引物以等摩尔比混装在一起。
作为优选，所述7条MUT基因特异性探针分装或混装在一起；更优选的，所述7条MUT基因特异性探针以等摩尔比混装在一起。
本发明的第二方面，提供一种利用上述试剂盒检测MUT基因突变的方法，包括以下步骤：
(1)提取待测样本DNA，作为模板；
(2)建立实时荧光PCR反应体系，于荧光定量PCR仪上进行荧光定量PCR反应；
(3)根据Ct值判断检测MUT基因突变情况；若待测样本的Ct值为0或大于35，则判为阴性；若待测样本的Ct值小于等于35，则判为阳性。
优选的，步骤(2)中，荧光定量PCR反应的条件为：95℃预变性10min；随后94℃15s，65℃20s，共30个循环。
上述检测MUT基因突变的过程中，利用阳性参比品和阴性参比品判定体系的有效性。若阴性参比品的Ct值为0或大于40，阳性参比品的Ct值大于20小于35时，结果可信。
本发明由于采用了特异性引物和探针配合，选择性扩增MUT基因突变序列，以及用封阻探针封闭野生型DNA序列对引物对突变型序列进行信号放大时可能造成的干扰，以提高突变检测的特异性和灵敏度。
利用本发明的试剂盒能够检测MUT基因发生在第2、3、4、6、8、9、12外显子上的12种基因突变，具体见表1。
| 位点分布 | 碱基改变 | 突变类型 |
| 外显子2 | c.103C>T | 错义突变 |
| 外显子2 | c.323G>A | 错义突变 |
| 外显子3 | c.424A>G | 错义突变 |
| 外显子3 | c.636A>G | 同义突变 |
| 外显子4 | c.729insTT | 插入突变 |
| 外显子4 | c.786T>G | 错义突变 |
| 外显子4 | c.808G>C | 错义突变 |
| 外显子6 | c.1323_1324insA | 插入突变 |
| 外显子8 | c.1459G>A | 错义突变 |
| 外显子9 | c.1595A>G | 错义突变 |
| 外显子12 | c.1992G>A | 同义突变 |
| 外显子12 | c.2011G>A | 错义突变 |
由于本发明的检测试剂盒是在一个反应体系中进行多个位点、多个基因片段的特异性扩增，但在PCR反应过程中引物间的竞争、非特异性反应和错配的发生率会随着模板、引物和探针种类的增多而增大。如果引物及探针设计的不合理，不引起引物以及探针间的竞争，导致一些靶标条带无法扩增；引物及探针浓度比例搭配的不合理也会使反应体系产生非特异性条带。因此引物对的设计、引物浓度的合理配比是PCR反应的关键。使用本发明的试剂盒检测MUT基因突变，优选的将12对MUT基因特异性扩增引物以等摩尔比混装在一起，将7条MUT基因特异性探针以等摩尔比混装在一起，在构建PCR反应体系时，将引物混合液、探针混合液和MUT基因野生序列封阻探针按体积比为4:2:0.5混合在一起，作为引物探针混合液，能够保证MUT基因突变位点均能得到有效扩增，并且特异性强，检测结果的准确性高。
本发明的有益效果：
本发明的试剂盒的灵敏度高，可以检出低至1-10拷贝的突变，突变检测敏感度提高至0.01％；准确率高；特异性强；检测速度快，检测过程只需要60分钟即可完成；可适用于多种类型样本的检测，检测结果的稳定性好，检测稳定性在0.5％-5％之间。
附图说明
图1：采用本发明的试剂盒检测MUT基因人工质粒；图中，当DNA模板终浓度为5×104拷贝时，试剂盒能够检测突变含量为0.01％的样本。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本申请的技术方案。
本发明实施例中所用的未进行具体说明试验材料均为本领域常规的试验材料，均可通过商业渠道购买得到。
实施例1：检测MUT基因人工质粒
1、人工质粒DNA纯化：
用QIAprep Spin Miniprep(Qiagen)试剂盒纯化MUT野生型和突变型人工质粒。纯化后的质粒用Quant-iT PicoGreen(Invitrogen)试剂盒定量，用TE缓冲液稀释到DNA终浓度为1×104拷贝/μL，突变质粒含量分别是0.01％、0.1％、1％、10％、100％。
2、荧光定量PCR反应体系的构建：
将预先配制好的PCR反应液12μL、引物探针混合液8μL、DNA模板5μL，混合在一起构成25μL反应体系。
其中，每10μL的PCR反应液中含有：DNA聚合酶0.5U、dNTPs 1.0mM、UNG酶0.6U、MgCl23mM。
将12对MUT基因特异性扩增引物(SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.24所示)以等摩尔比混装在一起，将7条MUT基因特异性探针(SEQ ID NO.25-SEQ ID NO.31所示)以等摩尔比混装在一起，然后将引物混合液、探针混合液和MUT基因野生序列封阻探针(SEQ ID NO.32所示)按体积比为4:2:0.5混合在一起，作为引物探针混合液。
同时用不含核酸的TE缓冲液作为阴性对照。
3、PCR反应及数据分析
PCR反应条件为：95℃预变性10min；随后94℃15s，65℃20s，共30个循环。
PCR反应结果见图1，由图1可以看出，DNA总量为5×104拷贝可以检测低至0.01％的突变。
实施例2：临床样本检测
取40份已知检测结果的临床血液样本(其中阳性样本23份，阴性样本17份)，分别采用本发明的试剂盒和DNA测序法进行检测。结果见表2。
表2：检测结果比较
| 检测方法 | MUT基因突变 | MUT基因野生 | 检出率 |
| 本发明 | 23 | 17 | 100％ |
| DNA测序 | 19 | 21 | 82.6％ |
以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。
序列表
<110> 张开慧
<120> MUT基因突变检测试剂盒
<130> 2018
<160> 32
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 1
gggcatcatc taaactatct tc 22
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 2
tgagtagctc ctatttccca c 21
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 3
gaagatatgc ccgtagctcc ta 22
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 4
gtagctctcc cacatcatta gc 22
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 5
actttgtgca acatattcac cg 22
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 6
gaatggagca aggaattgca 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 7
atctggcgaa tgtagttatg 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 8
catgttctga taattgaagt 20
<210> 9
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 9
tccatgaaaa ttattgctga ga 22
<210> 10
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 10
atctgttgcc cagattcctg c 21
<210> 11
