CN109197589A - 一种改良的固体培养基制备方法 - Google Patents

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吴照祥
刘腾云
余发新
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    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H4/00—Plant reproduction by tissue culture techniques ; Tissue culture techniques therefor
    • A01H4/001—Culture apparatus for tissue culture

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Abstract

本发明提供了一种改良的固体培养基制备方法，属于植物组织培养技术领域。本发明所述方法包括以下步骤：1)将大量元素、微量元素、铁盐、植物激素和水混合后，得水溶性培养液；2)将植物凝胶、蔗糖、肌醇与水混合溶解后，得有机培养液；3)将所述水溶性培养液与所述有机培养液按照体积比为1：(1.2～3.5)混合，调节pH，得液体培养基；4)将步骤3)得到的所述液体培养基均匀分配至培养容器中，灭菌后冷却得固体培养基；步骤1)与步骤2)之间不存在时间上的先后关系。本发明所述方法打破了传统植物凝胶先高温溶解，再与激素等混合，高温分装的培养基制备模式，本发明先分装后高温灭菌，操作简单，避免高温分装，效率较高。

Description

一种改良的固体培养基制备方法
技术领域
本发明属于植物组织培养技术领域，具体涉及一种改良的固体培养基制备方法。
背景技术
随着植物组织培养技术的发展，越来越多的生物利用组织培养技术开展大规模的育种工作，但是植物组织培养需要适宜的营养和生长条件，才能使植物细胞进行正常的分化和生长。而培养基则是给植物细胞提供养分的场所。培养基包括大量元素、微量元素、铁盐及螯合剂、糖和琼脂。以目前最常用的培养基MS培养基为例，在配置时需要分步配制母液，如将已添加其他物质的琼脂等植物凝胶营养液先加热溶解，溶解后倾倒或分装到培养容器中，再高温灭菌，步骤繁琐，费时费力。还有其他的配制方法如将高温灭菌后培养基溶液倾倒或分装到培养容器中，存在高温作业和培养基被污染的问题。而商业化的MS培养基，则价格较贵，不利于规模化组培育苗使用。目前并没有一种方便简单且安全无污染的固体培养基制备方法。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于一种改良的固体培养基制备方法，操作简单，避免高温分装，效率较高。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种改良的固体培养基制备方法，包括以下步骤：
1)将大量元素、微量元素、铁盐、植物激素和水混合后，得水溶性培养液；
2)将植物凝胶、蔗糖、肌醇与水混合溶解后，得有机培养液；
3)将步骤1)得到的所述水溶性培养液与步骤2)得到的所述有机培养液按照体积比为1：(1.2～3.5)混合，调节pH，得液体培养基；
4)将步骤3)得到的所述液体培养基均匀分配至培养容器中，灭菌后冷却得固体培养基；步骤1)与步骤2)之间不存在时间上的先后关系。
优选的，步骤1)所述混合为搅拌混合，所述搅拌混合的转速为80～150rpm，所述搅拌混合的时间为3～8min。
优选的，步骤2)所述混合为搅拌混合，所述搅拌混合的转速为120～200rpm。
优选的，步骤3)所述混合为搅拌混合，所述搅拌混合的转速为120～200rpm，所述搅拌的时间为1～5min。
优选的，步骤3)所述调节pH后还包括以10～30rpm的转速持续搅拌混合。
优选的，步骤4)所述灭菌包括高温灭菌。
优选的，所述高温灭菌的温度为121℃，所述高温灭菌的时间为20min。
本发明提供了一种改良的固体培养基制备方法，将水溶性培养液与有机培养液混合后，添加植物凝胶，利用植物凝胶特性使其混合液凝固，从而形成固体培养基，打破了植物凝胶高温溶解混合再高温灭菌后分装的培养基制备模式，从而先分装后高温灭菌，操作简单，避免高温分装，效率较高。
附图说明
图1为分液装置。
具体实施方式
本发明提供了一种改良的固体培养基制备方法，包括以下步骤：
1)将大量元素、微量元素、铁盐、植物激素和水混合后，得水溶性培养液；
2)将植物凝胶、蔗糖、肌醇与水混合溶解后，得有机培养液；
3)将步骤1)得到的所述水溶性培养液与步骤2)得到的所述有机培养液按照体积比为1：(1.2～3.5)混合，调节pH，得液体培养基；
4)将步骤3)得到的所述液体培养基均匀分配至培养容器中，灭菌后冷却得固体培养基；步骤1)与步骤2)之间不存在时间上的先后关系。
在本发明所述改良的固体培养基制备方法中，将大量元素、微量元素、铁盐、植物激素和水混合后，得水溶性培养液。如在本发明实施例中，改良MS培养基的制备方法，不改变大量元素、微量元素、铁盐和植物激素的含量比，按MS培养基配方中原料溶于水后和植物激素如6-BA或NAA混合。本发明所述混合优选为搅拌混合，所述搅拌的转速优选为80～150rpm，更优选为90～120rpm，最优选为100rpm。本发明所述搅拌的时间为优选为3～8min，更优选为4～6min，最优选为5min。
