CN109232932B - 一种基于羊毛角蛋白皮质细胞制备增强增韧的左旋聚乳酸复合膜的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种基于羊毛角蛋白皮质细胞制备增强增韧的左旋聚乳酸复合膜的方法，属于高分子材料制备领域。本方法首先将聚乳酸溶解于三氯甲烷中；然后将左旋聚乳酸和羊毛角蛋白皮质细胞混合，并加入聚乳酸溶液中；之后将混合溶液在常温下搅拌均匀；最后将混合溶液倒入成膜器，在室温下通风口处放置1‑2天，自然成膜，得到皮质细胞增强增韧的左旋聚乳酸复合膜；本发明以简单的方法，制备出增强增韧的聚乳酸复合膜，可用于包装等领域。

Description

一种基于羊毛角蛋白皮质细胞制备增强增韧的左旋聚乳酸复 合膜的方法

技术领域

本发明属于高分子材料制备领域，具体涉及一种基于羊毛角蛋白皮质细胞制备增强增韧的左旋聚乳酸复合膜的方法。

背景技术

随着社会的不断发展，人们对于环保材料的需求日益增加。近年来，源于可再生、可降解的天然高分子材料受到广泛关注。废弃羊毛角蛋白，是一类典型的高交联蛋白质，具有耐水稳定性好、导热系数小(隔热性能好)、隔音、不易燃烧、弹性好等优点。我国每年约产生100万吨的废弃羊毛角蛋白，绝大部分被填埋而未被充分利用。废弃羊毛角蛋白有以下主要来源：(1)羊毛纺织品消费领域；(2)羊毛纺织品加工领域：原料初加工、毛纺、毛织、服装等工程中产生的各种废弃100％羊毛纤维、回丝、废纱、废布等；(3)屠宰行业产生的废弃羊毛角蛋白等。

羊毛纤维的结构主要分为鳞片层、皮质层与髓质层三个部分，如图1。鳞片层是指包覆在纤维最外部的一层蛋白质，羊毛的主体部分由皮质层组成，髓质层不存在于细羊毛中，只在粗羊毛的毛干中心呈现断续不透明状态。鳞片层主要由角质化的扁平状鳞片细胞相互排列重叠组成。鳞片细胞为扁平的片状结构，厚度约为0.5μm，鳞片细胞又分为外表皮层、次表皮层和内表皮层。鳞片细胞通过细胞间质(CMC)粘结形成整体，该层占羊毛纤维重量大约10％，虽然其所占比重不大，但对羊毛的主干部分起保护作用，阻碍各种化学试剂对羊毛的破坏。羊毛的皮质层占其重量近90％(粗羊毛含有髓质层)，是羊毛的主要结构，由平行于纤维轴向的纺锤形的皮质细胞通过细胞间质粘合而成。皮质细胞的直径一般为2-5μm，长度范围在100-200μm。皮质细胞之间、鳞片细胞与皮质细胞之间均通过细胞间质粘合构成羊毛整体，这些间质填充在细胞之间的空隙中，含量仅占总质量的3～5％，作为羊毛纤维中的连续组织，保障了其良好的物理机械性能。

通过可控地破坏细胞间质，即可分离得到所需的羊毛皮质细胞。然而由于细胞间质中胱氨酸二硫键结构稳定，且二硫键广泛地存在于皮质细胞内与细胞间质，定向去除细胞间质二硫键很难实现。因此，目前利用废弃羊毛的主要方法是通过溶解的方法提取羊毛角蛋白，而提取羊毛角蛋白的方法主要包括：

(1)还原法

还原法采用还原剂针对性地破坏羊毛中的二硫键。用于提取角蛋白的还原剂可分为有机还原剂与无机还原剂两种。有机还原剂比如巯基乙醇、L-半胱氨酸等，这类物质中含有还原性基团——巯基(-SH)，能够将二硫键还原为巯基，使疏水性的角蛋白降解成为可溶性的蛋白质；无机还原剂包括金属硫化物、亚硫酸盐、硫代硫酸盐等，但对环境污染大。

(2)氧化法

过氧化氢、过氧乙酸和卤素等氧化剂都能破坏二硫键，使胱氨酸结构转变为磺基丙氨酸基团，卤素在酸性条件下可破坏动物毛发中的大量胱氨酸，但由于其氧化性过强，容易破坏蛋白质大分子。