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 11
catgctatcc tccggatgca g 21
<210> 12
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 12
gtagtagctg tcgtttaact c 21
<210> 13
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 13
ctaattttat ggtagctccg c 21
<210> 14
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 14
gcatctattt cgctgccaga t 21
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 15
gatgcagatg taggacctaa 20
<210> 16
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 16
catgctataa ctggttattg tt 22
<210> 17
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 17
gctctcccac tatatagtct ata 23
<210> 18
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 18
gaatttagct ccttatctga g 21
<210> 19
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 19
caacatgcta gatgcagttg tg 22
<210> 20
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 20
gttctgtcgt tacttgaata c 21
<210> 21
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 21
tccctcaaga taatcatcta 20
<210> 22
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 22
gttgctattg acacagcaaa g 21
<210> 23
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 23
ccttgaatgt agtgaagtcc a 21
<210> 24
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 24
gaatgtttcc gaaattcaca g 21
<210> 25
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 25
gtcgtcagtt gtgagacact gg 22
<210> 26
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 26
acatgctaag aacaaggtgt 20
<210> 27
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 27
tacaacatgc tatagtgaag tagaca 26
<210> 28
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 28
catcgtggct attcctccag aata 24
<210> 29
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 29
atgtaggaat gttgtgaagc tgtc 24
<210> 30
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 30
gaatggctat ggttcgaacg aaattc 26
<210> 31
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 31
caaggttata gtaacgcaaa ggt 23
<210> 32
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 32
cttccacgct ttaagatttc cca 23
Claims (10)
1.一种MUT基因突变检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒包含：12对MUT基因特异性扩增引物、7条MUT基因特异性探针和1条MUT基因野生序列封阻探针；
所述12对MUT基因特异性扩增引物的序列分别如SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.24所示；
所述7条MUT基因特异性探针的序列分别如SEQ ID NO.25-SEQ ID NO.31所示；
所述MUT基因野生序列封阻探针的序列如SEQ ID NO.32所示。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包含有：PCR反应液、阳性参比品和阴性参比品。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，每10μL的PCR反应液中含有：DNA聚合酶0.25-1U、dNTPs0.5-1.5mM、UNG酶0.5-1.0U、MgCl21-4mM。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，每10μL的PCR反应液中含有：DNA聚合酶0.5U、dNTPs 1.0mM、UNG酶0.6U、MgCl23mM。
5.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述阳性参比品为MUT基因突变阳性序列。
6.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述阴性参比品为野生型MUT基因序列。
7.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述12对MUT基因特异性扩增引物分装或混装在一起；优选的，所述12对MUT基因特异性扩增引物以等摩尔比混装在一起。
8.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述7条MUT基因特异性探针分装或混装在一起；优选的，所述7条MUT基因特异性探针以等摩尔比混装在一起。
9.利用权利要求1-8任一项所述的试剂盒检测MUT基因突变的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)提取待测样本DNA，作为模板；
(2)建立实时荧光PCR反应体系，于荧光定量PCR仪上进行荧光定量PCR反应；
(3)根据Ct值判断检测MUT基因突变情况；若待测样本的Ct值为0或大于35，则判为阴性；若待测样本的Ct值小于等于35，则判为阳性。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，荧光定量PCR反应的条件为：95℃预变性10min；随后94℃15s，65℃20s，共30个循环。
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