在本发明所述改良的固体培养基制备方法中，将植物凝胶、蔗糖、肌醇与水混合溶解后，得有机培养液。在本发明实施例中，当所述固体培养基为MS固体培养基时，将植物凝胶、蔗糖40g/L和肌醇0.05g/L逐一加入搅拌容器中与水混合。本发明所述混合优选为搅拌混合，所述搅拌的转速优选为120～200rpm，更优选为135～180rpm，最优选为150rpm。本发明对所述搅拌的时间并没有特殊限定，将所述植物凝胶、蔗糖和肌醇溶解即可。本发明所述植物凝胶优选包括：卡拉胶和琼脂。
得水溶性培养液和有机培养液后，本发明将所述水溶性培养液与所述有机培养液按照体积比为1：(1.2～3.5)混合，调节pH，得液体培养基。本发明所述水溶性培养液与所述有机培养液按照体积比优选为1：(1.5～3)，更优选为1：(1.8～2.5)，最优选为1:2。本发明在所述混合后优选还包括稀释和搅拌，所述稀释的倍数优选为2倍。本发明所述搅拌的速度优选为120～200rpm，更优选为135～180rpm，最优选为150rpm。本发明所述搅拌的时间优选为1～5min，更优选为1.5～3min，最优选为2min。本发明对所述调节pH的方法并没有特殊限定，优选调节pH至5.8～6.0即可。本发明在所述调节pH后优选还包括以10～30rpm的转速持续搅拌，使调节pH后的培养液不发生沉淀。
得液体培养基后，本发明将所述液体培养基均匀分配至培养容器中，灭菌后冷却得固体培养基。本发明所述液体培养基优选在如图1所示分液器上进行分液，每个培养容器中优选分配20～40mL液体培养基。本发明所述培养容器优选包括液体培养基分装小瓶。本发明所述分液器优选包括：手动定量分液器和液体培养基搅拌容器，所述液体培养基搅拌容器与所述手动定量分液器联结在一起。本发明所述分液器优选置于磁力搅拌器上，通过磁力搅拌器的作用使所述液体培养基搅拌容器一直搅拌，并通过手动定量分液器的精准控制，平均分配到液体培养基分装小瓶中。本发明所述灭菌优选包括高温灭菌，所述高温灭菌的温度优选为121℃。本发明所述高温灭菌的时间优选为20min。
下面结合实施例对本发明提供的改良的固体培养基制备方法进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
按照MS培养基配方，将其与植物激素如6-BA或NAA加入到500mL无菌水烧杯中；
在1000mL无菌水中，分别加入浓度为8g/L的植物组培用卡拉胶、40g/L的蔗糖和0.05g/L的肌醇，常温下以转速100rpm转每分在磁力搅拌器上搅拌5分钟；
将两种溶液混合后，定容至3000mL，常温下以转速150rpm在磁力搅拌器上搅拌2分钟；
氢氧化钠溶液调节培养基溶液pH值至5.8～6.0；
将分液器将装入搅拌容器上，常温下调节转速至30rpm在磁力搅拌器上搅拌。用分液器将正在搅拌容器中搅拌均匀培养基溶液以40mL的量精准分装到培养基瓶中。
将已分装好培养基瓶盖好瓶盖，放入121℃高压灭菌锅灭菌20min。
灭菌后取出冷却凝固，植物固体培养基便可用于植物组培接种。
本方法比传统卡拉胶等植物凝胶先高温热溶解后再添加植物激素配制方法节约30～50％的时间，培养基能够精确分装。适合MS培养基为基础培养基的植物组培。避免热溶解倾倒培养基浪费，节约用电成本。
实施例2
将购买的M519(1/2(MS+维生素)复合配方培养基，购自https://phytotechlab.com)按照配方与其植物激素如6-BA或NAA加入到500mL无菌水烧杯中；
在1000mL无菌水中，分别加入浓度为6.0g/L的琼脂、40g/L的蔗糖和0.02g/L的肌醇，常温下以转速150rpm转每分在磁力搅拌器上搅拌5分钟；
将两种溶液混合后，定容至3000mL，常温下以转速200rpm在磁力搅拌器上搅拌2分钟；
氢氧化钠溶液调节培养基溶液pH值至5.9～6.0；
将分液器将装入搅拌容器上，常温下调节转速至40rpm在磁力搅拌器上搅拌。用分液器将正在搅拌容器中搅拌均匀培养基溶液以30mL的量精准分装到培养基瓶中。
将已分装好培养基瓶盖好瓶盖，放入121℃高压灭菌锅灭菌20min。
灭菌后取出冷却凝固，植物固体培养基便可用于植物组培接种。
本方法比传统琼脂等植物凝胶先高温热溶解后再添加植物激素配制方法节约30～50％的时间，培养基能够精确分装。同时也适合1/2MS培养基为基础培养基的植物组培。避免热溶解倾倒培养基浪费，节约用电成本。
实施例3
1/4MS基本培养基，与其植物激素如TDZ或6BA加入到500mL无菌水烧杯中；
在1000mL无菌水中，分别加入浓度为1.5g/L的植物组培用结冷胶、40g/L的蔗糖和0.01g/L的肌醇，常温下以转速120rpm转每分在磁力搅拌器上搅拌5分钟；
将两种溶液混合后，定容至3000mL，常温下以转速180rpm在磁力搅拌器上搅拌2分钟；
氢氧化钠溶液调节培养基溶液pH值至5.9～6.0；
将分液器将装入搅拌容器上，常温下调节转速至35rpm在磁力搅拌器上搅拌。用分液器将正在搅拌容器中搅拌均匀培养基溶液以35mL的量精准分装到培养基瓶中。
将已分装好培养基瓶盖好瓶盖，放入121℃高压灭菌锅灭菌20min。
灭菌后取出冷却凝固，植物固体培养基便可用于植物组培接种。本方法比传统结冷胶等植物凝胶先高温热溶解后再添加植物激素配制方法节约30～50％的时间，培养基能够精确分装。同时也适合1/4MS培养基为基础培养基的植物组培。避免热溶解倾倒培养基浪费，节约用电成本。
综上所述，本发明提供了一种改良的固体培养基制备方法，打破了传统植物凝胶先高温热溶解，再与激素等混合，最后高温灭菌后分装的培养基制备模式，从而先分装后高温灭菌，操作简单，避免高温分装，效率较高。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (7)