(3)生物法

利用蛋白酶催化作用的专一性使难溶性的角蛋白水解，得到可溶性的角蛋白，这种方法得到的角蛋白溶解性较好，但作用时间较长。

在天然和合成高分子材料中，羊毛纤维由于多空隙、多层次的复杂结构使得羊毛纤维具有很低的导热性能，即较高的隔热性能。以羊毛角蛋白制备多孔材料的研究很少。国内科研人员以提取出的人发纤维角蛋白为原料、以羟基磷灰石为增强体制备多孔角蛋白支架。日本学者将提取出的羊毛角蛋白水溶液冷冻，再冻干处理在－20℃条件下冷冻三天再冻干制备出羊毛角蛋白海绵。采用 SEM观察显示，羊毛角蛋白海绵具有均匀的多孔微观结构，孔隙大小在100um 左右。Kazunori Katoh等人将具有一定大小的氯化钠颗粒与羊毛角蛋白浇铸成型然后采用水洗的方法将氯化钠颗粒浸出制造具有受控孔径和孔隙率的角蛋白海绵材料。这些方法均以提取的羊毛角蛋白为原料，而这些角蛋白均以颗粒形式存在。

冷冻干燥技术能够使聚合物支架产生孔洞。冷冻干燥成型的原理是将含水物料降温到冰点以下，使水迅速转变为冰晶，冰晶占据皮质细胞之间的空隙，之后在较高真空度和低温下使冰晶升华挥发，而皮质细胞本身仍保持冻结时形成的结构，因而与直接热烘干燥相比，冷冻干燥成型的样品体积不变，且材料疏松多孔。

戊二醛(结构式如图2所示)是一种蛋白质交联剂，具有水溶性、双官能团、价格低廉等优点。同时，戊二醛也是高效消毒剂，具有广谱、高效、低毒、对金属腐蚀性小、受有机物影响小、稳定性好等特点，其灭菌浓度为2％。

随着环保意识的日渐增长和各种环境新标准的制订，人们更加注重对环境友好、可生物降解材料的研究与开发。聚乳酸(PLA)是重要的环境友好型高分子材料，具有优良的生物相容性、生物降解性和资源可再生性，在生物医学工程、涂料、薄膜、热塑材料、纺织、包装等领域都有巨大的市场，但左旋聚乳酸(PLLA)韧性和热稳定性差极大地限制了其应用。

羊毛纤维力学性能最大的特点是柔韧，羊毛纤维中皮质细胞是其良好力学性能的主要贡献者。但是羊毛纤维直径高达20μm，难以用于左旋聚乳酸薄膜的增韧。有些研究者采用取自羊毛纤维的角蛋白粉末增强聚乳酸薄膜。改性后的聚乳酸薄膜有些许增强，但断裂伸长反而降低，这是由于角蛋白微小的颗粒的原因。羊毛皮质细胞的直径一般为2-5μm，长度范围在100-200μm。基于羊毛角蛋白皮质细胞细长，制备过程温和，没有受到大的损伤，其柔韧的力学性能得到较好保持，因此采用羊毛角蛋白皮质细胞增强增韧聚乳酸薄膜，以解决左旋聚乳酸膜脆性大的问题，扩大其用途。

发明内容

本发明针对现有技术中提取羊毛角蛋白时存在的问题，采用物理与生物相结合的环保方法，提出了一种羊毛角蛋白皮质细胞的制备方法，制备得到的羊毛角蛋白皮质细胞可以用于制备保温、隔热、减震多孔材料，也可作为增强材料来制备聚乳酸复合膜。

本发明的技术方案：

一种羊毛角蛋白皮质细胞的制备方法，步骤如下：

步骤一、采用次氯酸钙/过氧化氢联合去除羊毛表面鳞片层：

(1)将羊毛浸渍在20-25℃的水中，固液比为1:20-25，把羊毛彻底浸湿，加入活性氯含量为70％的次氯酸钙Ca(ClO)₂·3H₂O，静置5-10分钟，得到体系A；其中次氯酸钙的添加量是羊毛质量的3-5％。

(2)向体系A中缓慢加入质量分数为30％的过氧化氢、作为过氧化物稳定剂的焦磷酸钠、作为过氧化物螯合剂的乙二胺四乙酸，形成体系B；在30-50℃的恒温条件下处理15-30分钟，使羊毛与次氯酸盐和过氧化物进行反应；其中，以体系A中溶液的体积计，质量分数为30％的过氧化氢的添加量为10-14ml/L，焦磷酸钠的添加量为1-2g/L，乙二胺四乙酸的添加量为1-2g/L。

(3)向体系B中添加亚硫酸钠和质量分数为88％的甲酸，再将pH值调整至3-4，在40-50℃的条件下处理10-20分钟，确保亚硫酸盐离子完全还原体系B 中的过氧化物，得到体系C；其中，亚硫酸钠的添加量是羊毛质量的4-7％，质量分数为88％的甲酸的添加量以体系B中溶液的体积计，为1-2ml/L。

(4)逐渐冷却体系C，将处理后的羊毛进行漂洗，并自然风干，得到去鳞片层羊毛样品。

步骤二、L-半胱氨酸/胰蛋白酶联合处理去鳞片层羊毛样品，定向去除细胞间质，分离皮质细胞，具体过程为：

将0.15-0.17mol/L的L-半胱氨酸溶液、去鳞片层羊毛样品和胰蛋白酶混合，形成体系D，在反应温度为30-40℃下，处理20-30h，确保去除细胞间质；其中，去鳞片层羊毛样品与溶液D的质量比为1:25-30，胰蛋白酶与去鳞片层羊毛样品的质量之比为1:10-15。

步骤三、对反应后的体系D进行超声波处理，分离皮质细胞，超声波处理的温度为50-70℃，超声功率400-500W，在工作2s，间隔2s的处理参数下处理20-40min。

步骤四、用120目分样筛网将超声波处理后的溶液进行过滤，去除羊毛纤维状杂质，收集得到滤液。

步骤五、采用孔径为0.45微米的滤膜，对收集的滤液进行抽滤，将固体和液体分离开，未能透过滤膜的固体成分即为羊毛角蛋白皮质细胞。

步骤六、将获得的羊毛角蛋白皮质细胞迅速放入-80℃低温烘箱中冷冻2-6h。

步骤七、将结冰的羊毛角蛋白皮质细胞进行真空冷冻干燥10-30h，得到最终的羊毛角蛋白皮质细胞。

一种基于羊毛角蛋白皮质细胞制备多孔材料的方法，该方法以羊毛角蛋白皮质细胞为原材料，以戊二醛为交联剂，通过冷冻、冻干、再交联的方法制备比表面积大、空隙率大的羊毛皮质细胞多孔材料，具体步骤如下：

步骤一、以羊毛角蛋白皮质细胞为原料，制备质量百分比为5-8％的皮质细胞水悬浮液；

步骤二、向皮质细胞水悬浮液中加入戊二醛，戊二醛在混合液中的质量为羊毛角蛋白皮质细胞质量的0.15％～1.5％，磁力搅拌10-40min，得到均匀的乳白色悬浮液；

步骤三、将乳白色悬浮液迅速放于-40℃下冷冻8-12h，之后进行真空冷冻干燥24-36h；

步骤四、将真空冷冻干燥后的样品置于160-180℃烘箱中焙烘1-2h，戊二醛与角蛋白发生交联，得到羊毛皮质细胞的多孔材料。

一种基于羊毛角蛋白皮质细胞制备增强增韧的左旋聚乳酸复合膜的方法，以羊毛角蛋白皮质细胞作为增强材料，以左旋聚乳酸(PLLA)为基体，制备聚乳酸复合膜，具体步骤如下：

步骤一、将左旋聚乳酸溶解于三氯甲烷中，制得质量分数为8-11％的左旋聚乳酸溶液；

步骤二、将羊毛角蛋白皮质细胞加入左旋聚乳酸溶液中，得到混合液，其中，羊毛角蛋白皮质细胞在混合液中的质量为左旋聚乳酸固体质量的2-4％；

步骤三、将混合液在常温下采用磁力搅拌器搅拌5-10h；

步骤四、铺膜：将搅拌均匀的混合液倒入成膜器，在室温下放置1-2天，自然成膜，得到皮质细胞增强增韧的左旋聚乳酸复合膜。

本发明的有益效果：

(1)先用次氯酸钙/过氧化氢预处理羊毛，剥除羊毛鳞片之后，用L-半胱氨酸还原剂/联合胰蛋白酶降解羊毛纤维细胞膜复合物，并采用超声波来进一步分离羊毛皮质细胞的方法是有效的、环境友好的。与其他方法相比，该方法作用缓和、对羊毛角蛋白细胞膜复合物定向降解作用强，不仅能高效分离出皮质细胞，而且所制备的皮质细胞没有受到明显损伤。