1.一种改良的固体培养基制备方法，包括以下步骤：
1)将大量元素、微量元素、铁盐、植物激素和水混合后，得水溶性培养液；
2)将植物凝胶、蔗糖、肌醇与水混合溶解后，得有机培养液；
3)将步骤1)得到的所述水溶性培养液与步骤2)得到的所述有机培养液按照体积比为1：(1.2～3.5)混合，调节pH，得液体培养基；
4)将步骤3)得到的所述液体培养基均匀分配至培养容器中，灭菌后冷却得固体培养基；步骤1)与步骤2)之间不存在时间上的先后关系。
2.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，步骤1)所述混合为搅拌混合，所述搅拌混合的转速为80～150rpm，所述搅拌混合的时间为3～8min。
3.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，步骤2)所述混合为搅拌混合，所述搅拌混合的转速为120～200rpm。
4.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，步骤3)所述混合为搅拌混合，所述搅拌混合的转速为120～200rpm，所述搅拌混合的时间为1～5min。
5.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，步骤3)所述调节pH后还包括以10～30rpm的转速持续搅拌。
6.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，步骤4)所述灭菌为高温灭菌。
7.根据权利要求6所述制备方法，其特征在于，所述高温灭菌的温度为121℃，所述高温灭菌的时间为20min。
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