(2)与以提取的羊毛角蛋白粉末制备的多孔材料相比，本发明以简单的方法，制备出较大空隙的羊毛角蛋白皮质细胞多孔材料，可用于保温、隔热、减震等领域。

(3)本发明以生物基材料羊毛角蛋白皮质细胞为增强体，制备左旋聚乳酸复合膜，改善了其脆性，得到了全生物基的可降解复合膜，可用于包装等领域。

附图说明

图1为羊毛结构示意图。

图2为戊二醛的结构式。

图3为去除羊毛表面鳞片层前后羊毛纤维的SEM图，其中(a)为处理前， (b)为经过次氯酸钙/过氧化氢处理后。

图4为经过L-半胱氨酸/胰蛋白酶法处理之后，皮质细胞在40倍光学显微镜下的形貌，其中(a)为废弃粗羊毛；(b)为细羊毛。

图5为废弃粗羊毛和细羊毛皮质细胞SEM图，其中(a)为废弃粗羊毛皮质细胞按抽滤制得，(b)为细羊毛皮质细胞按高速离心制得。

图6为羊毛角蛋白多孔材料SEM图。

图7为不同戊二醛交联剂浓度的羊毛角蛋白多孔材料SEM图；其中(a)、 (b)、(c)分别为戊二醛交联剂浓度分别为0.15％、0.8％、1.5％时，低倍数 (<200倍)SEM图；(d)、(e)、(f)分别为戊二醛交联剂浓度分别为0.15％、 0.8％、1.5％时，高倍数(>1000倍)SEM图。

图8为戊二醛交联剂浓度为0.8％时，所制备的羊毛多孔材料纵、横截面SEM 图，其中(a)、(b)、(c)分别为100倍、400倍、1000倍的纵截面SEM图，(d)、 (e)、(f)分别为100倍、450倍、1000倍的横截面SEM图。

图9为羊毛角蛋白皮质细胞增强的聚乳酸复合膜光学显微镜照片，其中(a)、 (b)、(c)分别为不同放大倍数的2wt％皮质细胞增强的聚乳酸复合膜，(d)、(e)、 (f)分别为不同放大倍数的3wt％皮质细胞增强的聚乳酸复合膜，(g)、(i)、(h) 分别为不同放大倍数的4wt％皮质细胞增强的聚乳酸复合膜

图10为羊毛角蛋白皮质细胞增强的聚乳酸复合膜表面、断面SEM图，其中，(a)、(c)为纯聚乳酸膜表面；(b)、(d)分别为2wt％皮质细胞增强的聚乳酸复合膜表面，(e)为纯聚乳酸膜断面；(f)为2wt％皮质细胞增强的聚乳酸复合膜断面。

具体实施方式

下面将结合具体实施例和附图对本发明的技术方案进行进一步的说明。

实施例1：一种羊毛角蛋白皮质细胞的制备方法，步骤如下：

步骤一、采用次氯酸钙/过氧化氢联合去除羊毛表面鳞片层：

(1)将废弃粗羊毛浸渍在25℃的水中，固液比为1:25，把羊毛彻底浸湿，加入活性氯含量为70％的次氯酸钙Ca(ClO)₂·3H₂O，静置5分钟，得到体系A；其中次氯酸钙的添加量是羊毛质量的5％。

(2)向体系A中缓慢加入质量分数为30％过氧化氢、作为过氧化物稳定剂的焦磷酸钠、作为过氧化物螯合剂的乙二胺四乙酸，形成体系B；在50℃的恒温条件下处理20分钟，使羊毛与次氯酸盐和过氧化物进行反应；其中，以体系 A中溶液的体积计，质量分数为30％的过氧化氢的添加量为14ml/L，焦磷酸钠的添加量为2g/L，乙二胺四乙酸的添加量为2g/L。

(3)向体系B中添加亚硫酸钠和质量分数为88％的甲酸，再将pH值调整至3，在50℃的条件下处理10分钟，确保亚硫酸盐离子完全还原体系B中的过氧化物，得到体系C；其中，亚硫酸钠的添加量是羊毛质量的7％，质量分数为 88％的甲酸的添加量以体系B中溶液的体积计，为2ml/L。

(4)逐渐冷却体系C，将处理后的羊毛进行漂洗，并自然风干，得到去鳞片层羊毛样品。

步骤二、L-半胱氨酸/胰蛋白酶联合处理去鳞片层羊毛样品，定向去除细胞间质，分离皮质细胞，具体过程为：

将0.165mol/L的L-半胱氨酸溶液、去鳞片层羊毛样品和胰蛋白酶混合，形成体系D，在反应温度为37℃下，处理24h，确保去除细胞间质；其中，去鳞片层羊毛样品与溶液D的质量比为1:25，胰蛋白酶与去鳞片层羊毛样品的质量之比为1:10。

步骤三、对反应后的体系D进行超声波处理，分离皮质细胞，超声波处理的温度为70℃，超声功率500W，在工作2s，间隔2s的处理参数下处理40min。

步骤四、用120目分样筛网将超声波处理后的溶液进行过滤，去除羊毛纤维状杂质，收集得到滤液。

步骤五、采用孔径为0.45微米的滤膜，对收集的滤液进行抽滤，将固体和液体分离开，未能透过滤膜的固体成分即为羊毛角蛋白皮质细胞。

步骤六、将获得的羊毛角蛋白皮质细胞迅速放入-80℃低温烘箱中冷冻2h。

步骤七、将结冰的羊毛角蛋白皮质细胞进行真空冷冻干燥24h，得到最终的羊毛角蛋白皮质细胞。

实施例2：一种羊毛角蛋白皮质细胞的制备方法，步骤如下：

步骤一、采用次氯酸钙/过氧化氢联合去除羊毛表面鳞片层：

(1)将废弃细羊毛浸渍在20℃的水中，固液比为1:20，把羊毛彻底浸湿，加入活性氯含量为70％的次氯酸钙Ca(ClO)₂·3H₂O，静置5分钟，得到体系A；其中次氯酸钙的添加量是羊毛质量的3％。

(2)向体系A中缓慢加入质量分数为30％的过氧化氢、作为过氧化物稳定剂的焦磷酸钠、作为过氧化物螯合剂的乙二胺四乙酸，形成体系B；在30℃的恒温条件下处理20分钟，使羊毛与次氯酸盐和过氧化物进行反应；其中，以体系A中溶液的体积计，质量分数为30％的过氧化氢的添加量为10ml/L，焦磷酸钠的添加量为1g/L，乙二胺四乙酸的添加量为1g/L。

(3)向体系B中添加亚硫酸钠和质量分数为88％的甲酸，再将pH值调整至4，在50℃的条件下处理10分钟，确保亚硫酸盐离子完全还原体系B中的过氧化物，得到体系C；其中，亚硫酸钠的添加量是羊毛质量的4％，质量分数为 88％的甲酸的添加量以体系B中溶液的体积计，为1ml/L。

(4)逐渐冷却体系C，将处理后的羊毛进行漂洗，并自然风干，得到去鳞片层羊毛样品。

步骤二、L-半胱氨酸/胰蛋白酶联合处理去鳞片层羊毛样品，定向去除细胞间质，分离皮质细胞，具体过程为：

将0.165mol/L的L-半胱氨酸溶液、去鳞片层羊毛样品和胰蛋白酶混合，形成体系D，在反应温度为37℃下，处理24h，确保去除细胞间质；其中，去鳞片层羊毛样品与溶液D的质量比为1:25，胰蛋白酶与去鳞片层羊毛样品的质量之比为1:10。

步骤三、对反应后的体系D进行超声波处理，分离皮质细胞，超声波处理的温度为50℃，超声功率400W，在工作2s，间隔2s的处理参数下处理30min。

步骤四、用120目分样筛网将超声波处理后的溶液进行过滤，去除羊毛纤维状杂质，收集得到滤液。

步骤五、采用孔径为0.45微米的滤膜，对收集的滤液进行抽滤，将固体和液体分离开，未能透过滤膜的固体成分即为羊毛角蛋白皮质细胞。

步骤六、将获得的羊毛角蛋白皮质细胞迅速放入-80℃低温烘箱中冷冻4h。

步骤七、将结冰的羊毛角蛋白皮质细胞进行真空冷冻干燥30h，得到最终的羊毛角蛋白皮质细胞。

使用胰蛋白酶作为降解细胞间质是有较多优势的。一是由于酶从溶液到羊毛纤维的扩散可以通过控制酶作用时间来控制降解的程度，以达到羊毛纤维的断裂破坏与皮质细胞的分离；二是作为一种环境友好型的生物制剂，天然蛋白酶对人体和环境的危害都很小，只需经过灭活处理即可保证安全。当胰蛋白酶扩散到细胞之间的膜中时，能迅速破坏细胞间质，以完成对皮质细胞间黏连物质的去除，实现完整皮质细胞的分离。

使用L-半胱氨酸作为还原剂去除细胞间质二硫键具有较多优点：L-半胱氨酸是具有还原性的天然氨基酸，含有的巯基(-SH)能够打开蛋白质内部的二硫键；L-半胱氨酸没有毒性，反应环境与条件都较为温和，与巯基乙醇等相比对环境和人体的危害都大大降低；L-半胱氨酸的还原效率高。

对于细胞间质已被定向降解的羊毛，利用超声波的空化作用，进一步分离羊毛皮质细胞。超声波通过水介质产生空化效应，当气泡破裂时在羊毛表面会产生剧烈的压力(约103巴)，增强了皮质细胞的分离。同时，这种破坏增加了皮质细胞的运动、水介质和皮质细胞之间的接触，这些都有助于皮质细胞的分离。

对于实施例1和实施例2的实验结果进行以下分析：

图3为采用次氯酸钙/过氧化氢联合去除羊毛表面鳞片层前后羊毛纤维的 SEM。可以看出，处理前的羊毛表面有着明显的鳞片层，处理后的羊毛表面已几乎看不到鳞片层，皮质层暴露在表面。

废弃粗羊毛经处理后皮质细胞制成率为30.4％，细羊毛制成率为56.1g。废弃粗羊毛皮质细胞有着淡淡的红色，而细羊毛皮质细胞是纯白色的。

经光学显微镜观察：经过L-半胱氨酸/胰蛋白酶法处理之后，获得的固体成分由光学显微镜观察得到的形貌如图4所示。皮质细胞在显微镜下的形态呈现的是梭状，图4(a)废弃粗羊毛皮质细胞与图4(b)细羊毛皮质细胞相比而言，细羊毛皮质细胞要比废弃羊毛的透明一些，表面光滑一点。使用 NIS-ElementsD3.1对载玻片上的皮质细胞进行测量，可得废弃粗羊毛皮质细胞的平均长度为82微米左右，平均直径为7微米左右；细羊毛皮质细胞的平均长度为113微米左右，平均直径为5微米左右。

经扫描电镜(SEM)观察：废弃粗羊毛和细羊毛皮质细胞在扫描电镜下的形貌如图5所示。从图5(a)和图5(b)两张图相比可以看出废弃粗羊毛获取的皮质细胞非常干净，而细羊毛获取的皮质细胞中的杂质非常多，无法做到干净分离。由此可以看出使用高速离心机分离皮质细胞是无法干净的分离皮质细胞，会有很多的杂质在里面。而使用抽滤的方法分离皮质细胞，就能够提取出干净率较高的皮质细胞，并且产率也有了提高。采用L-半胱氨酸/胰蛋白酶法处理羊毛，L-半胱氨酸中的疏基(-SH)能够打开细胞质间质中的二硫键，它是天然的氨基酸没有毒性，对于环境的危害极小且还原率很高。而胰蛋白酶作用于细胞间质CMC，既环保又专一。采用这样的方法能够非常有效的分离和提取出羊毛皮质细胞。

综上所述，先用次氯酸钙/过氧化氢预处理羊毛，剥除羊毛鳞片之后，用L- 半胱氨酸作还原剂，胰蛋白酶催化及CMC降解羊毛纤维，来分离羊毛皮质细胞的方法是最为有效的，获得的粗、细羊毛皮质细胞区别总结如下表1所示。

表1粗、细羊毛中制备的皮质细胞的区别

实施例3：一种基于羊毛角蛋白皮质细胞制备多孔材料的方法，具体步骤如下：

步骤一、以羊毛角蛋白皮质细胞为原料，制备质量百分比为5％的皮质细胞水悬浮液；

步骤二、向皮质细胞水悬浮液中加入戊二醛，戊二醛在混合液中的质量分别为羊毛角蛋白皮质细胞质量的0.15％、0.8％和1.5％，磁力搅拌10min，得到三种均匀的乳白色悬浮液；

步骤三、将乳白色悬浮液迅速放于-40℃下冷冻10h，之后进行真空冷冻干燥36h；

步骤四、将真空冷冻干燥后的样品置于180℃烘箱中焙烘2h，角蛋白与戊二醛交联，得到三种羊毛皮质细胞的多孔材料。

对于实施例3的实验结果进行以下分析：

实验得到的羊毛皮质细胞多孔材料外观类似海绵，图6羊毛角蛋白多孔材料SEM图，表明材料表面有清晰可见的孔隙。将该成型材料静置于去离子水中， 2h后该材料仍然保持着原有的形态，表明皮质细胞已通过交联剂的作用成型为一个整体的多孔材料。

由图7可以看出，所有成型材料的孔隙均较为明显，且随着所用交联剂浓度的提升，材料的孔隙越来越细小、致密。观察图7(a)-(c)图的边缘，发现随着交联剂浓度的上升，所得材料的边缘更加平整光滑，产生的碎屑也减少，成型效果更好。用手对三个样品施加较小的纵向压力时，图7(a)组材料立刻破碎成柔软的絮状碎片，图7(b)与(c)组材料则表现出不同程度的塌陷，图 7(b)组能够回弹至原有的形状，图7(c)组在短时间内没有明显的回弹现象，维持塌陷的状态。该现象表明尽管材料成型，但对于0.15％交联剂浓度形成的材料，在轻微的外界物理作用下即发生破坏，其内部结构仍然较为松散，内部的交联程度和化学作用力仍然较小，难以维持基本形态。对于1.5％交联剂浓度制备的多孔材料所表现出的塑性，说明尽管交联剂用量增大能增加皮质细胞之间的交联，但大量的交联也会导致制备的多孔材料表现出较差的柔韧性。

对比0.15％(图7(a))与0.8％(图7(b))可明显发现，交联剂用量的增加使皮质细胞之间的交联连接更加丰富，形成的孔隙更多为立体结构。在7(a) 图中，孔隙的形成分布主要是在同一平面的细胞相互堆叠过程中交错形成的孔隙，皮质细胞之间较为松散，并未形成比较丰富的交联；图7(b)中的孔隙多为立体锥形结构，皮质细胞之间的连接较为充分，只在边缘处有部分游离或未产生交联的皮质细胞。对比0.8％(图7(b))与1.5％(图7(c))可发现，1.5％浓度下的多孔材料也显示较为丰富的立体孔隙结构，但其孔隙的数量与0.8％相比并未有较大的改善，且随着交联剂用量的增加，孔隙减小。

对于皮质细胞制备海绵时孔径大小的变化，原因是由于交联剂浓度升高，皮质细胞之间交联程度增加，导致细胞之间可容纳的冰晶数量增加，但冰晶存在的空间大小被挤压，冷冻干燥后形成的孔隙也较小。由于皮质细胞以悬浮的形式存在于溶液中，与可溶性角蛋白不同，冷冻时皮质细胞均沉淀在容器底部，因而形成的孔隙部分依赖于热流上升填充形成的冰晶，而大部分的孔隙则依赖于交联剂作用后细胞之间的孔隙结构和数量。

图7(d)-(f)对比了在较大放大倍数下、不同戊二醛浓度所形成的材料的具体孔隙组成结构。戊二醛浓度为0.15％(图7(d))所形成的孔隙大多数以不同长度皮质细胞之间的搭接排列形成的。戊二醛浓度为0.8％所形成的孔隙则以皮质细胞之间的交联为主，图7(b)显示的大量三角棱状结构形成的立体空隙，每个皮质细胞都与多个其他细胞产生了交联或缠结，图7(e)显示了更为细微的皮质细胞连接方式，三个皮质细胞的尾端在中央连接在一起，而另一端又与更多其他皮质细胞的端部相连接。

将戊二醛浓度为0.8％制备的多孔材料在液氮中进行脆断处理，获取完整的材料截面，置于扫描电镜下观察。图8(a)-(c)显示了多孔材料的纵截面形态。图8(a)展示了较小放大倍数下材料纵截面的皮质细胞分层结构，同一层之间的皮质细胞连接较为紧密，不同层之间穿插着纵向的皮质细胞连接两层；图8(b)、(c)展示了较大倍数下皮质细胞之间的连接方式，可能的情况有：(1) 下层的皮质细胞与上层细胞通过戊二醛交联；(2)下层的皮质细胞缠结在上层细胞的形成的孔隙之中。多孔材料分层的原因可能是由于在冷冻过程中具有相似尺寸和密度的皮质细胞在磁力搅拌时分布于同一水平面，在快速放置于超低温环境中后被冻结在同一平面而形成分层结构。

图8(d)-(f)显示了多孔材料的横截面形态。图8(d)展示了较小放大倍数下材料横截面的状态，由于纵向的分层结构导致横截面观察时纵向细胞的层层叠加导致观察不到明显的孔隙，但从中仍能看出大量存在的三角锥型细胞连接；图8(e)、(f)展示了较大倍数下单一孔隙的形成状态，五根皮质细胞连接在一起形成五边形的孔隙，其中(f)图更加清晰的表现出皮质细胞之间的交联。

实施例4：一种基于羊毛角蛋白皮质细胞制备增强增韧的左旋聚乳酸复合膜的方法，具体步骤如下：

步骤一、将左旋聚乳酸溶解于三氯甲烷中，制得质量分数为10％的聚乳酸溶液；

步骤二、将不同质量百分比的羊毛角蛋白皮质细胞加入左旋聚乳酸溶液中，得到混合液，其中，不同质量百分比的羊毛角蛋白皮质细胞在混合液中的质量分别为左旋聚乳酸固体质量的2％、3％、4％；步骤三、将混合液在在常温下采用磁力搅拌器搅拌10h；

步骤四、铺膜：将混合液倒入成膜器，在室温下放置2天，自然成膜，得到皮质细胞增强增韧的左旋聚乳酸复合膜。

将三种含量不同的皮质细胞增强的聚乳酸复合膜放在光学显微镜下观察，如图9所示。可以看出皮质细胞以伸直的状态均匀分布在聚乳酸基体中，随着皮质细胞质量比的增加，皮质细胞在膜中分布依然均匀。

纯聚乳酸膜和2wt％皮质细胞增强的聚乳酸复合膜的表面和截面扫描电镜图如图10所示。图10(a)和(c)中表明纯聚乳酸膜表面光滑，而图10(b) 和(d)中的复合膜比纯聚乳酸膜表面粗糙度增加，图10(e)和(f)表明纯聚乳酸膜、2wt％皮质细胞增强的聚乳酸复合膜断面均没有空隙出现，表明皮质细胞与聚乳酸基质材料相容性均较好。

羊毛角蛋白皮质细胞增强的聚乳酸复合膜拉伸力学性能见表2，可以看出，与纯聚乳酸相比，羊毛角蛋白皮质细胞增强的聚乳酸复合膜断裂强度由24.1MPa 提高到28MPa，提高15％以上，断裂伸长率由2.1％提高到3.5％以上，提高66％，初始模量由1147MPa降低到767MPa，降低30％以上。这些力学性能的变化表明羊毛角蛋白皮质细胞有助于聚乳酸膜增强增韧。

表2羊毛角蛋白皮质细胞增强的聚乳酸复合膜拉伸力学性能

皮质细胞含量/％	断裂强度(MPa)	断裂伸长率(％)	初始模量(MPa)
				0	24.1	2.10	1147
2	28.0	3.65	767
				3	28.4	3.52	806
4	28.9	3.60	802

Claims (1)

1.一种基于羊毛角蛋白皮质细胞制备增强增韧的左旋聚乳酸复合膜的方法，以羊毛角蛋白皮质细胞作为增强材料，以左旋聚乳酸为基体，制备聚乳酸复合膜，其特征在于，步骤如下：

步骤一、将左旋聚乳酸溶解于三氯甲烷中，制得质量分数为8-11％的左旋聚乳酸溶液；

步骤二、将羊毛角蛋白皮质细胞加入左旋聚乳酸溶液中，得到混合液，其中，羊毛角蛋白皮质细胞在混合液中的质量为左旋聚乳酸固体质量的2-4％；

步骤三、将混合液在常温下采用磁力搅拌器搅拌5-10h；

步骤四、铺膜：将搅拌均匀的混合液倒入成膜器，在室温下放置1-2天，自然成膜，得到皮质细胞增强增韧的左旋聚乳酸复合膜。

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